專利名稱：利用蛋殼多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)要求2008年7月10日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 61/079，619的優(yōu)先權(quán)， 其全文通過(guò)引用并入本文。
背景技術(shù)：
在一生中，舊骨不斷地被吸收骨的破骨細(xì)胞清除，并被由成骨細(xì)胞生成的新骨所 取代。這一循環(huán)稱為骨重建循環(huán)(bone-remodeling cycle)，其通常在很大程度上受到調(diào) 節(jié)，也就是說(shuō)，破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的作用相關(guān)聯(lián)，使得在穩(wěn)定狀態(tài)下當(dāng)骨被重吸收時(shí)有相 同量的骨被形成。骨重建循環(huán)發(fā)生于骨表面的特定區(qū)域。由骨中合適的前體細(xì)胞生成的破骨細(xì)胞重 吸收骨的一部分，隨后通過(guò)成骨細(xì)胞的活性產(chǎn)生新骨。成骨細(xì)胞合成骨基質(zhì)的膠原前體，并 且調(diào)節(jié)其礦化。認(rèn)為成骨細(xì)胞在骨重建循環(huán)中滿足骨骼生長(zhǎng)和基質(zhì)需要并調(diào)節(jié)其維持和機(jī) 械功能的動(dòng)態(tài)活性受到多種因素(例如激素、生長(zhǎng)因子、物理活性以及其他刺激)的影響。 認(rèn)為成骨細(xì)胞具有甲狀旁腺激素和雌激素的受體。破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間具有代謝協(xié)同 作用。破骨細(xì)胞粘附于發(fā)生重吸收的骨表面，并認(rèn)為其被來(lái)源于成骨細(xì)胞的信號(hào)所活化。 但是，成骨細(xì)胞還可以被來(lái)源于破骨細(xì)胞的信號(hào)(例如，所釋放的Ca)所活化。因此，為了 相互刺激并產(chǎn)生新骨，雙方均是活化的十分重要。例如，當(dāng)用雙膦酸鹽治療骨質(zhì)疏松癥患者 時(shí)，患者的破骨細(xì)胞減少。當(dāng)接收來(lái)自剩余破骨細(xì)胞的較少信號(hào)時(shí)，尚不確定成骨細(xì)胞的長(zhǎng) 期活性如何。對(duì)于人體來(lái)說(shuō)，利用活性成骨細(xì)胞和活性破骨細(xì)胞形成新骨是十分關(guān)鍵的。骨重建循環(huán)一個(gè)或者多個(gè)階段的不平衡(例如，骨形成和骨重吸收之間的平衡喪 失)可以導(dǎo)致骨重建障礙或代謝型骨病，例如骨質(zhì)疏松癥和佩吉特病。這些疾病中的一些 是由于骨重建循環(huán)的一半(例如破骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞)相對(duì)于另一半的過(guò)度活性引起的。 例如在骨質(zhì)疏松癥中，成骨細(xì)胞活性相對(duì)降低，其可引起骨密度和骨量的減少。骨質(zhì)疏松癥 是最常見(jiàn)的代謝型骨病，其可以是原發(fā)性疾病，或可以是另一種疾病或其他疾病的繼發(fā)性 疾病。骨質(zhì)疏松癥通常以骨密度減少為特征。骨變薄變?nèi)跏沟幂p微外傷導(dǎo)致骨折的機(jī)率增 加。蛋殼是一種包含約95-98 %碳酸鈣、1-2%微量礦物質(zhì)(包括Mg等)和約 1-2%有機(jī)化合物(例如蛋白質(zhì)和膠原)的生物材料。之前，市售禽蛋殼制劑(又稱為 Putamen Ovi (PO)或者Biomin)已經(jīng)用作治療骨質(zhì)疏松癥的口服藥物(Ru印ρ的美國(guó)專利 Nos. 6，344，217和7，011，853 ；美國(guó)專利No. 5，045，323)。這些制劑需要經(jīng)過(guò)加熱過(guò)程(高 壓滅菌、干熱滅菌)。而在用熱處理蛋殼的過(guò)程中，這些制劑的有機(jī)化合物減少或甚至完全 被破壞。但是，已經(jīng)表明經(jīng)高壓滅菌的蛋殼粉對(duì)骨細(xì)胞有刺激作用，但是在天然蛋殼中哪種 物質(zhì)作為活性成分并發(fā)揮刺激作用仍未知。需要鑒定對(duì)骨細(xì)胞有刺激作用的蛋殼組分，以 及這些組分在治療骨病、骨損傷和響應(yīng)于刺激成骨細(xì)胞活性之其他病癥中的用途。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)實(shí)施方案中，刺激成骨細(xì)胞活性的方法包括使成骨細(xì)胞與包含來(lái)自蛋殼之 多肽提取物的組合物相接觸，其中所述多肽提取物分離自硬蛋殼組織、軟蛋殼組織或其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在有此需要的個(gè)體中刺激成骨和/或骨誘導(dǎo)活性的方法包 括對(duì)所述個(gè)體施用包含來(lái)自蛋殼之多肽提取物的組合物，其中所述多肽提取物分離自硬蛋 殼組織、軟蛋殼組織或其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在有此需要的個(gè)體中刺激血細(xì)胞生成的方法包括對(duì)所述個(gè) 體施用包含來(lái)自蛋殼之多肽提取物的組合物，其中所述多肽提取物分離自硬蛋殼組織、軟 蛋殼組織或其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在有此需要的個(gè)體中刺激軟骨形成和/或分化的方法包括 對(duì)所述個(gè)體施用包含來(lái)自蛋殼之多肽提取物的組合物，其中所述多肽提取物分離自硬蛋殼 組織、軟蛋殼組織或其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在有此需要的個(gè)體中刺激成纖維細(xì)胞的方法包括對(duì)所述個(gè) 體施用包含來(lái)自蛋殼之多肽提取物的組合物，其中所述多肽提取物分離自硬蛋殼組織、軟 蛋殼組織或其組合。本文還包括用1至25wt%的SDS和任選地1至60%體積/體積的乙酸處理硬蛋 殼組織之方法的產(chǎn)物。本文還包括用包含2至IOM尿素且pH值為7. 0-9. 0的溶液處理軟蛋殼組織之方 法的產(chǎn)物。


先參考以下附圖，其中圖1是硬蛋殼和軟蛋殼多肽的示例性純化及其用途的圖。圖2顯示成骨細(xì)胞的增殖。柱1-對(duì)照(無(wú)添加物)；柱2-P0-I (于137°C高壓滅 菌)；柱3-P0-II (標(biāo)準(zhǔn)高壓滅菌)；柱4-HA-硬蛋殼多肽0.5g/l[HA=透明質(zhì)酸]；柱5-硬 蛋殼-多肽(低濃度0. 005g/l)；柱6-硬蛋殼-多肽(高濃度0. 5g/l)。圖3顯示成骨細(xì)胞的增殖。柱1-對(duì)照(無(wú)添加物)；柱2-P0-I (于137°C高壓滅 菌)；柱3-P0-II (標(biāo)準(zhǔn)高壓滅菌)；柱4-HA-硬蛋殼多肽0.5g/l[HA=透明質(zhì)酸]；柱5-硬 蛋殼-多肽(低濃度0.005g/l)；柱6-硬蛋殼-多肽(高濃度0.5g/l)；柱7-P0-0 (于113°C 高壓滅菌)。圖4顯示對(duì)于3種不同的蛋白樣品A、B、C、B+C而言，利用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器系統(tǒng)測(cè)定 的培養(yǎng)5天后細(xì)胞的數(shù)量。圖5顯示在匪If培養(yǎng)基(作為對(duì)照)和添加有蛋白樣品A、B、C、B+C的培養(yǎng)基中 培養(yǎng)5天后成骨細(xì)胞的中位細(xì)胞大小。圖6顯示在添加有蛋白樣品A、B、C、B+C的培養(yǎng)基中和MMlf (作為對(duì)照)中培養(yǎng)5 天后中位細(xì)胞大小的柱狀圖。圖7顯示細(xì)胞增殖的柱狀圖。在添加有蛋白樣品A、B、C、B+C的培養(yǎng)基中和 MMlf (作為對(duì)照)中培養(yǎng)的原代牛成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞/圖像。圖8顯示在所用的培養(yǎng)基MMlf (作為對(duì)照)、添加有蛋白樣品A的培養(yǎng)基和添加有蛋白樣品B的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后的鈣濃度(g/L)。