專(zhuān)利名稱(chēng):2-芳基丙酸的制備方法
本發(fā)明闡述了一個(gè)制備有生物活性的立體專(zhuān)一形式的通式為
的化合物或其鹽或酯的方法，如它的堿金屬鹽，堿土金屬鹽，其中R代表一個(gè)任意取代的芳基如苯基或萘基，它們被包括在任意的雜環(huán)系統(tǒng);R1還表示一個(gè)任意取代的芳雜環(huán)系統(tǒng)，環(huán)中除碳原子外還可選擇一個(gè)或更多個(gè)雜原子如氮、硫和氧。
大家知道很多有生物活性的化合物是以立體異構(gòu)體混合物形式存在的，這些混合物至今還常被用于農(nóng)業(yè)或藥物上，通常對(duì)映異構(gòu)體中只有一個(gè)異構(gòu)體有生物活性，所以它的消旋體的活性強(qiáng)度就會(huì)減半，應(yīng)用消旋體的一個(gè)主要的原因是分離消旋體的代價(jià)大于活性增強(qiáng)可能提供的好處，然而很明顯的一點(diǎn)就是現(xiàn)代藥理學(xué)家越來(lái)越意識(shí)到以混旋體給藥，其中某種立體異構(gòu)體必須看作是雜質(zhì)，它可能沒(méi)有所需的治療作用，甚至?xí)幸恍┎恍枰纳碜饔冒▽?duì)機(jī)體的毒性。
更具體些，發(fā)現(xiàn)萘普生和布洛芬的體內(nèi)抗炎活性的主要活性形式是S-型異構(gòu)體(光學(xué)活性的異構(gòu)體)，它的活性是其對(duì)映體的150倍，由S.Adams et al，J.pharm.Pharmae.28(1976).256以及A.
J.Hutt和J.Caldwell，Cliaical Pharmacokinetecs 9(1984).371等報(bào)道。
S.Iriuchiuima和A.Keiyu[Agrie.Biol.Chem。，45(1981)1389]報(bào)道選擇一些微生物可水解萘普生和酮基布洛芬的甲酯，但很少改變它的構(gòu)型。醬油曲霉菌(Aspergillus soje)主要水解R-構(gòu)型的萘普生的甲酯，產(chǎn)生95%(重量比)的R-構(gòu)型萘普生，而包皮垢分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis)主要水解S-酮基布洛芬的甲酯產(chǎn)生69%(重量比)的S-構(gòu)型酮基布洛芬。
德國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)DE3345660描述了從消旋的萘普生的酯制備S-萘普生的方法，然而這個(gè)申請(qǐng)中的S-萘普生也不是直接由消旋的萘普生酯生成的，而是通過(guò)皂化或用酶水解S-萘普生的酯而得到的，這個(gè)S-萘普生的酯原來(lái)留在用酶水解R-萘普生酯且產(chǎn)生的R-萘普生被S-萘普生酯分離后的反應(yīng)混合物中。
近期的文獻(xiàn)(QU-Ming et al.，Tetrahedron Letters，Vol.27，no.16(1986)P.17-63)報(bào)道了一個(gè)用一種酵母菌(Candida cylindracea)的酶制備法，它能立體選擇地水解S-萘普生酯，作者說(shuō)明它們制備的念珠脂酶可以水解萘普生酯，然而，純凈的脂酶的活性是非常低的(在它們實(shí)驗(yàn)的具體條件下每毫克脂酶在每分鐘內(nèi)水解3×10摩爾酯)。
所以目前仍非常需要一個(gè)適合工業(yè)規(guī)模的，產(chǎn)率高的直接制備S-立體異構(gòu)體的方法，本發(fā)明的目的就是提供一個(gè)這樣的方法?；趶V泛的研究和實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了一種改進(jìn)的選擇合成法，用于制備化合物(Ⅰ)的S-立體異構(gòu)體，它是通過(guò)微生物或從它來(lái)的化合物的作用，使通式為的化合物進(jìn)行立體選擇地水解為化合物(Ⅰ)，通式(Ⅱ)中R1如前所定，R2為酯的一部分，宜為任意的烷基。產(chǎn)物中S-異構(gòu)體至少占80%(重量比)，根據(jù)制劑需要，可將化合物(Ⅰ)制成它的鹽或酯。
更具體地說(shuō)，本專(zhuān)利是有關(guān)一個(gè)生產(chǎn)有生物活性的立體專(zhuān)一的S-構(gòu)型的化合物(Ⅰ)或它的適合制劑的鹽或酯的方法，最好是堿金屬鹽和堿土金屬鹽。(Ⅰ)式中R1是一個(gè)任意取代的芳基如苯基或萘基，取代基可包括一個(gè)任意取代的雜環(huán)系統(tǒng)，或者R1可代表一個(gè)任意取代的芳雜環(huán)，除了碳原子以外還可選擇一個(gè)或更多的雜原子如氮，硫和氧。通式(Ⅱ)中R2為任意取代的烷基，化合物(Ⅱ)受到微生物的作用，進(jìn)行立體選擇性的水解，生成立體專(zhuān)一性的化合物(Ⅰ)。
R2最好為1到8個(gè)碳的直鏈烷基，尤其是R2為甲基或乙基。
化合物(Ⅰ)最好為萘普生，布洛芬，噻丙吩、苯氧苯丙酸、酮布洛芬、苯惡丙酚、卡巴唑丙酸(Carprofen)、丙酸、吡丙芬，里西丙芬(isiprofenum)、氟聯(lián)苯丙酸、氟苯丙酸(fluprofen)、克利得納(Clidanac)叔丙吩(tertiprofen)己基苯丙酸(hexaprofen)、茚酮苯丙酸、甲氧基苯丙酸(mexoprofen)、吡喃苯丙酸(pranoprofen)、R803、吩噻嗪丙酸、酮基噻丙酸(fiaprofenic acid)或布魯潘齊(brofezil)按照本專(zhuān)利提供的方法，最好的情況是S-構(gòu)型占優(yōu)勢(shì)的萘普生制備。
根據(jù)上述這些有利的情況，通過(guò)選擇合適的微生物或從它們得到的物質(zhì)完成了這一方法，生成的化合物(Ⅰ)至少90%(重量比)是S-構(gòu)型的。
本發(fā)明的另一個(gè)目的提供一個(gè)酶;活性至少比上述提到的那種酵母菌脂酶高10倍，較好的情況下可高100倍。
本發(fā)明的再一個(gè)目的就是提供一個(gè)制備至少有80%R-構(gòu)型的化合物(Ⅰ)的方法，按照發(fā)明中的方法，將S-型化合物(Ⅰ)分離后，水解余下的部分即得。
“合適的微生物”是指一些屬于桿菌屬(Bacillus)假單胞菌屬(Pseudomonas)，關(guān)節(jié)芽胞桿菌屬(Arehrobactev，毛霉菌屬(mucor)或鏈霉菌屬(Streptomyces)的一些微生物。
通過(guò)引入新的遺傳物質(zhì)而具有立體選擇性地水解化合物(Ⅱ)到化合物(Ⅰ)能力的微生物也包括在“合適的微生物”之內(nèi)。
上述說(shuō)的方法就是具有立體選擇水解之類(lèi)的某些經(jīng)過(guò)篩選的微生物的酯酶的克隆基因，轉(zhuǎn)移到另一個(gè)微生物內(nèi)，通常是轉(zhuǎn)移到大腸桿菌(Escherichia Coli)內(nèi)，其它微生物可屬于酵母菌屬(Saccharomyces)，克魯維酵母屬(Kluyvenomyces)，曲霉菌屬(Aspergillus)，艾歇利烯菌屬(Escherichia)，假單胞菌屬(Pseudomonas)和鏈霉菌屬(Streptomyces)?？寺』虻倪x擇是根據(jù)它們能表達(dá)一個(gè)水解β-萘乙酸酯和萘普生酯的酶。或選擇與業(yè)經(jīng)選擇的表達(dá)酯酶的基因進(jìn)行交叉雜化的基因。后一個(gè)設(shè)想基于下列實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象在有關(guān)的微生物中，表達(dá)相應(yīng)的酶的DNA序列顯示一致性(Ihara et al.，1985，J.Beochem.98，P.95)以及我們實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)體pNAPT-7(見(jiàn)例11)和從其它的桿菌得到的染色體DNA有交叉雜化作用。除此之外，本發(fā)明還提供了一個(gè)往微生物內(nèi)植入表達(dá)酯酶的多重的和/或經(jīng)修飾的基因片段的方法，它可以使微生物或從它得到的物質(zhì)在轉(zhuǎn)化化合物(Ⅱ)的化合物(Ⅰ)的過(guò)程中活性提高。這個(gè)微生物可以是例如枯草桿菌(Bacillus subtilis)。
這些微生物可用聚合物的凝膠等物質(zhì)來(lái)固定，這時(shí)可以以活的細(xì)胞和/或殺死的細(xì)胞的形式進(jìn)行固定，而用微生物的酯酶時(shí)，可根據(jù)對(duì)活性的需要進(jìn)行某種程度的純化。
所以，“微生物或從它們得到的物質(zhì)”是指活的或殺死的微生物，從它們得到的提取物，可以是濃縮的或純化的。
更具體地說(shuō)，適用于水解萘普生的甲酯和乙酯[分別為2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸甲酯和2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸乙酯]為S-型萘基普生[2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸]及水解布洛芬的甲酯和乙酯[分別為2-(4-異丁基-1-苯基)丙酸甲酯和2-(4-異丁基-1-萘基)丙酸乙酯]為S-型布洛芬[2-(4-異丁基-1-苯基)丙酸]微生物有枯草桿菌(Bacillus subtili))，苔狀桿菌(Bacillus ticheniformis)樣品儲(chǔ)存在ATCC，登記號(hào)11945);熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)，惡臭假單胞菌(Pseudomonas Putida)，(樣品儲(chǔ)存在IFO.登記號(hào)12996);核黃素假單胞菌(Pseudomonas riboflavina)(樣品儲(chǔ)存在IFO，登記號(hào)13584);卵狀假單胞菌(Pseudomones ovalis)(樣品儲(chǔ)存在IAM.登記號(hào)1049);銅綠假單胞菌(綠膿桿菌)(Pseudomonas aeruginosa)(樣品儲(chǔ)存在IFO，登記號(hào)13130);多棱大孢子毛霉菌Mulor augulimaero sporus(樣品儲(chǔ)存在IAM，登記號(hào)6149);石蠟關(guān)節(jié)芽胞桿菌(Arthoobacter Paraffmeus)(樣品儲(chǔ)存在ATCC.登記號(hào)21218);菌株為Ⅲ-25(樣品儲(chǔ)存在CBS.登記號(hào)666.86);菌株LK3-4(樣品儲(chǔ)存在CBS.登記號(hào)667.86);菌株SP4(樣品儲(chǔ)存在CBS，登記號(hào)668.86);菌株Thai Ⅲ18-1(樣品儲(chǔ)存在CBS，登記號(hào)669.86)和菌株Thai Ⅵ 12(樣品儲(chǔ)存在CBS，登記號(hào)670.86)。在枯草桿菌中，較好的菌種是桿菌Thai 1-8(樣品儲(chǔ)存在CBS.登記號(hào)679.85)，桿菌ⅠnⅠv-8(樣品儲(chǔ)存在CBS，登記號(hào)680.85)，桿菌Nap 10-M(樣品儲(chǔ)存在CBS.登記號(hào)805.85)，桿菌spⅢ-4(樣品儲(chǔ)存在CBS，登記號(hào)806.85)，枯草桿菌1-85(Yuki，S.，1967，Jpn.J.Genet.42.P251)，枯草桿菌1-85/pNAPT-7(樣品儲(chǔ)存在CBS，登記號(hào)673.86)，枯草桿菌1A-40/pNAPT-8(樣品儲(chǔ)存在CBS，登記號(hào)674.86)和枯草桿菌1A-40/pNAPT-7(樣品儲(chǔ)存在CBS，登記號(hào)675.86)。熒光假單胞菌中較好的是假單胞KorⅠ-6(樣品儲(chǔ)存在CBS登記號(hào)807.85)和熒光假單胞菌(樣品儲(chǔ)存在IFO，登記號(hào)3081)。
ATCC美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)CBS荷蘭真菌菌種收藏中心IFO日本發(fā)酵研究所(大阪)IAM東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所。在本發(fā)明較佳的制備實(shí)施方法中，微生物能夠?qū)⒒衔?Ⅱ)轉(zhuǎn)變?yōu)榛衔?Ⅰ)，其中S構(gòu)型至少占80%(重量比)，微生物必須經(jīng)過(guò)大約0.5到10天的培養(yǎng)。然后，懸浮于液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的細(xì)胞作用于化合物(Ⅱ);或者將細(xì)胞殺死，如將其懸浮于使細(xì)胞溶解的介質(zhì)上，讓從這些細(xì)胞中抽提出的物質(zhì)作用于化合物(Ⅱ)。
上述提到的微生物培養(yǎng)0.5到10天后，在將它們懸浮于液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基或細(xì)胞溶解培養(yǎng)基之前，可首先從培養(yǎng)它的培養(yǎng)基中分離出來(lái)。
在培養(yǎng)用于選擇性水解化合物(Ⅱ)的微生物時(shí)，采用一般的培養(yǎng)基，其中含有可被同化的碳源(如葡萄糖，乳酸鹽，蔗糖等)，氮源(如硫酸銨，硝酸銨，氯化銨等)，一個(gè)能提供有機(jī)營(yíng)養(yǎng)源的物質(zhì)(如酵母抽提物，麥芽提取物，陳，肉類(lèi)抽提物等)和一個(gè)無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)源(如痕跡量的磷酸鹽，鎂、鉀、鋅，鐵及其它金屬)。
Jap培養(yǎng)基是一個(gè)較好的培養(yǎng)基，它可任意地加入一種或幾種成分作為營(yíng)養(yǎng)?？刹捎煤邢铝谐煞值腏ap培養(yǎng)基大豆粉(30克/升)，硝酸鈉(7.5克/升)，七水硫酸亞鐵(0.28克/升)，枸椽酸鈉(6克/升)和果糖12.5克/升)，PH值調(diào)至7.2。培養(yǎng)基在使用前在120℃消毒20分鐘。
另一個(gè)較好的培養(yǎng)基是TSB-medium 2X，可任意加入一種或幾種物質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)，可以選用含60克/升胰蛋酶大豆肉湯(OXoid
)培養(yǎng)基，使用前于120℃消毒20分鐘。另一個(gè)較好的培養(yǎng)基是2XTY，可任意地加入一種或幾種物質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)，如可選用含下列成分的培養(yǎng)基;胰(蛋白)胨(Difco
)30克/升，酵母抽提物(Difco
)20克/升，氯化鈉3克/升，(NH4)2HPO41克/升和(NH4)2SO41克/升，PH為6.8，培養(yǎng)基在使用前于110℃消毒30分鐘。更好的培養(yǎng)基是脫酯乳培養(yǎng)基，它可加入一種或幾種物質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中采用的脫酯乳含下列成份由脫酯奶粉制成的10%的脫酯乳，它在使用前于110℃消毒30分鐘。
作為脫酯乳培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可加入0.5%的乳酸鹽或PSⅠⅠⅠ鹽或同時(shí)合并加入。實(shí)驗(yàn)中曾用了含下列成分的PSⅠⅠⅠ鹽培養(yǎng)基磷酸二氫鉀(2.1克/升)，磷酸氫二銨(1.0克/升)，硫酸銨(0.9克/升)，氯化鉀(0.2克/升)，枸椽酸鈉(0.29克/升)，二水硫酸鈣(0.005克/升)，七水硫酸鎂(0.2克/升)，六水硫酸亞鐵銨(2.5毫克/升)，七水硫酸鋅(0.5毫克/升)，四水氯化錳(0.3毫克/升)，五水硫酸銅(0.15毫克/升)，六水氯化鈷(0.15毫克/升)，原硼酸(0.05毫克/升)，二水鉬酸鈉(0.055毫克/升)和碘化鉀(0.1毫克/升)，PH調(diào)至6.8，使用前PSⅠⅠⅠ培養(yǎng)基在120℃滅菌20分鐘。
在微生物生長(zhǎng)的過(guò)程中溫度保持在0到45℃之間，PH保持在3.5到9之間，較適宜微生物生長(zhǎng)的溫度是20到37℃，PH為5到9。
微生物生長(zhǎng)過(guò)程中按照一些現(xiàn)成的方法提供一個(gè)較好的通氣條件，這樣可提供充足的氧以滿(mǎn)足微生物代謝的需要。最簡(jiǎn)單的方法是供給氧氣，一般以空氣的形式，也可以同時(shí)振搖或攪拌反應(yīng)液。在轉(zhuǎn)變化合物(Ⅱ)到化合物(Ⅰ)的過(guò)程中，微生物可以處在生長(zhǎng)階段(用上述提到的普通培養(yǎng)基)，也可以保存在能防止酶的降解的體系(培養(yǎng)基或緩沖液)中。
在將化合物(Ⅱ)轉(zhuǎn)變?yōu)榛衔?Ⅰ)的過(guò)程中，可采用普通的培養(yǎng)基，當(dāng)需要時(shí)加入可同化的碳源(如葡萄糖，乳酸鹽，蔗糖等)，氮源(如硫酸銨，硝酸銨，氯化銨等)，有機(jī)營(yíng)養(yǎng)源(如酵母抽提物，麥芽抽提物，胨，肉類(lèi)抽提物等)，無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)源(如痕跡量的磷酸鹽，鎂，鉀，鋅，鐵和其它金屬)。