通過(guò)下文的詳細(xì)描述、附圖和所附權(quán)利要求，本領(lǐng)域技術(shù)人員將知曉和理解上述 及其他特征。發(fā)明詳述本文中鑒定了雞蛋殼的活性組分，其在體外研究中顯示對(duì)造骨細(xì)胞(bone building cell)(成骨細(xì)胞)具有刺激作用。該物質(zhì)是從蛋殼中提取的一種或多種多肽。 本文已發(fā)現(xiàn)，包含蛋殼多肽的組合物刺激成骨細(xì)胞，并因此具有骨誘導(dǎo)和/或成骨特性、血 細(xì)胞生成特性以及軟骨形成和/或分化特性。本文中所用的來(lái)自蛋殼的多肽提取物是來(lái)自 蛋殼硬殼組織、軟殼組織或二者兼有的提取物，其包含大于95wt%、特別是大于99. 5wt% 的蛋殼多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽提取物是脫礦化提取物。提取后，所述多肽制 備物含有礦物質(zhì)(礦物質(zhì)鹽)，例如乙酸鈣。提取后，可以利用超濾法使提取物脫礦化(脫 鹽)，從而對(duì)溶液進(jìn)行完全純化。脫礦化后，可將提取物經(jīng)冷凍干燥， 然后成為純物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋殼是雞蛋殼，即來(lái)自原雞(Gallus gallus)的蛋殼。 在另一些實(shí)施方案中，所述蛋殼來(lái)自鵝(Anser anser)、鴨(Anas platyrhynchos)或鴕鳥 (Struthio camelus)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋殼是新鮮蛋殼。在本文中，新鮮蛋殼定義為來(lái)自未經(jīng) 熱(例如煮、蒸汽加熱或高壓滅菌)處理/加工之蛋的殼。該特征使本發(fā)明的蛋殼制備品 與利用加熱/蒸汽來(lái)加工蛋殼的現(xiàn)有技術(shù)區(qū)別開(kāi)來(lái)。不受理論限制，相信市售蛋殼制備品 (例如puamen ovi, Biomin)具有比新鮮蛋殼提取物低得多的多肽濃度。在另一些實(shí)施方 案中，所述蛋殼是經(jīng)煮、蒸汽/加熱的。新鮮蛋殼可以來(lái)自未受精或已受精的蛋。已出乎意料地發(fā)現(xiàn)包含蛋殼多肽的組合物具有骨誘導(dǎo)/成骨特性，即刺激骨形 成。在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述包含蛋殼多肽的組合物施用于需要治療骨病(例如骨質(zhì)疏 松癥、骨質(zhì)減少癥、成骨不全癥、佩吉特病、骨折等)的個(gè)體。還出乎意料地發(fā)現(xiàn)包含蛋殼多肽的組合物具有血細(xì)胞生成特性，即刺激血細(xì)胞生 成。在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述包含蛋殼多肽的組合物施用于需要治療貧血以及相關(guān)的骨 髓和血液病癥的個(gè)體。還出乎意料地發(fā)現(xiàn)包含蛋殼多肽的組合物具有軟骨形成和/或分化特性。在一個(gè) 實(shí)施方案中，將所述包含蛋殼多肽的組合物施用于需要修復(fù)軟骨的個(gè)體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述包含蛋殼多肽的組合物以粉末、糊劑、注射溶液、或者用 于骨內(nèi)注射或局部施用(例如用作骨移植物或者骨刺激劑用于椎體后凸成形術(shù)、脊椎成形 術(shù)、骨折部位或者骨或關(guān)節(jié)缺陷中)之溶液或糊劑的形式存在。前述組合物可以用于在骨 或軟骨損傷或缺陷部位對(duì)骨和/或軟骨進(jìn)行修復(fù)。所述蛋殼多肽任選地與膠原海綿、透明 質(zhì)酸凝膠、碳酸鈣、β -磷酸三鈣(TCP)、磷酸鈣(羥磷灰石)、骨引導(dǎo)可降解材料例如多聚物 (聚乳酸、聚乙醇酸))、生長(zhǎng)因子、或者包含一種或多種上述試劑的組合一起施用。示例性 的生長(zhǎng)因子包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、 胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)，以及包含一種或多種上述生長(zhǎng)因 子的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含蛋殼多肽的組合物以口服、鼻內(nèi)或可注射組合物的形式全身施用。用于口服施用的組合物包括例如片劑、膠囊和軟膠囊。全身性施用適用于治療 骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少癥和諸如以下的骨病佩吉特病、成骨不全癥、骨軟化癥、骨石化癥、 奧斯古德-施萊特病、骨痛退化癥(Algodystrophy)、反射性交感神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良綜合征(復(fù) 雜性區(qū)域疼痛綜合征)、暫時(shí)性骨質(zhì)疏松、無(wú)血管性壞死、骨壞死、骨軟骨病變、溶骨性病變、 骨腫瘤和骨折。所述蛋殼多肽任選地與鈣、鎂、磷、氟、雙膦酸鹽、雌激素、維生素(例如維生 素A、D、E、K、C、B)、甲狀旁腺激素(PTH)、微量礦物質(zhì)(例如鋅、錳)、大豆類黃酮化合物或 者包含一種或多種前述藥劑之組合一起施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)用作造血物質(zhì)時(shí)，全身性施用適用于治療貧血和其他血液 病癥。所述蛋殼多肽任選地與細(xì)胞因子、糖蛋白生長(zhǎng)因子、集落刺激因子(CSF)(例如粒細(xì) 胞-巨噬細(xì)胞CSF (GM-CSF)、粒細(xì)胞CSF (G-CSF)和巨噬細(xì)胞CSF (M-CSF))、紅細(xì)胞生成素以 及包含一種或多種上述藥劑之組合一起施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用包含蛋殼多肽的組合物(例如以表面組合物(topical composition)的形式)刺激成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞位于真皮層，其產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)組分 (例如膠原)和多種細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子反過(guò)來(lái)增強(qiáng)角化細(xì)胞的增殖和遷移。角化細(xì)胞 位于表皮層，形成抵御外界環(huán)境的屏障。所述包含蛋殼多肽的組合物可以用于表面，例如用 于治療皮膚屏障和角化癥以及減少皮膚衰老和/或皺紋的組合物?？蓪⒌皻ざ嚯陌襁M(jìn)磷 脂酰膽堿脂質(zhì)體或者納米顆粒中。刺激成骨細(xì)胞形成的蛋殼組分是蛋殼的多肽級(jí)分，即來(lái)自蛋殼的多肽提取物。本 文中所用的術(shù)語(yǔ)多肽意指以肽鍵相連接的多個(gè)氨基酸，其包括蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段和肽。蛋 殼多肽是從蛋殼中提取的多肽或其片段。優(yōu)選地，所述片段能夠刺激成骨細(xì)胞的活性。根據(jù) 所用的提取蛋殼多肽的技術(shù)，至少一部分多肽與其天然狀態(tài)的多肽相比分子量可降低。不 受理論的限制，相信提取硬蛋殼多肽所需的相對(duì)嚴(yán)格的步驟導(dǎo)致所分離多肽的平均分子量 降低，即至少一部分多肽在提取過(guò)程中發(fā)生降解。術(shù)語(yǔ)硬蛋殼組織包括蛋殼的鈣化層，即含有柵狀層和乳頭層的硬蛋殼。術(shù)語(yǔ)軟蛋 殼組織包括蛋殼內(nèi)膜和外膜，也稱為蛋殼內(nèi)側(cè)(蛋內(nèi))的膜層。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)加工(清洗、滅菌)蛋殼時(shí)，其應(yīng)當(dāng)盡可能保持天然狀態(tài)，即 保留有機(jī)化合物(蛋白、膠原)，并且當(dāng)用加熱處理(例如高壓滅菌)時(shí)不使其變性?？梢?