在轉(zhuǎn)變化合物(Ⅱ)到化合物(Ⅰ)的過(guò)程中，較好的培養(yǎng)基為Jap培養(yǎng)基(如上所述)，可以加入一種或幾種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。更好的培養(yǎng)基是脫酯乳培養(yǎng)基(如上所述)，可以加入一種或幾種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
微生物可以保持在一個(gè)非生長(zhǎng)狀態(tài)，例如通過(guò)除去可同化的碳源或氮源。在這一階段溫度保持在0到45℃，PH保持在3.5到9之間。
較好的情況是將微生物保存在溫度20到37℃，PH在5到8之間。這一階段所需的通氣條件可通過(guò)一個(gè)現(xiàn)成的方法達(dá)到，它可提供氧以滿(mǎn)足微生物代謝的需要，最簡(jiǎn)便的方法是供給氧氣，通常以空氣的形式，也可以同時(shí)振搖或攪拌反應(yīng)液，由這些微生物或由它們而來(lái)的物質(zhì)產(chǎn)生出來(lái)的化合物(Ⅰ)可按這類(lèi)產(chǎn)品已知的方法得到和精制。
這些微生物可保存在瓊脂上，在50%的甘油中冷凍或真空冷凍。若需要的話(huà)，這些微生物可按一些現(xiàn)成的方法進(jìn)行預(yù)先培養(yǎng)，如在一個(gè)旋轉(zhuǎn)振蕩器上將微生物在肉湯或BHI中在30℃培養(yǎng)24小時(shí)?？刹捎煤邢铝谐煞值娜鉁囵B(yǎng)基Lab Lemco L29(肉的抽提物，Oxoid
)(9克/升)，Bactopepton(10克/升)和氯化鈉(5克/升)，PH調(diào)到7.6。使用前培養(yǎng)基在120℃滅菌20分鐘。
BHI(腦心浸液)培養(yǎng)基含有0.037克/升BHI(Oxoid
)，PH值調(diào)到7.0。培養(yǎng)基在使用前在120℃滅菌20分鐘。
對(duì)桿菌Thai 1-8的水解s-萘普生甲酯的酶進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)酯酶的活性與微生物體內(nèi)脂酶的活性無(wú)關(guān)。實(shí)際上，少量的構(gòu)型錯(cuò)誤的萘普生的水解似乎主要是由于桿菌菌株持有脂酶活性。被純化的桿菌Thai 1-8的萘普生酯酶具有比桿菌的細(xì)胞溶解液高得多的對(duì)映體選擇性。
大腸桿菌/PNAPT-7(E.coli/PNAPT-7)和桿菌/PNAPT-7(Bacillus/PNAPT-7)，這兩個(gè)菌株都有一個(gè)含有桿菌ThaiⅠ-8酯酶質(zhì)體，都能產(chǎn)生可觀量的S-型萘普生酯酶。令人奇怪的是，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE，HPLC-SEC和等電點(diǎn)聚焦法證實(shí)，具有酯酶活性的蛋白質(zhì)遠(yuǎn)不是微生物細(xì)胞溶解液中濃度最高的蛋白質(zhì)。雖然已經(jīng)知道植入新的基因可改善酶的表達(dá)水平，但該酯酶增加的程度是令人吃驚的。在植入表達(dá)酶的基因時(shí)經(jīng)常遇到很多問(wèn)題，如不正確的折疊，蛋白質(zhì)降解和細(xì)胞內(nèi)沉淀等(Harris，T，J.R.，1983Genetic Engineering 4.Academic Press)。出乎意料的是在植入酯酶基因時(shí)似乎未發(fā)生這類(lèi)問(wèn)題。
在本書(shū)中s-立體專(zhuān)一性定義為(生成的)S(生成的)R+(生成的)S本專(zhuān)利的通過(guò)下列一些例子作一些進(jìn)一步的說(shuō)明，但本專(zhuān)利的范圍不局限于這些例子。
例1微生物法使消旋的萘普生乙酯轉(zhuǎn)變?yōu)镾-型萘普生[用桿菌ThaiⅠ-8、桿菌Ⅰn.Ⅰv-8、桿菌Nap 10M、桿菌spⅢ-4、苔狀桿菌(ATCC11945)和假單胞菌KorⅠ-6]桿菌ThaiⅠ-8、桿菌ⅠnⅠv-8、桿菌Nap 10M、桿菌spⅢ-4、苔狀桿菌(ATCC 11945)和假單胞菌KorⅠ-6分別置于500毫升的有擋板的燒瓶加25毫升10%的脫酯乳，在旋轉(zhuǎn)振蕩器上30℃培養(yǎng)48小時(shí)，在該生長(zhǎng)期后，將100毫克萘普生乙酯溶于500毫克的豆油中，在110℃滅菌一小時(shí)后加到培養(yǎng)物中去。取決于微生物，需要2到5個(gè)培養(yǎng)物。培養(yǎng)物在旋轉(zhuǎn)振蕩器上于30℃再培養(yǎng)24小時(shí)，然后，用磷酸酸化培養(yǎng)基到PH值2至3，加入少量的硫酸銨，每25毫升培養(yǎng)基加入20毫升氯仿或者乙酸乙酯進(jìn)行提取。提取液用薄層層析(TLC)分析，TLC硅膠板(硅膠60，F(xiàn)254熒光指示)用氯仿加1%的冰乙酸展開(kāi)，使萘普生乙酯和萘普生能夠分開(kāi)。萘普生乙酯的Rf值為0.7，萘普生的Rf值為0.2。之后蒸發(fā)有機(jī)相，所得油狀物上硅膠柱、用醚洗脫得純的萘普生。結(jié)果列于表1中。
旋光用Perkin-Elmer141旋光儀在1或10厘米長(zhǎng)(體積0.5或5毫升)的腔內(nèi)于室溫下測(cè)定，旋光值是在589nm(鈉D線(xiàn))下測(cè)得的。
測(cè)定旋光值時(shí)將產(chǎn)物(最多50毫克)溶于5毫升甲醇。商品s-萘普生(商品名secifarma)的旋光值｜α｜rtD為+60°。
表1微生物水解2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸乙酯成為2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸，將底物轉(zhuǎn)變?yōu)楣鈱W(xué)活性產(chǎn)物。
微生物所加酯的總量培養(yǎng)后回收得到的 ｜α｜rtD(mg) 的酯量(mg) 萘普生(mg)桿菌 ThaiⅠ-8 400 n.d.＊ 23＊＊ +57°桿菌 Ⅰn Ⅳ-8 500 210 75 +60°苔狀桿菌 200 53 32 +52°(ATCC 11845)桿菌 SpⅢ-4 400 n.d.＊ 33＊＊ +37°桿菌Nap 10M 200 110 30 +44°假單胞菌KorⅠ-6 200 93 25 +43°＊ n.d.-未測(cè)定＊＊分離后所剩的量例2由微生物水解得到的萘普生中R.S.對(duì)映體的分布如例1中所述，所有試驗(yàn)是在100ml有檔板的燒瓶中25ml的培養(yǎng)基上進(jìn)行的。所有的培養(yǎng)基都是用在BHI培養(yǎng)基上預(yù)生長(zhǎng)24小時(shí)后的培養(yǎng)物接種的。
投入溶于豆油的大約20mg的消旋的萘普生乙酯，在1小時(shí)和24小時(shí)進(jìn)行分析。
提取物用HPLC分析，酯和酸用硅膠柱(CP-Sper-si，Chrompack)分開(kāi)。流動(dòng)相異辛烷/乙酸乙酯/甲酸(875ml/125ml/3.5ml)。流速1.7ml/min。保留時(shí)間萘普生乙酯Rt＝3.8分鐘。萘普生Rt＝9.0分鐘。
為測(cè)定它的對(duì)映體的純度，對(duì)萘普生樣品經(jīng)衍生化，成為萘甲酰胺衍生物，它們可通過(guò)DNBPG手性柱得到分離，洗脫劑異辛烷/氯仿/甲醇(900ml/70ml/30ml);流速2ml/min。
衍生化的S-萘普生和R-萘普生的保留時(shí)間分別為28.1分鐘和30.7分鐘。
衍生化的步驟將2ml提取液在氮?dú)饬飨赂稍铮稍锖蟮臉悠泛?00μl苯及10μl二氯亞砜在60℃反應(yīng)10分鐘，反應(yīng)混合物在氮?dú)饬飨赂稍铮尤?00μl5%的萘甲基胺的干燥二氯甲烷溶液，反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1小時(shí)。反應(yīng)混合物再次在氮?dú)饬飨赂稍铮缓笥?ml的異辛烷/氯仿(2∶1體積比)和2ml 1N的鹽酸進(jìn)行提取，有機(jī)相用HPLC分析，結(jié)果列于表2。
表2微生物水解得到的萘普生的R.S.對(duì)映體的分布微生物 培養(yǎng)周期 生成的 生成的 S-萘普 R-萘(小時(shí)) S-萘 R-萘 生 普生普生 普生 % %(mg/培 (mg/培養(yǎng)基) 養(yǎng)基)桿菌ThaiⅠ-8 1 1.26 0.014 99 124 7.14 0.59 92 8桿菌 ⅠnⅣ-8 1 0.48 0.008 98 224 4.18 0.40 91 9苔狀桿菌 1 0.28 0.014 95 5(ATCC 11945) 24 4.76 0.086 98 2假單胞菌KorⅠ-6 24 2.8 0.07 98 2桿菌 Nap 10M 24 1.3 0.01 99 1桿菌 SpⅢ-4 24 2.5 0.3 89 11
例3.