通過(guò)將蛋殼放入經(jīng)氧-臭氧飽和的水中5-25分鐘來(lái)對(duì)蛋殼進(jìn)行清洗和消毒。出乎意料地 是，經(jīng)氧化/臭氧化的水并不使蛋殼的有機(jī)化合物變性。用經(jīng)臭氧化水清洗后，可以利用真 空干燥器使?jié)竦皻睾偷馗稍?。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使硬蛋殼組織與包含1至25wt% SDS的水性還原緩沖液 相接觸來(lái)提取硬蛋殼多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述還原緩沖液還包含1至60%體積/ 體積的乙酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，利用1至60%體積/體積的乙酸溶液提取硬蛋殼多肽。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述乙酸溶液還包含1至25wt%的EDTA。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述硬蛋殼提取物包含Ovocleidin、Ovocalyxin和/或叢生 蛋白(Clusterin)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述硬蛋殼提取物包含Ovocleidin-116、叢生蛋 白_(硫酸化糖蛋白2)、0VOCleidin-17、0VOCalyXin-32活性片段，或者包含一種或多種上 述物質(zhì)的活性級(jí)分。所述活性級(jí)分是能夠刺激成骨細(xì)胞活性的級(jí)分。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使軟蛋殼組織與包含2至10M尿素且pH值為7.0-9.0的溶液相接觸來(lái)提取軟蛋殼多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖液包含25mM Tris/HCl(pH 8. 9)、2M 尿素。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述軟蛋殼多肽提取物包含卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白前體、 78kDa多肽(卵轉(zhuǎn)鐵蛋白家族)、105kDa多肽(卵轉(zhuǎn)鐵蛋白家族)、卵白蛋白相關(guān)多肽Y、 52kDa多肽(卵抑制劑，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白)、卵類粘蛋白前體、與卵白蛋白相關(guān)蛋白Y 類似的SERPINB11、卵糖蛋白前體、溶菌酶C前體、28kDa多肽、卵粘蛋白α亞基、!fep21蛋白 前體、0vocleidin-17、164kDa多肽、叢生蛋白49多肽、卵固蛋白(Ovostatin)前體、18kDa 多肽、8kDa多肽、35kDa多肽、34kDa多肽、α -1 (XI型)膠原同工型、ΝΤ-3生長(zhǎng)因子受體的 α -KT同工型、半胱氨酸蛋白酶抑制劑前體、其活性片段，或者包含一種或多種上述物質(zhì)的 活性級(jí)分。所述活性級(jí)分是能夠刺激成骨細(xì)胞活性的級(jí)分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述硬蛋殼多肽提取物、軟蛋殼多肽提取物或者二者是硬或 軟蛋殼多肽總提取物。所述總提取物意指包含可從組織中分離之全部多肽重量的大于 90wt%、特別地大于95wt%、更特別地大于98wt%的提取物?？偠嚯奶崛∥锟砂到庑?式的多肽級(jí)分，只要所述總提取物包含上述量的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用包含經(jīng)純化重組蛋殼多肽的組合物(而不是蛋殼多肽提 取物)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含經(jīng)純化重組Ovocleidin和/或經(jīng)純化重組叢 生蛋白?？蓪⑦m于表達(dá)蛋殼多肽的多核苷酸可以插入到一個(gè)或多個(gè)重組表達(dá)載體中。術(shù)語(yǔ) “重組表達(dá)載體”指質(zhì)粒、病毒或者本領(lǐng)域已知的通過(guò)插入或摻入基因序列而進(jìn)行操作的其 他工具。本文中術(shù)語(yǔ)“質(zhì)粒”通常按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的標(biāo)準(zhǔn)命名規(guī)則以小寫字母P在 前命名，和/或后面是大寫字母和/或數(shù)字。質(zhì)粒是市售的、可不受限制地公開(kāi)獲得的，或 者可通過(guò)眾所周知的已公開(kāi)方法通過(guò)常規(guī)應(yīng)用由可獲得的質(zhì)粒來(lái)構(gòu)建。有多種質(zhì)粒以及其 他克隆和表達(dá)載體是眾所周知并且易于獲得的，或者本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地構(gòu)建 適用的、任意數(shù)量的其他質(zhì)粒。可將這些載體轉(zhuǎn)化到合適的宿主細(xì)胞中，以形成用于生產(chǎn)多 肽的宿主細(xì)胞載體系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用在利什曼原蟲(Leishmania tarentolae)中表達(dá)的真核 蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白。單細(xì)胞動(dòng)基體原生動(dòng)物利什曼原蟲分離自摩爾壁虎(Moorish gecko)毛里塔尼亞 壁虎(Tarentola mauritanica)，其對(duì)哺乳動(dòng)物是非致病性的(生物安全等級(jí)1)，是市售真 核蛋白表達(dá)系統(tǒng)LEXSY(Jena Bioscience)的蛋白產(chǎn)生宿主?？蓪⑦m于表達(dá)蛋殼多肽的多核苷酸插入到適于在細(xì)菌、酵母、昆蟲、兩棲動(dòng)物、或 哺乳動(dòng)物、或者其他原核或真核細(xì)胞中表達(dá)的載體中，所述載體還包含在細(xì)菌、酵母、昆蟲、 兩棲動(dòng)物或哺乳動(dòng)物中表達(dá)核酸所必需的調(diào)控元件，所述調(diào)控元件與編碼多肽的核酸分子 有效連接。“有效連接”指相鄰位置，其中所述組件處于允許其以其預(yù)期方式發(fā)揮作用的關(guān) 系中。與編碼序列有效連接之表達(dá)控制序列的連接使得可實(shí)現(xiàn)編碼序列在與表達(dá)控制序列 相容條件下的表達(dá)。本文中所用術(shù)語(yǔ)“表達(dá)控制序列”指調(diào)節(jié)與其有效連接之核酸序列的 表達(dá)的核酸序列。當(dāng)表達(dá)控制序列控制和調(diào)節(jié)核酸序列的轉(zhuǎn)錄以及其翻譯(需要時(shí))時(shí)， 所述表達(dá)控制序列與核酸序列有效連接。因此，表達(dá)控制序列可以包括合適的啟動(dòng)子、增強(qiáng) 子、轉(zhuǎn)錄終止子、蛋白編碼基因前面的起始密碼子(即atg)、內(nèi)含子剪接信號(hào)(如果存在內(nèi)含子)、保持允許mRNA正確翻譯的基因的正確讀碼框、以及終止密碼子。術(shù)語(yǔ)“控制序列” 旨在至少包括其存在可以影響表達(dá)的元件，并且還可以包括其存在是有利的附加元件，例 如前導(dǎo)序列和融合伴侶序列。表達(dá)控制序列可以包括啟動(dòng)子。“啟動(dòng)子”意指足以指導(dǎo)轉(zhuǎn) 錄的最小序列。還可以包括足以向啟動(dòng)子依賴性可控制基因表達(dá)賦予細(xì)胞類型特異性、組 織特異性，或者可被外部信號(hào)或試劑誘導(dǎo)的啟動(dòng)子元件，所述元件可位于基因的5’或3’區(qū) 域。組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子均包括在內(nèi)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)，利用表達(dá)載體或其他DNA進(jìn)行宿主細(xì) 胞的轉(zhuǎn)化?！