用不同的微生物轉(zhuǎn)變消旋的萘普生甲酯為S-萘普生。
象例1和例2描述的那樣，所有的測(cè)定在100ml檔板燒瓶中的25ml培養(yǎng)基上進(jìn)行，但往培養(yǎng)基內(nèi)加入的不是消旋的萘普生乙酯，而是消旋的萘普生甲酯。培養(yǎng)基是從已在BHI培養(yǎng)基上生長(zhǎng)24小時(shí)的培養(yǎng)物接種的。
結(jié)果列在表3表3微生物 生成的萘普生 S% R%(mg/培養(yǎng)基)桿菌ThaiⅠ-8 6.9 96 4桿菌 ⅠnⅣ-8 2.0 90 10苔狀桿菌 8.6 98 2(ATCC 11845)桿菌Nap 10M 3.2 99 1桿菌 SpⅢ-4 5.8 82 18
例4用桿菌ThaiⅠ-8，桿菌ⅠnⅣ-8和苔狀桿菌(ATCC11945)轉(zhuǎn)變S-萘普生乙酯為S-萘普生。
所有的測(cè)定象例1中一樣都是在100ml檔板的燒瓶中25ml的培養(yǎng)基上進(jìn)行的，所有的培養(yǎng)基都是從已在BHI培養(yǎng)基上生長(zhǎng)了24小時(shí)的培養(yǎng)物接種的。
被水解的S-萘普生乙酯的量列在表4表4在加入PSⅢ和乳酸鹽的脫脂乳培養(yǎng)基上24小時(shí)內(nèi)被水解的S-萘普生的量。
微生物 24小時(shí)后剩余的酯 生成的萘普生(mg)＊(mg)桿菌ThaiⅠ-8 7.9 18.6桿菌 ⅠnⅣ-8 15.0 10.5苔狀桿菌 11.6 10.2(ATCC 11945)＊每25ml培養(yǎng)基加入大約30mg的酯例5在發(fā)酵器中生長(zhǎng)的桿菌ThaiⅠ-8轉(zhuǎn)化消旋的萘普生乙酯為S-萘普生。
桿菌ThaiⅠ-8預(yù)先在BHI培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長(zhǎng)24小時(shí)，之后移植50ml培養(yǎng)液到10升的Eschweilen發(fā)酵器中，其中含有10%的脫脂乳培養(yǎng)基或加入PSⅢ鹽和5克/升乳酸鹽的10%的脫脂乳培養(yǎng)基。
所用的發(fā)酵條件是體積5升培養(yǎng)基溫度30℃攪拌速度500轉(zhuǎn)/分空氣流速50升/小時(shí)消沫劑自動(dòng)滴加消沫劑Pluronic L81.
PH不調(diào)節(jié)(PH值在6到9之間自由變動(dòng))。
微生物在發(fā)酵器內(nèi)生長(zhǎng)70小時(shí)，在此期間取幾次樣品，檢測(cè)它們對(duì)萘普生乙酯的反應(yīng)活性。檢測(cè)的方法是取25ml樣品在檔板燒瓶中于30℃培養(yǎng)1小時(shí)，加入溶于豆油的20mg消旋萘普生乙酯，培養(yǎng)完成后進(jìn)行提取，衍生化，用HPLC分析結(jié)果。
24小時(shí)以后，微生物的干重和它的單位體積的活性不再發(fā)生變化。培養(yǎng)液為脫脂乳時(shí)PH值從6.0上升到7.8，當(dāng)培養(yǎng)液為加營(yíng)養(yǎng)的脫脂乳時(shí)PH值從6.0上升到8.4。
結(jié)果總結(jié)在表5。
表5桿菌ThaiⅠ-8分別用脫脂乳和加營(yíng)養(yǎng)的脫脂乳培養(yǎng)時(shí)發(fā)酵的結(jié)果脫脂乳作為培養(yǎng)液 加入PSⅢ和乳酸鹽的脫脂乳作為培養(yǎng)液干重 1.2～1.3克/升 2.5～2.6克/升單位體積的活性 形成30mg萘普生/升/小時(shí) 形成53mg萘普生/升/小時(shí)對(duì)映體分布 96% S，4% R 91% S，9% R例6在發(fā)酵器中生長(zhǎng)的桿菌ⅠnⅣ-8轉(zhuǎn)化消旋的萘普生乙酯為S-萘普生。
桿菌 ⅠnⅣ-8以例5中相同的步驟處理，在70小時(shí)的培養(yǎng)過(guò)程中取樣，分析，辦法同前，發(fā)現(xiàn)干重和單位體積的活性在此過(guò)程中絲毫不發(fā)生變化。用脫脂乳作培養(yǎng)基時(shí)，其PH值從6.4升到7.9，當(dāng)用加營(yíng)養(yǎng)的脫脂乳作培養(yǎng)基時(shí)，其PH值從6.2上升到8.4。
結(jié)果總結(jié)在表6中。
表6桿菌 ⅠnⅣ-8分別用脫脂乳和加營(yíng)養(yǎng)的脫脂乳培養(yǎng)基時(shí)的發(fā)酵結(jié)果脫脂乳作為培養(yǎng)液 加入PSⅢ和乳酸鹽的脫脂乳作為培養(yǎng)基干重 0.7克/升 2.5克/升單位體積的活性 形成10mg萘普生/升/小時(shí) 形成25mg萘普生/升/小時(shí)對(duì)映體分布 94% S，6% R 未測(cè)例7用不同的微生物將消旋的布洛芬乙酯轉(zhuǎn)化為S-布洛芬象例1和例2中那樣，所有的實(shí)驗(yàn)是在100～500ml的檔板燒瓶的25～100ml的培養(yǎng)基中進(jìn)行的。培養(yǎng)基是從預(yù)先已在營(yíng)養(yǎng)豐富的復(fù)合培養(yǎng)基(如BHI.)生長(zhǎng)24小時(shí)的培養(yǎng)基中接種，再生長(zhǎng)48小時(shí)。根據(jù)培養(yǎng)基的體積，加入20或80μl的消旋布洛芬乙酯，培養(yǎng)24小時(shí)。
往培養(yǎng)基中加入少量的硫酸銨，用H3PO4酸化到PH2.5，加CH2Cl2提取，提取液中的布洛芬轉(zhuǎn)變?yōu)檩良谆返孽０费苌?，以便測(cè)定它的光學(xué)純度。
往3ml提取液中加入200μl碘化2-溴-1-甲基吡啶的二甲基甲酰胺溶液(50mg/ml)和200μl 1-萘甲基胺的CH2Cl2溶液(100mg/ml)，在22℃反應(yīng)5分鐘，反應(yīng)混合物在氮?dú)饬飨掠?0℃干燥，將殘余物溶于異辛烷/CH2Cl2(2∶1體積比)中，加入2ml 1N的硫酸后進(jìn)行提取。
有機(jī)相用HPLC分析，選用DNBPG手性柱，洗脫劑用異辛烷/異丙醇/甲醇(97/2/1，體積比)或當(dāng)有雜質(zhì)干擾時(shí)可選用異辛烷/異丙醇/甲醇(98/1/1，體積比)。
結(jié)果列于表7。
表7微生物 形成的布洛芬 % S % R 培養(yǎng)基體(mg/培養(yǎng)基) 積(ml)Arthrobacter Paraffineus。 9.8 85 15 25ATCC21218苔狀桿菌＊ 0.8 99 1 25ATCC11945枯草桿菌ⅠnⅣ-8＊ 0.4 89 11 25CBS 680.85枯草桿菌Nap 10M 1.4 92 8 25CBS 805.85枯草桿菌SpⅢ-4 4.2 88 12 25CBS 806.86枯草桿菌ThaiⅠ-8 4.3 96 4 25CBS 679.85Mucor angwlimacrosporus 4.3 96 4 25IAM 6149綠膿桿菌 5.5 81 9 25IFO 13130熒光假單胞菌 3.4 ≥95 ≤5 25IFO 3081熒光假單胞菌KorⅠ-6 3.9 94 6 100CBS 807.85
卵狀假單胞菌 1.6 98 2 100IAM 1049惡臭假單胞菌 1.6 ≥95 ≤5 25IFO 12996核黃素假單胞菌 0.7 98 2 100IFO 13584黃微綠鏈霉菌 0.6 ≥95 ≤5 25IFO 3412菌株 isⅢ-25 1.0 82 18 100CBS 666.86菌株 LK3-4 0.4 ≥95 ≤5 25CBS 667.86菌株 Sp4 0.9 95 5 25CBS 668.86菌株 ThaiⅢ 18-1 7.0 87 13 25CBS 669.86菌株 ThaiⅥ 12 8.6 97 3 25CBS 670.86[注]表中給出的值都是同時(shí)做兩份實(shí)驗(yàn)得出的平均值，微生物后標(biāo)有“＊”號(hào)的只是一份實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。這種情況只向培養(yǎng)基中加入10μl布洛芬的50μl正十四烷溶液。