稗D(zhuǎn)化”意指在摻入新DNA(即細(xì)胞外源性DNA)后在細(xì)胞中誘導(dǎo)的永久性或瞬時(shí) 性基因變化。當(dāng)細(xì)胞是哺乳細(xì)胞時(shí)，永久性基因變化通常通過(guò)將DNA引入細(xì)胞基因組中來(lái) 實(shí)現(xiàn)?！敖?jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”或“宿主細(xì)胞”是指已通過(guò)重組DNA技術(shù)將編碼本發(fā)明之蛋殼多肽 或其片段的DNA分子引入其中(或引入其祖先中)的細(xì)胞(例如原核或真核細(xì)胞)。蛋殼多肽還可以設(shè)計(jì)為提供附加序列，例如添加有助于通過(guò)柱上捕獲或利用抗體 而進(jìn)行純化之附加C末端或者N末端氨基酸的編碼序列。這樣的標(biāo)簽包括例如能夠進(jìn)行鎳 柱上多肽之純化的組氨酸富集標(biāo)簽。這些基因修飾技術(shù)和合適的附加序列是分子生物學(xué)領(lǐng) 域內(nèi)所熟知的。蛋殼蛋白、多肽、或多肽衍生物可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行純化。這些方法包 括但不限于體積排阻色譜、硫酸銨分級(jí)、離子交換色譜、親和色譜、結(jié)晶、電聚焦、制備型凝 膠電泳、以及包含一種或多種上述方法之組合。經(jīng)分離和純化的蛋殼的制備物的純度為約 50 %至約99. 9 %，優(yōu)選大于或等于約80 %，更優(yōu)選大于或等于約85 %，更優(yōu)選大于或等于 約90%，特別優(yōu)選大于或等于約95%?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的方法(例如SDS-聚丙烯酰 胺凝膠電泳)評(píng)估純度。包含蛋殼多肽的組合物包括例如固體、半固體和液體劑型，例如片劑、丸劑、粉末、 液體溶液或混懸液、栓劑以及注射溶液和輸注溶液。劑型取決于所預(yù)期的施用和治療應(yīng)用 形式，并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。施用方式包括口服、胃腸外、皮下、靜脈內(nèi)、病灶內(nèi)或表 面施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，將組合物施用于需要進(jìn)行骨或軟骨再生或修復(fù)的治療部位附 近。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含蛋殼多肽的組合物還包含賦形劑。可加入賦形劑以利于 生產(chǎn)、增強(qiáng)穩(wěn)定性、控制釋放、增強(qiáng)產(chǎn)品特性、增加生物利用度、增強(qiáng)患者接受性等。藥用賦 形劑包括粘合劑、崩解齊 、潤(rùn)滑齊 、助流齊 、壓縮助齊 、色素、甜味齊 、防腐劑、助懸齊 、分散 劑、成膜劑、調(diào)味劑、印刷油墨等。粘合劑使成分共同保持在劑型中。示例性粘合劑包括聚 乙烯吡咯烷酮、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素和羥乙基纖維素，以及包含 一種或多種上述粘合劑的組合。當(dāng)潮濕時(shí)，崩解劑膨脹，使得藥片崩開(kāi)。示例性崩解劑包括 吸水膨脹物質(zhì)，例如低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羥 基乙酸淀粉鈉、羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉；離子交換樹(shù)脂；微晶纖維素；淀粉和預(yù)膠 化淀粉、福爾馬林-酪蛋白；以及包含一種或多種上述吸水膨脹物質(zhì)的組合。潤(rùn)滑劑例如輔 助粉末材料的加工過(guò)程。示例性潤(rùn)滑劑包括硬脂酸鈣、山崳酸甘油酯、硬脂酸鈣、礦物油、聚 乙二醇、硬脂酰富馬酸鈉、硬脂酸、滑石、植物油、硬脂酸鋅，以及包含上述一種或多種潤(rùn)滑 劑的組合。助流劑包括例如二氧化硅。在表面應(yīng)用的實(shí)施方案中，載體以適于局部應(yīng)用于皮膚的形式存在，包括例如溶液、膠體分散液、乳液(水包油或油包水)、混懸液、乳膏、乳液、凝膠、泡沫、摩斯(mousse)、 噴霧劑、香波(shampoo)等。適于表面應(yīng)用的組合物還包括例如混懸于合適基質(zhì)或載體中 的納米顆粒或脂質(zhì)體載體。其中至少最小程度上溶解有蛋殼多肽的可藥用液態(tài)載體適于表 面應(yīng)用。其他可以是合適的制備方法包括將組合物應(yīng)用于聚乙烯醇海綿上。治療的劑量和持續(xù)時(shí)間取決于多種因素，包括疾病類型、患者年齡、患者體重等。 基于能夠達(dá)到在體外模型、體內(nèi)模型和臨床試驗(yàn)中顯示有效的濃度來(lái)選擇初始劑量水平， 最高至最大耐受水平。可由專業(yè)臨床醫(yī)生根據(jù)上述因素，利用標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)方法來(lái)確定針對(duì) 特定患者的特定組合物的劑量和治療持續(xù)時(shí)間。通過(guò)分析血液或體液水平或者在相關(guān)組織 中的水平或者監(jiān)視患者體內(nèi)的疾病狀態(tài)來(lái)對(duì)治療效果進(jìn)行監(jiān)控。專業(yè)臨床醫(yī)生將基于這些 檢測(cè)所反映的對(duì)治療之響應(yīng)來(lái)調(diào)整治療的劑量和持續(xù)時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于口服 施用來(lái)說(shuō)，施用5至IOOOmg蛋殼多肽，特別是50至150mg蛋殼多肽。本發(fā)明將通過(guò)以下非限定性實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步舉例說(shuō)明。實(shí)施例1 蛋殼制備購(gòu)買市售新鮮雞蛋，打開(kāi)，倒出除去雞蛋內(nèi)容物。隨后將蛋殼分成兩種不同的組 織，包含鈣化層的硬組織(具有柵狀層和乳頭層的硬蛋殼)以及包含蛋殼內(nèi)膜和蛋殼外膜 (膜層)的軟組織。使用幾種不同的多肽提取方法，對(duì)于蛋殼的硬組織使用4種方法，對(duì)于軟組織使 用1種方法。實(shí)施例2 硬蛋殼組織多肽提取方法1將硬蛋殼組織用水清洗，在研缽中搗碎，得到白色粉末。將粉末干燥過(guò)夜。隨后， 將1. 77g粉末溶于700 μ 1含有蛋白酶抑制劑的還原性SDS緩沖液(15%甘油、25mM TRIS/ HCl (pH 7. 5),2% SDSU % DTT)中，并攪拌1.5小時(shí)。接著加入700 μ 1還原性SDS緩沖液， 并再攪拌1小時(shí)。隨后，將混合物加熱到95°C 5分鐘，并進(jìn)行超聲浴處理10分鐘。重復(fù)該 方法3次。隨后，將樣品孵育過(guò)夜。第二天，將混合物于13，OOOXg離心5分鐘。小心地移 去上清液，并利用3kDa超濾作用濃縮至130 μ 1。為了沉淀多肽，用1. 2ml冰凍丙酮稀釋樣 品，并于4°C孵育過(guò)夜。隨后將沉淀溶于50μ 1 3倍還原性SDS緩沖液中，并進(jìn)行SDS-PAGE。實(shí)施例3 硬蛋殼組織多肽提取方法2 將硬蛋殼組織用水清洗，在研缽中搗碎，得到白色粉末。將粉末干燥過(guò)夜。隨后，將 1. Og該粉末溶于300 μ 1 3倍還原性SDS緩沖液和300ml 10%乙酸中，攪拌過(guò)夜。第二天， 將混合物于13，OOOXg離心5分鐘，隨后加入400 μ 13倍SDS還原性緩沖液，并攪拌30分 鐘。隨后，將混合物加熱到95°C 5分鐘，進(jìn)行超聲浴處理10分鐘，以13，OOOXg離心5分鐘。 小心地移去上清液，并利用3kDa超濾作用濃縮至20 μ 1。再進(jìn)行一次離心步驟(13，OOOXg, 5分鐘)后，將上清液用于SDS-PAGE。實(shí)施例4 硬蛋殼組織多肽提取方法3將0. 8mg硬蛋殼組織粉末溶于700 μ 1 5% EDTA中，并在溫和振蕩下于4°C孵育30 分鐘。隨后加入1300μ1 10%乙酸。將混合物孵育過(guò)夜。第二天，將混合物于14，000 Xg 離心5分鐘。小心地移去上清液，并用250ml 5%乙酸鈉緩沖液(pH 8.5)透析4X30分鐘。 隨后將溶液冷凍干燥，得到白色粉末。實(shí)施例5:硬蛋殼組織
將硬蛋殼組織用水清洗，在研缽中搗碎，得到白色粉末。將粉末干燥過(guò)夜。隨后， 將IOOg粉末溶于35ml 50%乙酸中，并攪拌過(guò)夜。第二天，加入50ml 50%乙酸，并再攪拌 4小時(shí)。隨后加入IOml水，孵育過(guò)夜。第二天加入IOml水，將混合物于14，OOOXg離心5 分鐘。小心地移去上清液，并進(jìn)行冷凍干燥，得到白色粉末。實(shí)施例6 軟蛋殼組織多肽提取方法由2個(gè)新鮮雞蛋制備蛋殼膜(軟組織)并從鈣化層中完全移除。用PBS徹底清洗 蛋殼膜。隨后將其冷凍于_80°C。在下面的方案中，將兩個(gè)樣品分開(kāi)，但進(jìn)行相同的處理。 將其在研缽中搗碎，但是由于其具有類似紙的稠度，改用剪子將其剪成小片。隨后將其溶于 1.5ml緩沖液(25mM Tris/HCl(pH 8.9)，2M尿素)中。加入玻璃珠，用超聲儀處理膜(10X5 秒)。隨后混合物于室溫?cái)嚢?小時(shí)。重復(fù)該處理3次。隨后以13，000 Xg將其離心5分 鐘。小心地移去上清液，用于進(jìn)行Bradford測(cè)定和SDS-PAGE。將上清液進(jìn)行冷凍干燥，得 到純的蛋白質(zhì)粉末。實(shí)施例7 利用SDS-PAGE分析硬蛋殼多肽和軟蛋殼多肽利用下面的技術(shù)分析和鑒定硬蛋殼組織和軟蛋殼組織凍干物的多肽。SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)利用SDS-PAGE分離蛋殼多 肽。將樣品在還原性樣品緩沖液中稀釋和加熱，并點(diǎn)樣于4-20%的SDS-PAGE凝膠(BioRad) 上。隨后使凝膠在約150Vh下運(yùn)行。隨后用高度敏感的熒光染料Sypro Ruby對(duì)一些凝膠 進(jìn)行染色，用熒光掃描儀(Fuji FLA 3000)掃描，并用考馬斯亮藍(lán)復(fù)染。其余凝膠用銀進(jìn)行 染色。依照前述的不同方法制備硬蛋殼組織，點(diǎn)樣于SDS-PAGE(4-20%，BioRad)，并用 銀進(jìn)行染色。只有一塊凝膠顯示出直接凍干的多肽。在將樣品點(diǎn)樣于SDS-PAGE前，通過(guò) Bradford測(cè)定法測(cè)定多肽濃度，得出多肽的量在3_6mg/ml之間。對(duì)于硬蛋殼多肽制備品而言，利用4種不同的制備品，在SDS-PAGE凝膠上均未見(jiàn) 清晰的多肽條帶，盡管Bradford測(cè)定顯示較高的多肽濃度。不受理論的限制，相信樣品中 存在的多肽過(guò)少，以致于不能在SDS-PAGE上檢測(cè)到。與硬蛋殼多肽相反，軟蛋殼組織(蛋殼膜)多肽樣品顯示出所提取多肽的良好分布。實(shí)施例8 利用納級(jí)-LC-ESI-MSMS分析硬蛋殼多肽和軟蛋殼多肽納級(jí)-LC-ESI-MSMS在多維液相色譜系統(tǒng)(Ettan MDLC, GEHealthcare)中進(jìn)行 一維納級(jí)液相色譜(lD-nano-LC)分離。將多肽點(diǎn)樣于RPC捕獲柱上(點(diǎn)樣緩沖液0. 甲酸；捕獲柱C18P印Map 100，珠大小5 μ m，內(nèi)徑300 μ m，長(zhǎng)5mm，LC包裝)，流速為每分鐘 6μ1，并隨后以120分鐘的線性梯度(Α:0.1%甲酸；B:84%ACN和0.1%甲酸)U 260nl/ min的流速通過(guò)分析柱(C18P印Map 100，珠大小3 μ m，內(nèi)徑75 μ m，長(zhǎng)15cm, LC Packings) 進(jìn)行分離。所述梯度如下:0-30% B 80分鐘，30-60% B 30分鐘，60-100% B 10分鐘。在與納級(jí)-LC系統(tǒng)在線相連的線性離子阱質(zhì)譜儀(Thermo LTQ, Thermo Electron) 上進(jìn)行質(zhì)譜。對(duì)于電噴霧電離而言，使用末端涂布的Silica Tip(FS-360-50-15-D-20)和 1. 4kV的針電壓。MS方法包括一次全MS掃描(質(zhì)量范圍300-2000m/z)和3次數(shù)據(jù)依賴 性MS/MS事件(35%碰撞能量)組合的循環(huán)。動(dòng)態(tài)排除設(shè)定為30s。用碘乙酰胺將10 μ 1蛋殼軟組織多肽提取物還原、烷基化，并用胰蛋白酶于37°C消化過(guò)夜。將10 μ 1樣品用于進(jìn)行納級(jí)-LC-ESIMSMS。隨后利用MASCOT軟件在IPI雞數(shù)據(jù) 庫(kù)和Decoy-IPI雞數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索MSMS譜。這對(duì)于觀察哪個(gè)命中結(jié)果(hit)是顯著性的以 及何時(shí)達(dá)到顯著性臨界值(第一次隨機(jī)命中結(jié)果出現(xiàn)的時(shí)刻)具有優(yōu)勢(shì)。該步驟比依賴于 數(shù)據(jù)庫(kù)大小、修正數(shù)量和其他因素的單一 Mascot分?jǐn)?shù)要精確得多。蛋殼軟組織(蛋殼膜)多肽的LC-ESI-MSMS的MASCOT搜索結(jié)果1.卵白蛋白 SEQ ID NO 1 (gi | 45383974 | ref | NP_990592. 1)2.卵轉(zhuǎn)鐵蛋白 SEQ ID NO 2 (gi | 7578511 emb | CAA26040. 11)3. 78KDa蛋白質(zhì)組蛋白-精氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT7 SEQ ID NO 27(gi|82233719|sp|Q5ZIB9. 1)4. 78KDa蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-谷氨酰胺Y _谷氨酰轉(zhuǎn)移酶SEQ ID NO 28(gi|62903517|sp|Q01841. 3)5.78KDa 蛋白質(zhì) L印recan 樣 1 SEQ ID NO 29 (gi | 48374055 | ref | NP_001001530. 1)6. 105KDa 蛋白 質(zhì)伴肌動(dòng)蛋白(nebul in) SEQ ID NO: 20 (gi111559266|dbjIBAB18735. 1)7.卵白蛋白相關(guān)蛋白 Y SEQ ID NO 4 (gi 1118086485 | ref | XP_418984. 2)8. 52KDa 蛋白質(zhì)卵抑制劑(ovoinhibitor)SEQ ID NO 19 (gi | 71895337 | ref | ΝΡ_0 01025783. 1)9.卵類粘蛋白 SEQ ID NO :3(gi 1162952006 | ref | NP_001106132. 1)10.卵白蛋白相關(guān)蛋白SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白，或骨粘連蛋白 (Osteonectin))SEQ ID NO 32 (gi|548972|sp|P36377. 11)11.卵糖蛋白(Ovoglycoprotein)SEQ ID NO 5 (gi | 45383093 | ref | NP_989872. 1)12.溶菌酶 C SEQ ID NO 6 (gi | 45384212 | ref | NP_990612. 1)13. 28kDA 蛋白質(zhì)載脂蛋白前體 SEQ ID NO 33 (gi | 211146 | gb |AAA48592. 11)a.載脂蛋白 SEQ ID NO 34 (gi | 211154 | gb | AAA48595. 1)14.卵粘蛋白 α SEQ ID NO :7 (gi 112583679 | dbj | ΒΑΒ21488. 1)15. H印-21 蛋白 SEQ ID NO 8 (gi | 453831311 ref | NP_989852. 1)16. Ovocleidin 17 SEQ ID NO :9 (gi11087046|gb|AAB35101. 1)a. SEQ ID NO10(gi|32699622|sp|Q9PRS8. 2)b.SEQ ID NO :11 (gi | 31615312 |pdb 11GZ2 | A)17. 164KDa 蛋白質(zhì) M-蛋白，橫紋肌 SEQ ID NO 21 (gi | 547919 | sp | Q02173. 