例8用不同的微生物將消旋的布洛芬甲酯轉(zhuǎn)化為S-布洛芬所有的步驟與例7相同，只是用消旋的布洛芬甲酯代替例7中消旋的布洛芬乙酯加到培養(yǎng)基中去。
結(jié)果列于表8。
表8微生物 生成的布洛芬 S% R% 培養(yǎng)基體(mg/培養(yǎng)基) 積(ml)Arthrobacter Paraffineus 9.1 87 13 25ATCC21218苔狀桿菌＊ 1.5 99 1 25ATCC11945枯草桿菌ⅠnⅣ-8＊ 0.5 90 10 25CBS 680.85枯草桿菌Nap 10-M 2.2 93 7 25CBS 805.85枯草桿菌SpⅢ-4 5.5 89 11 25CBS 806.86枯草桿菌 ThaiⅠ-8 5.7 97 3 25CBS 679.85
Mucor angwlimacrosporus 6.1 93 7 25IAM 6149熒光假單胞菌 3.1 93 7 25IFO 3081惡臭假單胞菌 0.7 ≥95 ≤5 25IFO 12996核黃素假單胞菌 1.3 88 12 25IFO 13584黃微綠鏈霉菌 0.2 ≥95 ≤5 25IFO 3412菌株 LK3-4 0.2 ≥95 ≤5 25CBS 667.86菌株 ThaiⅢ 18-1 3.1 88 12 25CBS 669.86菌株 ThaiⅥ 12 4.0 ≥93 ≤7 25CBS 670.86[注]表中給出的值都是同時(shí)做兩份實(shí)驗(yàn)得出的平均值，微生物后標(biāo)有“＊”號(hào)的只是一份實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，這種情況只向培養(yǎng)基中加入10μl布洛芬的50μl正十四烷溶液。
例9枯草桿菌ThaiⅠ-8(CBS679.85)的萘普生甲酯酶的研究桿菌ThaiⅠ-8在含10%的脫脂乳的Eschweiler發(fā)酵器中發(fā)酵生長(zhǎng)。
生長(zhǎng)28小時(shí)后，離心收集細(xì)胞、將細(xì)胞溶解在PH為8.0的0.1M Tris-HCl溶液中，用溶菌酶(0.5mg/ml溶菌酶，4mg/ml EDTA)處理，室溫放置18小時(shí)后，用DN′ase(0.01mg/ml DN′ase，3.5mg/ml MgCl2)在同樣溫度下處理一小時(shí)。
離心后，上清液的旦白質(zhì)部分用70%的飽和硫酸銨沉淀，離心后將沉淀溶于0.01M MOPS(3-(N-嗎啉啉)丙磺酸)PH為7.5的緩沖液，它與含有0.02% Na N3(作為防腐劑)的同樣的緩沖液進(jìn)行透析18小時(shí)。
最后的溶液用HPLC-SEC(排阻色譜)的制備柱(TSK2000SW，600×21.5mm)來(lái)分析。洗脫劑用PH為5.5的0.1M醋酸鈉溶液，流速6ml/分鐘每隔10分鐘收集2ml柱子的組分用來(lái)檢測(cè)脂酶和S-萘普生甲酯酶的活性。
脂酶的活性是在PH為7.5的0.1M MOPS溶液中以1mg/ml的月桂酸對(duì)硝基苯酯為底物測(cè)得的。和對(duì)硝基苯酚的形成相應(yīng)，脂酶的活性可在405納米處測(cè)得。
S-萘普生甲酯酶的活性是在PH為8.0的0.1M MOPS溶液中，以20mg/ml的S-萘普生甲酯作底物測(cè)得的，培養(yǎng)18小時(shí)后，用例2中的方法用HPLC測(cè)定形成的S-萘普生的量。
圖1畫(huà)出了桿菌ThaiⅠ-8的細(xì)胞溶解液中HPLC-SEC中出現(xiàn)的峰。這一微生物中S-萘普生甲酯酶(組分37)可以和脂酶(組分31)很好地分開(kāi)。
表9比較了細(xì)胞溶解液、組分31和38的對(duì)映體選擇性。
作用于R和S-萘普生甲酯的酯酶活性用上述的方法測(cè)定。
有S-萘普生酯酶活性的旦白質(zhì)的表觀分子量用分子量已知的旦白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)為27000。
在測(cè)定條件下S-萘普生甲酯水解對(duì)PH的依賴(lài)性見(jiàn)圖2，使用的緩沖液為0.1M磷酸溶液(PH5.5～7.5)，0.1M Tris-HCl(PH7.5～9.0)和0.1M甘氨酸(PH9.0～10.0)。
溫度對(duì)酯酶反應(yīng)的影響見(jiàn)圖3。
溫度在45℃以上，幾乎沒(méi)有酶水解反應(yīng)發(fā)生。37℃時(shí)的水解速度大約比25℃時(shí)高兩倍。
表9酶活性 從S-酯生成 從R-酯生成 S-專(zhuān)一性的S-萘普生 的R-萘普生 (%)(mM) (mM)細(xì)胞溶解液 2.891 0.087 97.1組分31 “脂酶” 0.090 0.119 43.1組分38 “脂酶” 5.264 0.064 98.8
例10有關(guān)立體選擇地轉(zhuǎn)化R-S萘普生酯的基因的分子克隆繁殖一個(gè)含有枯草桿菌ThaiⅠ-8(CBS 679.85)染色體DNA片段的質(zhì)體PNAPT-2按下述方法制得。
采用基因移植的通用的方法(見(jiàn)T.Maniatis等人的手冊(cè)，Molecular Cloning，1982，Could Spring Harbour Laboratory.)，所有的DNA修飾酶都是從市場(chǎng)上買(mǎi)到的商品，使用時(shí)參考生產(chǎn)商的說(shuō)明。用于DNA分離和純制的試劑和儀器在使用時(shí)都參考生產(chǎn)商的說(shuō)明。
實(shí)驗(yàn)中采用了正性選擇載體 PUN 121(Nilsson等人，1983，Nucleic Acids Res.11.P8019)。這一載體載有氨芐青霉素抗性基因，四環(huán)素抗性基因和C1-阻遏基因。C1-阻遏基因的基因產(chǎn)物可防止四環(huán)素基因的轉(zhuǎn)錄，往C1-阻遏基因的BCL1部位插入外界的DNA可導(dǎo)致四環(huán)素基因的活化。這就使氨芐青霉素/四環(huán)素瓊脂上重組物的陽(yáng)性選擇成為可能。
將部分Sau3 A水解的枯草桿菌ThaiⅠ-8 DNA與BCl 1水解的PUN 121 DNA混合。使用多聚核苷酸連接酶使其重新環(huán)化，之后用CaCl2轉(zhuǎn)移步驟(見(jiàn)T.Maniatis等人的手冊(cè)，1980)將DNA混合物引入到大腸桿菌DH1(ATCC33849)中。
得到了1000個(gè)耐氨芐青霉素和耐四環(huán)素的菌落，所有的轉(zhuǎn)化細(xì)胞被儲(chǔ)存起來(lái)，菌落按J.P.Gergen等人的方法(Nucleic Acids Res.7.P.2115.1979)進(jìn)行平板影印培養(yǎng)，平板影印培養(yǎng)出的菌落基于上述測(cè)定酯酶活性的步驟，用軟瓊脂重疊技術(shù)進(jìn)行篩選。(T.B.Higerd和J.Spizizen.1973，J.Bacteriol.114，P.1184)。將0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖，0.5M磷酸鉀(PH7.5)，0.5mg/l β-萘乙酸和0.5mg/ml速蘭(fast-blue)的混合物鋪展在轉(zhuǎn)化細(xì)胞上，幾分鐘后，有酯酶或脂酶活性的菌落變?yōu)樽仙＿@些菌落在ZXYT培養(yǎng)基(16g/升細(xì)菌用胰化胨。10g/升酵母抽提物，5g/升氯化鈉)中培養(yǎng)過(guò)夜。隨后測(cè)定它們轉(zhuǎn)化S-萘普生酯到S-萘普生的活性(例1中的方法)。一種大腸桿菌的轉(zhuǎn)化細(xì)胞可轉(zhuǎn)化S-萘普生酯，從中分離出的質(zhì)體稱(chēng)為pNAPT-2，圖4繪出了它的結(jié)構(gòu)，其大小為9.4kb。