1)18. 49KDa 蛋白質(zhì)叢生蛋白 SEQ ID NO 12 (gi | 45382467 | ref | NP_990231. 1)19.卵固蛋白 SEQ ID NO 13 (gi 11683350 | gb | AH004621. 1)20. 18KDa蛋白質(zhì)胰島素樣生長(zhǎng)因子II SEQ ID NO 22 (giI 226693533|sp|P33717. 2)21. 8KDa 蛋白質(zhì)胰島素樣生長(zhǎng)因子 1 SEQ ID NO 23 (gi | 521386711 ref | NP_00100 4384. 1)22. *KDA 蛋白質(zhì) fowlicidin-1 SEQ ID NO 24 (gi | 242346718 | gb | ACS92527. 1)23. 3^(Da 蛋白質(zhì) WD 重復(fù)結(jié)構(gòu)域 82 假基因 1 SEQ ID NO 25 (gi | 57524933 | ref | NP_001006135. 1)24. 34KDa蛋白質(zhì)磺基轉(zhuǎn)移酶家族胞質(zhì)蛋白(cytosolic) IB成員ISEQ ID NO: 26 (giI 57013083|sp|Q8JG30. 1)25.卵粘蛋白 β SEQ ID NO :30 (gi | 48147235 | dbj | BAD22545. 1)26.NTF-3 蛋白(Neurotropin-3) SEQ ID NO 15 (gi | 6175082 | sp | Q91044. 2)27. XI 型膠原 SEQ ID NO 14 (gi | 63249 | emb | CAA23688. 1)28.半胱氨酸蛋白酶抑制劑 SEQ ID NO 16 (gi 1118195 | sp | P01038. 2)29. Gallinacin-Il SEQ ID NO 31 (gi | 82173548 | sp | Q6IV20. 1)硬蛋殼多肽1. Ovocleidin-116 SEQ ID NO 18 (gi|453830411ref|NP_989900. 1)2.叢生蛋白 49kDa SEQ ID NO 12 (gi | 45382467 | ref | NP_990231. 1)a. SEQ ID NO 35 (gi | 4325105 | gb | AAD17257. 11)3.0vocleidin-17 SEQ ID NO 11 (gi|31615312|pdb11GZ2)4. 0vocalyxin-32 SEQ ID NO 17 (gi|78100756|sp|Q90YI1. 1)實(shí)施例9 蛋殼多肽對(duì)成骨細(xì)胞活件的刺激作用測(cè)試了多肽凍干物(與經(jīng)高壓滅菌的蛋殼相比)對(duì)成骨細(xì)胞(骨形成細(xì)胞)的作用。在3種不同的溫度和/或時(shí)間周期下對(duì)蛋殼粉末進(jìn)行高壓滅菌(PO)。此外，從新 鮮蛋殼和凍干蛋殼中提取并分離蛋殼多肽。形成了 6組，用于細(xì)胞培養(yǎng)研究1.對(duì)照(無(wú)添加物)2. 0_1(于1371高壓滅菌)3. PO-II (于121°C標(biāo)準(zhǔn)高壓滅菌)4.擬-硬蛋殼多肽0.58/1 [HA=透明質(zhì)酸]5.硬蛋殼-多肽(低濃度0. 005g/l)6.硬蛋殼-多肽(高濃度0. 5g/l)7. PO-O (于 113 °C 高壓滅菌)對(duì)于所有5個(gè)測(cè)試組和1個(gè)對(duì)照組而言，用成骨細(xì)胞進(jìn)行5天的增殖研究。一周 和兩周后，利用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行另外的形態(tài)學(xué)比較。此外，2周后對(duì)I型膠原、骨粘連蛋白、 骨橋蛋白和骨鈣蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢查和評(píng)估。在5小時(shí)后以及1、2、3、4和5天后測(cè)定每個(gè)視野中的細(xì)胞計(jì)數(shù)，以研究所添加物 質(zhì)對(duì)牛成骨細(xì)胞增殖的影響。利用光學(xué)顯微鏡在100倍放大下進(jìn)行每天計(jì)數(shù)。4周齡成骨 細(xì)胞的增殖結(jié)果(取決于培養(yǎng)時(shí)間)顯示于圖1和2。圖2和3顯示，取決于所添加的物質(zhì)，在各細(xì)胞群體之間細(xì)胞計(jì)數(shù)的增加顯著不 同。培養(yǎng)5小時(shí)后，添加PO Mod. I,PO Mod. II、HA+硬蛋殼多肽0. 5g/l的條帶在未經(jīng)處理 培養(yǎng)基的范圍內(nèi)。與此相反，對(duì)于硬蛋殼多肽0. 005g/l和HA+硬蛋殼多肽0. 5g/l而言， 發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞計(jì)數(shù)略有增加。在第1天，與PO Mod. 11、撤+硬蛋殼多肽0.58/1和培養(yǎng)基相 比，硬蛋殼多肽0.5g/l的條帶顯示細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著增加(p<0.05)。相比而言，與硬蛋殼多 肽0. 005g/l和PO Mod. I相比，僅有細(xì)胞計(jì)數(shù)較高的趨勢(shì)。至第5天，用硬蛋殼多肽0. 5g/ 1處理之細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞計(jì)數(shù)增加了 7倍。除硬蛋殼多肽0. 005g/l外，新鮮硬蛋殼多肽0. 5g/l的細(xì)胞計(jì)數(shù)在第2、3、4和5天的時(shí)間時(shí)明顯超過(guò)了所有其他樣品(ρ < 0. 001)。 未經(jīng)處理培養(yǎng)基中的細(xì)胞計(jì)數(shù)持續(xù)增長(zhǎng)至第5天。在添加有HA+硬蛋殼多肽0.5g/l的樣 品中，在第3天至第5天期間僅觀察到細(xì)胞計(jì)數(shù)有極少增加。與兩個(gè)Putamen Ovi(PO)制備品相比，PO Mod. I的細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于PO Mod. II 的細(xì)胞計(jì)數(shù)。所研究物質(zhì)PO Mod. I,POII Mod. II、硬蛋殼多肽0. 005g/l、硬蛋殼多肽0. 5g/ 1、HA+硬蛋殼多肽0. 5g/l和培養(yǎng)基的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和顯著性水平。以用硬蛋殼多肽 0. 5g/l處理的細(xì)胞培養(yǎng)基作為參考，用于舉例說(shuō)明增殖的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。測(cè)試組PO-O與其余顯著不同。盡管對(duì)于增殖結(jié)果來(lái)說(shuō)，其具有比對(duì)照更好的趨 勢(shì)，但是與于137°C高壓滅菌的樣品相比較差。在增殖期中，含有較高硬蛋殼多肽濃度和經(jīng)較低溫度高壓滅菌之PO的細(xì)胞增殖 和分化最為強(qiáng)烈。用透明質(zhì)酸和硬蛋殼多肽以及經(jīng)高溫高壓滅菌之PO進(jìn)行的替代并沒(méi)有 使細(xì)胞增殖或分化有任何顯著增加。對(duì)骨特異性基質(zhì)蛋白的合成研究表明，對(duì)于較高硬蛋 殼多肽濃度和經(jīng)較低溫度高壓滅菌之PO而言，I型膠原和骨橋蛋白的表達(dá)增加。對(duì)生物礦 化作用的分析表明，單獨(dú)的硬蛋殼多肽以及其與透明質(zhì)酸之組合均導(dǎo)致其產(chǎn)生比任何一種 PO制備品明顯更高的生物礦化作用和分化作用。結(jié)果表明，所添加的物質(zhì)P0、硬蛋殼多肽和透明質(zhì)酸對(duì)骨細(xì)胞反應(yīng)因素具有決定 性影響。特別是第一次表明了新鮮蛋殼多肽的高潛能。本文中已表明蛋殼多肽(例如新鮮蛋殼多肽)可以刺激骨細(xì)胞生長(zhǎng)并活化其代 謝。利用蛋殼多肽是一種刺激骨形成細(xì)胞和治療骨質(zhì)疏松癥及其他骨病的新作用模式。與 抑制破骨細(xì)胞的雙膦酸鹽不同，蛋殼多肽顯著刺激成骨細(xì)胞并輕微刺激破骨細(xì)胞。這使得 這兩種協(xié)同性骨細(xì)胞(成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞)的代謝水平較高，其中對(duì)成骨細(xì)胞的影響較 大。另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是沒(méi)有已知的與施用蛋殼多肽相關(guān)的副作用或不良事件。骨用新鮮蛋殼多 肽處理比用雙膦酸鹽處理生長(zhǎng)得更快。實(shí)施例10 細(xì)胞增殖測(cè)定在本實(shí)施例以及后面的實(shí)施例中，使用下列樣品樣品A 新鮮蛋殼的蛋殼提取物(多種蛋白)0. 5g/L樣品B :0vocleidin-16 和 Ovocleidin-117 0. 5g/L樣品C 叢生蛋白(硫酸化糖蛋白2)和0vocalyxin-32 0. 5g/L進(jìn)行細(xì)胞增殖測(cè)定，以研究3種不同的未知蛋白樣品(A、B、C和B+C，以不含蛋白 作為對(duì)照)在體外對(duì)原代牛成骨細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響。對(duì)于細(xì)胞增殖測(cè)定，將牛成骨細(xì)胞 樣細(xì)胞在添加有不同蛋白樣品A、B、C和B+C的匪If培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周。在不同培養(yǎng)基中 培養(yǎng)5小時(shí)和5天后，成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果表明，培養(yǎng)基中從5小時(shí)至5 天增加的細(xì)胞數(shù)目與所使用的培養(yǎng)基/添加蛋白無(wú)關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示)。細(xì)胞在亞匯合時(shí)接 種，培養(yǎng)5小時(shí)后表現(xiàn)出其大致立方形細(xì)胞的典型表型。培養(yǎng)5天后，細(xì)胞接近達(dá)到匯合，并 且部分開(kāi)始表現(xiàn)出其典型的鵝卵石樣外觀。當(dāng)細(xì)胞仍然處于亞匯合狀態(tài)且單個(gè)細(xì)胞周圍有 較大空間時(shí)，成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的大小和形狀不同，并且表型從立方形/圓形至紡綞狀變化。圖4顯示利用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)系統(tǒng)測(cè)定的培養(yǎng)5天后細(xì)胞的數(shù)目。樣品A和B顯示比 對(duì)照培養(yǎng)基(MMlf)低的細(xì)胞增殖結(jié)果(約25%)，而樣品C和B+C顯示較高的細(xì)胞數(shù)目。 添加有蛋白樣品C的培養(yǎng)基產(chǎn)生了 2倍于添加有樣品A或B之培養(yǎng)基的細(xì)胞。這些結(jié)果也與其他手工細(xì)胞計(jì)數(shù)方法所得到的結(jié)果相一致。除分析細(xì)胞數(shù)目外，還可通過(guò)庫(kù)爾特計(jì)數(shù)系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞大小的偏離情況。圖5顯 示在匪If培養(yǎng)基(作為對(duì)照)以及添加有蛋白樣品A、B、C和B+C的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天后 成骨細(xì)胞的平均細(xì)胞大小。如圖6顯示，與培養(yǎng)基無(wú)關(guān)，培養(yǎng)5天后原代成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞大小大于 17 μ m0但是也可以看出區(qū)別，添加有蛋白樣品C和B+C的培養(yǎng)基產(chǎn)生了與對(duì)照細(xì)胞(在 MMlf培養(yǎng)基中)相比較小的細(xì)胞。而在添加有蛋白樣品A的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的成骨細(xì)胞樣細(xì) 胞的細(xì)胞大小是18. 77 μ m,比MMlf中的高得多。蛋白樣品B似乎也使得細(xì)胞大小增加，但 是小于蛋白樣品A。為了研究所添加的蛋白樣品對(duì)細(xì)胞增殖的影響，將細(xì)胞培養(yǎng)于不同的培養(yǎng)基中并 測(cè)定細(xì)胞的數(shù)目。分別培養(yǎng)5小時(shí)、1天、2天、3天、4天和5天后，通過(guò)利用相差光學(xué)顯微鏡 對(duì)圖像不同區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)計(jì)算細(xì)胞/圖像。利用軟件程序Image J進(jìn)行分析。 5天的培養(yǎng)時(shí)間中所測(cè)定之細(xì)胞數(shù)量(細(xì)胞/圖像)的平均值顯示于圖7中。標(biāo)準(zhǔn)偏差和 P值列于下面表ι中。培養(yǎng)5小時(shí)后，細(xì)胞數(shù)目的平均值全部在相同范圍內(nèi)。第1天時(shí)，在所有所用培 養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)目均增加?？梢杂^察到在經(jīng)添加的培養(yǎng)基中細(xì)胞較多的微弱趨勢(shì)(P> 0. 05)。培養(yǎng)5小時(shí)后，經(jīng)添加的培養(yǎng)基中所計(jì)數(shù)細(xì)胞的平均值與MMlf培養(yǎng)基中細(xì)胞的平 均值大致相等。1天后，在MMlf中和添加有樣品A之MMlf中培養(yǎng)的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目的增加 略高于其他培養(yǎng)基。添加有樣品C的培養(yǎng)基顯示最低的增加量，其細(xì)胞數(shù)目?jī)H增加7%，而 在MMlf中則增加32%。在2天和3天后，所有培養(yǎng)基均顯示細(xì)胞數(shù)目大量增加。添加有 蛋白C(380%)和添加有樣品B+C(320%)的培養(yǎng)基分別顯示出從第2天至第3天細(xì)胞數(shù) 目增加的最高值。5天后，MMlf和添加有樣品B的培養(yǎng)基顯示細(xì)胞數(shù)目少量增加。相比而 言，添加有樣品A的培養(yǎng)基中細(xì)胞數(shù)目增加較多，這不能得到庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀結(jié)果的支持。分 別添加有樣品C和樣品B+C之培養(yǎng)基中的細(xì)胞增長(zhǎng)與用作對(duì)照的MMlf培養(yǎng)基明顯不同，對(duì) 于樣品C而言具有高顯著性(ρ < 0. 01)，對(duì)于樣品B+C而言差異最顯著(ρ < 0. 001)。表1被測(cè)蛋白A、B、C、B+C和匪If培養(yǎng)基(作為對(duì)照)對(duì)細(xì)胞增殖影響的平均值、 標(biāo)準(zhǔn)偏差和P值概覽。顯著性最高的數(shù)值標(biāo)為紅色(P < 0. 5 =顯著，P <0.01 =高度顯 著，ρ < 0. 001 =最顯著)
權(quán)利要求