表10列出了在zxYT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一夜后大腸桿菌/pNAPT-2和大腸桿菌/pNAPT-7(按例12的方法測(cè)定)。只有質(zhì)體PUN 121的大腸桿菌不能水解S或R-萘普生酯，這證明水解S-萘普生酯需要的信息在插入的5kb枯草桿菌ThaiⅠ-8 DNA片段上。
帶有質(zhì)體pNAPT-2的大腸桿菌DH1的樣品儲(chǔ)存在CBS，登記號(hào)671.86。
表10活性 S-專(zhuān)-性(單位/升) (%)大腸桿菌/PUN 121 0 -大腸桿菌/pNAPT-2 45 ＞95大腸桿菌/pNAPT-7 761 99.4
例11引入枯草桿菌的多重基因提高酯酶的活性表達(dá)酯酶密碼的質(zhì)體pNAPT-2帶有一個(gè)插入的5kb的枯草桿菌ThaiⅠ-8(CBS 679.85)DNA片段。它比表達(dá)一個(gè)大約30kb的旦白質(zhì)所需的基因的最小片段大得多，所以可以設(shè)想這個(gè)插入的DNA片段在不喪失酯酶活性的前提下可被縮短，為驗(yàn)證這一可能性，把pNAPT-2的HindⅢ限制酶片段連接到pPNeo/ori中去，方法如下pPNeo/ori是通過(guò)連接2.7kb的PUC19 Eco R1-smal限制片段(C.Yanisch-Perron.et al.，Gene33，P.103.1985)和2.5kb的PUB110 EcoR1-SnaB1限制片段(T.C.Gryczan et al.，J.Bacteriol.，134，P.318.1978)而成的。由于PUC19起源和PUB110起源的存在，得到的質(zhì)體pPNeo/ort(5.2kb)在大腸桿菌和桿菌屬的細(xì)菌中均可復(fù)制，此外p PNeo/ori還帶有一個(gè)表達(dá)耐氨芐青霉素密碼的基因和一個(gè)表達(dá)耐新霉素密碼的基因(C.Yanisch-Perron et al.，1985;M.Matsumura et al.，J.Biobateridol.，160，P.413，1984)。
為了繼代克隆繁殖，將HindⅢ消化的質(zhì)體pNAPT-2和HindⅢ消化的質(zhì)體pPNeo/ori混合并連接。混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM 101 hsds(Maniatis等人于1982年報(bào)道)中去。大腸桿菌JM 101 hsds是由Phabagen收集物制得的(登記號(hào)PC2493，馬得勒支，荷蘭)。用例10中所述的方法篩選能水解β-萘乙酸酯的菌落，從幾個(gè)陽(yáng)性的菌落分離出質(zhì)體DNA，通過(guò)鑒定限制酶的識(shí)別位置進(jìn)行詳細(xì)的研究。這兩個(gè)質(zhì)體pNAPT-7和pNAPT-8的結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖5和圖6。測(cè)定了大腸桿菌/pNAPT-7和大腸桿菌/pNAPT-8水解S-萘普生甲酯的活性(表11)。
發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)質(zhì)體都帶有2.2kb的pNAPT-2的HindⅢ-HindⅢ片段作為它們的插入片段，只是它們的取向是相反的?？莶輻U菌ThaiⅠ-8DNA中表達(dá)酯酶的基因好象也在2.0kb的部分。
從大腸桿菌JM 101 hsds提取出質(zhì)體pNAPT-7和pNAPT-8后，將這兩個(gè)質(zhì)體轉(zhuǎn)移到枯草桿菌1-85和枯草桿菌1A-40的原生質(zhì)體中。(S.Chang和S.N.Cohen，Mol.Gene Genet.168，P.111，1979)?？莶輻U菌1-85(Ycki，S.，1967，Jpn.J.Genet.42.P.251)和枯草桿菌1A-40(Bacillus Stock Center B.G.S.C1A-40)已被報(bào)道過(guò)。
耐新霉素菌落在zxYT肉湯培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)后，測(cè)定其水解S-萘普生甲酯的活性(方法見(jiàn)例12)。結(jié)果在表11中列出，發(fā)現(xiàn)引入多重基因片段使活性提高大約300倍，所以使微生物或由微生物得到的物質(zhì)更加適合于水解S-萘普生酯。
雖然已經(jīng)知道，基因的克隆繁殖可以提高酶的表達(dá)水平，但對(duì)于酯酶提高的程度是令人驚奇的。在克隆繁殖酶的基因時(shí)經(jīng)常遇到一些問(wèn)題如不正確的折疊、旦白質(zhì)降解和細(xì)胞內(nèi)沉淀(Harris，T.J.R.，1983，Genetic Engineering 4，Academic Press)。出乎意料的是移植酯酶基因時(shí)不發(fā)生這些問(wèn)題。
表11活性(單位/升)大腸桿菌JM 101 hsds/pNAPT-7 1064(CBS…712.86)大腸桿菌 JM 101 hsds/pNAPT-8 1160(CBS672.86)枯草桿菌1-85/pNAPT-7 1011(CBS673.86)枯草桿菌1A40/pNAPT-7 965(CBS675.86)枯草桿菌1A40/pNAPT-8 1228(CBS674.86)大腸桿菌JM 101 hsds/PUN 121 0.0枯草桿菌1-85 8.0枯草桿菌1A40 0.0(BGSC1A40) //枯草桿菌Thai Ⅰ-83.5(CBS679.85)
例12大腸桿菌JM 101 hsds/pNAPT-7的萘普生甲酯酶的研究。
將例11中-升大腸桿菌JM 101 hsds/pNAPT-7的發(fā)酵液離心，將沉淀物懸浮于PH為8.0的0.1M Tris-HCl緩沖液中，在1mg/ml溶菌酶，4mg/ml EDTA和1%正辛醇的存在下，于30℃培養(yǎng)60分鐘。DNA在15毫克分子的Mg存在下被DNA酶(DN′ase)水解(22℃，30分鐘)。
離心后，上清液中的旦白質(zhì)部分在60%的飽和硫酸銨中沉淀。離心后將沉淀物溶于PH為7.5的10毫克分子的MOPS中，通過(guò)超過(guò)濾(Amicon YM10)使之濃縮10倍。發(fā)現(xiàn)大腸桿菌pNAPT-7殘余物專(zhuān)一地水解S-萘普生甲酯的活性為每毫克蛋白質(zhì)1.6單位(u)。[測(cè)定時(shí)的條件為溫度25℃，PH為7.5的0.1M的MOPS溶液，20mg/ml S-萘普生甲酯，2%吐溫，1mg/ml BSA(牛血清蛋白)]。整個(gè)過(guò)程中，一個(gè)專(zhuān)一性單位(u)定義為在特定條件下每分鐘水解1.6×10克分子S-萘普生甲酯所需的酶的量。加入吐溫是為了提高強(qiáng)巰水性的酯和BSA的溶解性，避免由于某些吸附作用引起酶的去活化。蛋白質(zhì)濃度用Bradford的方法，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)而測(cè)得。
超離心以后的大腸桿菌pNAPT-7殘留物用例9所述的HPLC-SEC系統(tǒng)分析。
每隔15分鐘收集2ml柱組分，測(cè)定其S-萘普生酯酶活性(見(jiàn)例9)。
圖7表示的是280納米時(shí)的吸收光密度和HPLC-SEC組分的酯酶活性。S-萘普生酯酶的活性(組分26)同洗脫吸收譜的一個(gè)峰相一致?？莶輻U菌ThaiⅠ-8酯酶在同樣的條件下分析得到相同的保留時(shí)間(結(jié)果未給出)。
圖8是按Laemmli的方法得到的大腸桿菌pNAPT-7殘留物和HPLC-SEC中組分的26的12.6% SDS-PAGE的結(jié)果。
樣品4含大腸桿菌JM 101 hsds/PUN121。PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)結(jié)果清楚地表明大腸桿菌pNAPT-7殘留物中最明顯的蛋白質(zhì)就是HPLC-SEC中組分26中可測(cè)的蛋白質(zhì)帶，這一蛋白質(zhì)帶在大腸桿菌中沒(méi)有。