1.一種刺激成骨細(xì)胞活性的方法，包括使成骨細(xì)胞與包含來(lái)自蛋殼之多肽提取物的組 合物相接觸，其中所述多肽提取物分離自硬蛋殼組織、軟蛋殼組織或其組合。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋殼是新鮮蛋殼。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋殼來(lái)自已受精或未受精的蛋。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述來(lái)自硬蛋殼組織的多肽提取物通過(guò)用l-25wt%的SDS 和任選地1-60%體積/體積的乙酸處理硬蛋殼組織來(lái)分離。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述來(lái)自硬蛋殼組織的多肽提取物包含Ovocleidin、 Ovocalyxin或叢生蛋白。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述來(lái)自軟蛋殼組織的多肽提取物通過(guò)用包含2至IOM尿 素且PH值為7. 0-9. 0的溶液處理軟蛋殼組織來(lái)分離。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述來(lái)自軟蛋殼組織的多肽提取物包含卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵 蛋白前體、78kDa多肽(卵轉(zhuǎn)鐵蛋白家族)、l(^kDa多肽(卵轉(zhuǎn)鐵蛋白家族)、卵白蛋白相 關(guān)多肽Y、52kDa多肽(卵抑制劑，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白)、卵類粘蛋白前體、與卵白蛋白 相關(guān)蛋白Y類似的SERPINB11、卵糖蛋白前體、溶菌酶C前體、28kDa多肽、卵粘蛋白α亞 基、H印21蛋白前體、0vocleidin-17、164kDa多肽、叢生蛋白49多肽、卵固蛋白前體、WkDa 多肽、8kDa多肽、35kDa多肽、34kDa多肽、α -1 (XI型)膠原同工型、ΝΤ-3生長(zhǎng)因子受體的 α -KT同工型、半胱氨酸蛋白酶抑制劑前體、SPARC多肽，它們的活性片段，或者包含一種或 多種上述物質(zhì)的活性級(jí)分。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述成骨細(xì)胞位于哺乳動(dòng)物對(duì)象的損傷部位，并且其中接 觸包括通過(guò)注射施用至所述損傷部位。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述來(lái)自蛋殼的多肽提取物以0.0001g/L至2g/L的濃度存在。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述來(lái)自蛋殼的多肽提取物以0.005g/L至0. 5g/L的濃度 存在。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述成骨細(xì)胞存在于離體培養(yǎng)物中。
12.權(quán)利要求1的方法，其中使成骨細(xì)胞接觸包括將所述組合物施用于需要修復(fù)軟骨 的個(gè)體。
13.權(quán)利要求1的方法，其中使成骨細(xì)胞接觸包括骨內(nèi)注射或局部施用。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述骨內(nèi)注射或局部施用用于椎體后凸成形術(shù)、脊椎成 形術(shù)、骨折部位或者骨或關(guān)節(jié)缺陷中。
15.一種在有此需要的個(gè)體中刺激成骨和/或骨誘導(dǎo)活性的方法，其包括對(duì)該個(gè)體施 用包含來(lái)自蛋殼的多肽提取物的組合物，其中所述多肽提取物分離自硬蛋殼組織、軟蛋殼 組織或其組合。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述蛋殼是新鮮蛋殼。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述蛋殼來(lái)自已受精或未受精的蛋。
18.權(quán)利要求15的方法，其中所述來(lái)自硬蛋殼組織的多肽提取物通過(guò)用包含l-25wt% 的SDS和任選地1-60%體積/體積的乙酸的溶液處理硬蛋殼組織來(lái)分離。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述來(lái)自硬蛋殼組織的多肽提取物包含Ovocleidin、 Ovocalyxin或叢生蛋白。
20.權(quán)利要求15的方法，其中所述來(lái)自軟蛋殼組織的多肽提取物通過(guò)用包含2至IOM 尿素且PH值為7. 0-9. 0的溶液處理軟蛋殼組織來(lái)分離。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述來(lái)自軟蛋殼組織的多肽提取物包含卵白蛋白、卵轉(zhuǎn) 鐵蛋白前體、78kDa多肽(卵轉(zhuǎn)鐵蛋白家族)、105kDa多肽(卵轉(zhuǎn)鐵蛋白家族)、卵白蛋白相 關(guān)多肽Y、52kDa多肽(卵抑制劑，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白)、卵類粘蛋白前體、與卵白蛋白 相關(guān)多蛋白Y類似的SERPINB11、卵糖蛋白前體、溶菌酶C前體、28kDa多肽、卵粘蛋白α亞 基、H印21蛋白前體、0vocleidin-17、164kDa多肽、叢生蛋白49多肽、卵固蛋白前體、WkDa 多肽、8kDa多肽、35kDa多肽、34kDa多肽、α -1 (XI型)膠原同工型、ΝΤ-3生長(zhǎng)因子受體的 α -KT同工型、半胱氨酸蛋白酶抑制劑前體、SPARC多肽，它們的活性片段，或者包含一種或 者多種上述物質(zhì)的活性級(jí)分。
22.權(quán)利要求15的方法，其中所述個(gè)體需要治療骨病。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述骨病是骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少癥、成骨不全癥、或佩 吉特病、骨軟化癥、骨石化癥、奧斯古德-施萊特病、骨痛退化癥、反射性交感神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良 綜合征(復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征)、暫時(shí)性骨質(zhì)疏松、無(wú)血管性壞死、骨壞死、骨軟骨病變、 溶骨性病變、骨腫瘤或者骨折。
24.權(quán)利要求15的方法，其中所述施用包括口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或鼻內(nèi)施用。
25.權(quán)利要求15的方法，其中所述個(gè)體需要修復(fù)軟骨。
26.一種在有此需要的個(gè)體中刺激血細(xì)胞生成的方法，包括對(duì)所述個(gè)體施用包含來(lái)自 蛋殼之多肽提取物的組合物，其中所述多肽提取物分離自硬蛋殼組織、軟蛋殼組織或其組 合
27.權(quán)利要求沈的方法，其中所述個(gè)體需要治療貧血以及相關(guān)的骨髓和血液疾病。
28.一種在有此需要的個(gè)體中刺激軟骨形成和/或分化的方法，包括對(duì)該個(gè)體施用包 含來(lái)自蛋殼之多肽提取物的組合物，其中所述多肽提取物分離自硬蛋殼組織、軟蛋殼組織 或其組合。
29.一種在有此需要的個(gè)體中刺激成纖維細(xì)胞的方法，其包括對(duì)所述個(gè)體施用包含來(lái) 自蛋殼之多肽提取物的組合物，其中所述多肽提取物分離自硬蛋殼組織、軟蛋殼組織或其組合。
30.用1至25wt%的SDS和任選地1至60%體積/體積的乙酸處理硬蛋殼組織之方法 的產(chǎn)物。
31.權(quán)利要求30的產(chǎn)物，包含Ovocleidin、Ovocalyxin或叢生蛋白。
32.用包含2至IOM尿素且pH值為7.0-9. 0的溶液處理軟蛋殼組織之方法的產(chǎn)物。
全文摘要
本文中鑒定了雞蛋殼的活性組分，其在離體研究中顯示出對(duì)造骨細(xì)胞(成骨細(xì)胞)具有刺激作用。該物質(zhì)是從蛋殼分離的多肽混合物。本文中已發(fā)現(xiàn)，包含蛋殼多肽的組合物刺激成骨細(xì)胞，并且具有骨誘導(dǎo)/成骨特性、血細(xì)胞生成特性以及軟骨生成或分化特性。該蛋殼多肽提取物可以局部或者全身施用。
文檔編號(hào)A61K35/54GK102149394SQ200980135310
公開(kāi)日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2009年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月10日
發(fā)明者伊蘭·埃利亞斯 申請(qǐng)人:伊蘭·埃利亞斯