圖9為大腸桿菌pNAPT-7殘留物的等電點(diǎn)聚集的結(jié)果(LKB兩性聚丙烯酰胺板，PH3.5～9.5)。A中蛋白質(zhì)用Serva Blue R.染色，B中樣品6酯酶活性用β-萘乙酸酯/FB(Fast Blue RR鹽)方法來(lái)顯示(見(jiàn)例10)?？梢?jiàn)A中最明顯的蛋白質(zhì)帶具有最高的酯酶活性。
例13大腸桿菌JM 101 hsds/pNAPT-7轉(zhuǎn)化布洛芬乙酯為布洛芬在硫酸銨沉淀和超過(guò)濾后，測(cè)定大腸桿菌pNAPT-7細(xì)胞溶解液對(duì)R和S-布落芬乙酯的水解作用。
酶活性的測(cè)定是在25℃PH7.5的0.1M MOPS溶液中，加入0.3mg/ml R或S-布洛芬乙酯，2%吐溫和1mg/ml BSA。培養(yǎng)2小時(shí)后，加入乙腈終止反應(yīng)。
反應(yīng)混合物用HPLC-反相柱(Chrompack Polygosil 60D-10CN，250×4.6mm)分析，洗脫液中34%乙腈，0.05M磷酸(PH為3.0)，流速1.5毫升/分。R、S-布洛芬和R、S-布洛芬乙酯的保留時(shí)間分別為5.98分鐘和11.08分鐘。結(jié)果列于表12中。
水解S-布洛芬乙酯的活性是同樣條件下測(cè)得的水解S-萘普生甲酯的活性的60%。
表12底物 酯基 單位/升 S-立體專(zhuān)-性(%)S-布洛芬 乙基 39600 95.3R-布洛芬 乙基 1860S-萘普生 甲基 65000例14桿菌1-85/pNAPT-7的S-萘普生酯酶的研究桿菌1-85/pNAPT-7在5升的Eschweiler發(fā)酵器中發(fā)酵生長(zhǎng)，培養(yǎng)基為zxYT。
離心分離出細(xì)胞，將其溶于PH8.0的0.1克分子Tris-HCl溶液中，按例9中所述的方法使細(xì)胞溶解。
離心后將上清液加到60%的飽和硫酸銨中再次離心，沉淀溶于PH為7.5的0.02克分子MOPS中，用Amicon YM10過(guò)濾器進(jìn)行超過(guò)濾。細(xì)胞溶解液用HPLC-SEC分析柱[Tsk 2000 sw，(2x)300×7.5mm]分析，洗脫劑用PH為5.6的0.01克分子MES(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)和0.1M氯化鈉溶液。流速為1毫升/分按例12所述的方法，每隔10分鐘收集1毫升柱組分測(cè)定其S-萘普生甲酯酶的活性。
圖10表示組分在280納米處光密度吸收率和它們的酯酶活性。S-萘普生酯酶的保留時(shí)間對(duì)應(yīng)的表現(xiàn)分子量為27000。不同蛋白質(zhì)樣品的具體的活性總結(jié)在表13。酯酶活性的測(cè)定如例12所述。
桿菌pNAPT-7殘留物的對(duì)映體選擇性列于表14?；钚缘臏y(cè)定如例12所述。
桿菌pNAPT-7、分別代表脂酶和S-萘普生酯酶活性的HPLC-SEC中的組分5和組分7的12.6% SDS-PAGE結(jié)果見(jiàn)圖8(Laemmli的方法)。桿菌殘留物中主要的蛋白質(zhì)帶是組分7中唯一的蛋白質(zhì)，這一蛋白質(zhì)在組分5(脂酶活性)中沒(méi)有。樣品8中的蛋白質(zhì)帶對(duì)應(yīng)的表現(xiàn)分子量為31000。
圖9顯示了桿菌pNAPT-7和組分7等電聚焦的結(jié)果(操作見(jiàn)例12)。在桿菌pNAPT-7殘留物中，等電點(diǎn)為4.5的酯酶活性在底物為萘乙酸酯時(shí)為主要的活性。HPLC-SEC的組分7中主要蛋白質(zhì)帶的等電點(diǎn)為5.4，它與B部分中顯示的水解萘乙酸酯的活性相一致。必須注意到β-萘基速蘭(fast-blue)法對(duì)脂酶來(lái)講比酯酶靈敏得多。
HPLC-SEC的280納米光密度峰(組分7)好象包括萘普生酯酶，同時(shí)是SDS-PAGE中主要的蛋白質(zhì)帶。等電點(diǎn)聚焦的結(jié)果證實(shí)組分7中主要蛋白質(zhì)帶有酯酶活性。這說(shuō)明在大腸桿菌或桿菌屬細(xì)菌中無(wú)性繁殖枯草桿菌的酯酶活性，導(dǎo)致酯酶的形成大大加強(qiáng)。實(shí)際上在大腸桿菌pNAPT-7和桿菌pNAPT-7中，萘普生酯酶都是細(xì)胞溶解液中濃度最大的蛋白質(zhì)。
表13樣品 單位/毫升 蛋白質(zhì)濃度 單位/毫克毫克/毫升 蛋白質(zhì)桿菌1-85/pNAPT-7＊ 196 120 1.2組分6(HPLC-SEC) 6.7 1.1 6.1組分7(HPLC-SEC) 6 0.95 6.3桿菌ThaiⅠ-8＊ 0.221 107 0.002＊胞解、硫酸銨沉淀、超離心以后的細(xì)胞溶解液。
表14加入的甲酯 單位/毫升 S-立體專(zhuān)一性(%)桿菌1-85/pNAPT-7 S-萘普生 105000 99.4R-萘普生 577
圖的注解圖1桿菌ThaiⅠ-8細(xì)胞溶解液的HPLC-SEC曲線(xiàn)。
-280納米的光密度
脂酶活性
萘普生甲酯酶活性圖2例9中分析條件下PH對(duì)水解S-萘普生甲酯的影響圖3溫度對(duì)酯酶反應(yīng)的影響□＝25℃ +＝30℃ ◇＝37℃△＝45℃ x＝60℃圖4PNAPT-2的限制結(jié)構(gòu)圖。
測(cè)定了在大小為9.4kb的質(zhì)體pNAPT-2中的一些限制酶的識(shí)別部分。
PUN 121 DNA
ThaiⅠ-8 DNA插入片段部分被Sau3a消化的ThaiⅠ-8 DNA的位置與PUN 121的連接用Bcl 1/Sau3a標(biāo)出。
圖5和圖6分別為pNAPT-7和pNAPT-8的限制結(jié)構(gòu)圖。
2.2kb的pNAPT-7的HindⅢ片段引入到pPNeo/ori中。產(chǎn)生的質(zhì)體pNAPT-7和pNAPT-8用幾個(gè)限制性酶進(jìn)行詳細(xì)研究。兩個(gè)質(zhì)體的大小均為7.3kb?？梢园l(fā)現(xiàn)pNAPT-8帶有一個(gè)2.2kb和pNAPT-7中取向相反的HindⅢ片段。
PUC 19 DNA
PUB 110 DNA
PUN 121 DNA
ThaiⅠ-8 DNA圖7HPLC-SEC組分的280納米吸收光密度和酯酶活性。
S-萘普生甲酯酶活性-280納米光密度圖8大腸桿菌pNAPT-7殘留物和HPLC-SEC的組分26按Laemmli法得到的12.6% SDS-PAGE的結(jié)果。
樣品1，5和9分子量標(biāo)記物樣品2大腸桿菌pNAPT-7殘留物樣品3大腸桿菌pNAPT-7殘留物在經(jīng)過(guò)HPLC凝膠過(guò)濾后得到的活性組分26樣品4大腸桿菌/PUN121宿主菌柱樣品6帶有pNAPT-7的枯草桿菌1-85樣品7和8帶有pNAPT-7的枯草桿菌1-85經(jīng)過(guò)HPLC凝膠過(guò)濾后得到的組分5和組分7樣品10桿菌ThaiⅠ-8殘留物圖9大腸桿菌pNAPT-7殘留物在等電點(diǎn)聚焦的結(jié)果(LKB兩性聚丙烯酰胺板，PH3.5～9.5)。
A用Sweva blue染色后的情況B用β-萘乙酸酯/FBB染色后的情況樣品1已知等電點(diǎn)的標(biāo)記蛋白質(zhì)樣品4大腸桿菌pNAPT-7殘留物樣品3帶有pNAPT-7的枯草桿菌殘留物樣品2樣品3經(jīng)過(guò)HPLC凝膠過(guò)濾后的活性組分圖10HPLC-SEC組分的280納米吸收光密度曲線(xiàn)和酯酶活性
S-萘普生甲酯酶活性-280納米光密度
權(quán)利要求
1.制備有生物活性的立體專(zhuān)一化合物
或其適于制劑的鹽或酯的方法，其中R1代表一個(gè)任意取代如芳基的苯基或萘基，它們包括在任意的雜環(huán)系統(tǒng)，R1也可代表一個(gè)任意取代的芳雜環(huán)系統(tǒng)，環(huán)中除了碳原子還可選一個(gè)或幾個(gè)雜原子如氮、硫和氧，它通過(guò)微生物或得自微生物的物質(zhì)作用于化合物
其中R為酯的一部分，較好的情況是一個(gè)任意取代的烷基，將化合物(Ⅱ)立體選擇地水解為化合物(Ⅰ)，產(chǎn)物中S-構(gòu)型物至少占80%(重量比)，可根據(jù)需要將(Ⅰ)轉(zhuǎn)化為適于制劑的鹽或酯。
2.權(quán)項(xiàng)1中的方法，其中R2為1到8個(gè)碳原子的直鏈烷基。
3.權(quán)項(xiàng)1-2中的方法，其中R2為乙基。
4.權(quán)項(xiàng)1-2中的方法，其中R2為甲基。
5.權(quán)項(xiàng)1-4中的方法，其中化合物(Ⅰ)為萘普生、布洛芬、噻丙吩、苯氧苯丙酸、酮布洛芬、苯惡丙吩、卡巴唑丙酸(carprofen)、丙酸、里西丙吩(lisiprofenum)、氟聯(lián)苯丙酸、氟苯丙酸(fluprofen)、克利得納(clidanac)、叔丙吩(tertiprofen)、己基苯丙酸(hexaprofen)、茚酮苯丙酸、甲氧苯丙酸(mexoprofen)、吡喃苯丙酸(pranoprofen)、馬并呋喃苯丙酸(R803)、吩噻嗪丙酸、酮基噻丙酸(tiaprofenic acid)或布魯潘齊(brofezil)。
6.權(quán)項(xiàng)1-4中的方法，其中化合物(Ⅰ)為萘普生。
7.權(quán)項(xiàng)1-4中的方法，其中化合物(Ⅰ)為布洛芬。
8.權(quán)項(xiàng)1-4中的方法，其中提到微生物能夠轉(zhuǎn)化化合物(Ⅱ)為化合物(Ⅰ)，化合物(Ⅰ)的S-構(gòu)型至少有90%(重量比)。
9.制備有80%以上的R-構(gòu)型的化合物(Ⅰ)的方法，包括上述所有的權(quán)項(xiàng)，分離出S-構(gòu)型的化合物(Ⅰ)后將其余部分進(jìn)行水解。
10.上述所有權(quán)項(xiàng)中的方法，其中提到的微生物以活細(xì)胞或死細(xì)胞的形式被固定。
11.上述所有權(quán)項(xiàng)中的方法，其中可轉(zhuǎn)化化合物(Ⅱ)到化合物(Ⅰ)的物質(zhì)是從微生物中游離出來(lái)或直接使用。
12.權(quán)項(xiàng)1-11中的方法，其中提到的微生物是屬于桿菌屬，假單胞菌屬，關(guān)節(jié)芽胞桿菌屬毛霉菌屬或鏈霉菌屬的細(xì)菌。
13.權(quán)項(xiàng)1-11中的方法，其中所用的微生物為枯草桿菌屬或苔狀桿菌。
14.權(quán)項(xiàng)1-11中的方法，其中所用的微生物為多棱大孢子毛霉菌(Mucor angwlimacrosporus)，
15.權(quán)項(xiàng)1-11中的方法，其中所用的微生物為熒光假單胞菌，綠膿桿菌，惡臭假單胞菌，卵狀假單胞菌或核黃素假單胞菌。
16.權(quán)項(xiàng)1-11中的方法，其中所用的微生物為黃微綠鏈霉菌。
17.權(quán)項(xiàng)1-11中的方法，其中所用的微生物為菌株isⅢ-25(CBS 666.86)，菌株LK3-4(CBS 667.86)，菌株SP4(CBS 668.86)，菌株ThaiⅢ 18-1(CBS 669.86)或菌株ThaiⅥ 12(CBS 670.86)。
18.權(quán)項(xiàng)1-11中的方法，其中所用微生物為Arthrobacter Paraffineus。
19.權(quán)項(xiàng)1-11中的方法，其中所用微生物為植入表達(dá)酯酶的DNA片段的微生物。
20.權(quán)項(xiàng)19中的方法，其中DNA片段是得自任何桿菌屬細(xì)菌。
21.權(quán)項(xiàng)20中的方法，其中DNA片段是得自枯草桿菌。
22.權(quán)項(xiàng)19中的方法，其中DNA片段為一個(gè)插入到質(zhì)體內(nèi)的DNA片段。
23.權(quán)項(xiàng)22中的方法，其中質(zhì)體為pNAPT-7或pNAPT-8。
24.權(quán)項(xiàng)19-20中的方法，其中所用的微生物為大腸桿菌，較好的是大桿菌JM 101 hsds或大腸桿菌DH1。
25.權(quán)項(xiàng)19-20中的方法，其中所用的微生物為枯草桿菌，較好的為枯草桿菌1-85或枯草桿菌1A40。
26.根據(jù)上述所有的權(quán)項(xiàng)生產(chǎn)的化合物(Ⅰ)或其堿金屬鹽或其堿土金屬鹽。
27.權(quán)項(xiàng)26中的化合物，有至少80%(重量比)的S-構(gòu)型。
28.權(quán)項(xiàng)27中的化合物，有至少90%(重量比)的S-構(gòu)型。
29.藥品至少含有一種權(quán)項(xiàng)26-28的化合物。
30.桿菌 ThaiⅠ-8(CBS 679.85)。
31.桿菌 ⅠnⅣ-8(CBS 680.85)。
32.桿菌 Nap 10-M(CBS 805.85)。
33.桿菌 SpⅢ-4(CBS 806.85)。
34.假單孢菌 KorⅠ-6(CBS 807.85)。
35.大腸桿菌 DH1/pNAPT-2(CBS 671.86)。
36.大腸桿菌 JM 101 hsds/p NAPT-7(CBS 712.86)。
37.枯草桿菌 1-85/pNAPT-7(CBS 673.86)。
38.枯草桿菌 1A-40/pNAPT-7(CBS 675.86)。
39.枯草桿菌 1A-40/pNAPT-8(CBS 674.86)。
40.大腸桿菌 JM hsds/p NAPT-8(CBS 672.86)。
41.菌株 LK3-4(CBS 667.86)。
42.菌株 Sp 4(CBS 668.86)。
43.菌株 ThaiⅢ 18-1(CBS 669.86)。
44.菌株 ThaiⅥ 12(CBS 670.86)。
45.菌株 isⅢ-25(CBS 666.86)。
46.能夠立體選擇地水解化合物(Ⅱ)、產(chǎn)生至少有95%(重量比)S-構(gòu)型的化合物(Ⅰ)的酶。
47.權(quán)項(xiàng)46中得自微生物的酶，它可以立體選擇地水解化合物
其中R代表一個(gè)任意取代的芳基如苯基或萘基，取代基也可以是一個(gè)任意取代的雜環(huán)系統(tǒng)，R也可代表一個(gè)任意取代的芳雜環(huán)系統(tǒng)，環(huán)中除了碳原子還可選一個(gè)或幾個(gè)雜原子如氮、硫和氧，R為酯基，較好的是任意取代的烷基，使之轉(zhuǎn)化為至少有80%(重量比)S-構(gòu)型的通式為
的化合物。
48.權(quán)項(xiàng)47中的酶，其中化合物(Ⅰ)為萘普生或布洛芬。
49.可從權(quán)項(xiàng)30-45中的微生物制得權(quán)項(xiàng)47中的酶。
50.特有活性至少為0.1單位(如本文前面所定義的)的權(quán)項(xiàng)46中的酶。
51.如本文前面所定義的，權(quán)項(xiàng)50中的酶，其特有活性至少為1單位。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明闡述了一個(gè)制備有生物活性的立體專(zhuān)一形式通式為(I)的化合物或其鹽或酯的方法，如它的堿金屬鹽，堿土金屬鹽。化合物(I)是通過(guò)有立體選擇性水解作用的微生物作用于通式為(II)的化合物而制得的。(II)式中R
文檔編號(hào)C12N9/18GK87100031SQ87100031
公開(kāi)日1987年9月9日 申請(qǐng)日期1987年1月6日
發(fā)明者伯托拉·莫羅·阿蒂利奧, 馬克斯·阿瑟·弗里德里克, 奎亞克斯·威爾赫姆·約翰尼斯, 萬(wàn)·德·拉肯·科爾尼利斯·扎科布斯 申請(qǐng)人:吉斯特·布羅咖德公司, 國(guó)際殼牌研究有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan