本發(fā)明涉及海洋生物制品的高值化開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種海洋低溫超氧化物歧化酶提取分離工藝。

背景技術(shù)：

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，ecl.15.1.1，簡稱sod)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶，能夠催化超氧陰離子自由基和氫離子反應(yīng)形成過氧化氫和分子氧，從而清除生物體內(nèi)的氧自由基，起到保護生物體免受傷害作用。1969年mccord和fridovich發(fā)現(xiàn)該酶生物催化活性并命名為超氧化物歧化酶。按其結(jié)合的金屬種類不同，可將其分為三類：一類是藍(lán)綠色的cu,zn-sod，相對分子量約32000，主要存在于真核細(xì)胞的胞液和葉綠體中，是目前研究最多、最深入的一類；第二類是紫紅色的mn,fe-sod，相對分子量約40000，主要存在于原核生物細(xì)胞及線粒體的基質(zhì)中；第三類是黃褐色的fe-sod，相對分子量約為38700，主要存在于原核細(xì)胞及一些植物中。

sod作為生物酶制劑，醫(yī)療上主要用于輔助放療與化療，腎、肝、心臟等器官的保護和移植，消除輻射引起的副作用，以及作為某些疾病的探針等；食品工業(yè)作為添加劑應(yīng)用于飲料和啤酒等。近年來sod被廣泛用于治療氧中毒、老年性白內(nèi)障、糖尿病、心血管疾病、各種炎癥等多種疾病。幾十年來sod一直是國內(nèi)外研究熱點，起初階段多集中于從動物血液或組織中提取sod，到中期階段微生物發(fā)酵生產(chǎn)sod的研究開始起步并日漸增多，到目前為止微生物生產(chǎn)sod已然成為研究的主體。但多為中、高溫sod，最適作用溫度一般在45℃以上，而人體的生理溫度一般為36.5～37℃，致使微生物發(fā)酵生產(chǎn)的中、高溫sod不能充分發(fā)揮作用，出現(xiàn)治療效果差或沒有效果。低溫sod最適作用溫度一般為35～40℃，比較接近人體的生理溫度，應(yīng)用于治療效果比較明顯。但低溫sod產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)及應(yīng)用還未見報道。鑒于動物血液來源困難及微生物發(fā)酵生產(chǎn)的中、高溫sod最適作用溫度的局限性，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫sod具有很大的應(yīng)用優(yōu)勢。低溫sod在自然環(huán)境溫度下具有高酶活力及高催化效率,且對熱敏感，經(jīng)過溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，如果將sod應(yīng)用于食品工業(yè)從而大大縮短處理過程的時間并省卻昂貴的加熱或冷卻費用，且不影響產(chǎn)品品質(zhì)，這將有助于低溫sod的推廣和使用。可從根本上擺脫繁瑣的提取工藝及中、高溫酶的加熱、冷卻設(shè)備和流程，在提高得率及酶活性的同時降低能耗及生產(chǎn)成本。鑒于低溫sod在自然和生理條件下的優(yōu)勢，低溫sod在醫(yī)療保健、食品、化妝品等方面擁有更加廣泛的應(yīng)用前景和開發(fā)潛力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種海洋低溫超氧化物歧化酶的提取分離工藝，以微生物為原料進行發(fā)酵，生產(chǎn)周期短，操作簡單，便于保存和運輸，且生產(chǎn)成本低，不易霉變和蟲蛀，安全性及穩(wěn)定性高，產(chǎn)品得率高，易于規(guī)?；a(chǎn)，具有廣泛應(yīng)用前景。

本發(fā)明通過以下方法實現(xiàn)，提供一種海洋低溫超氧化物歧化酶的提取分離工藝，利用海洋細(xì)菌菌體提取純化低溫超氧化物歧化酶。

所述的海洋低溫超氧化物歧化酶的提取分離工藝過程是：將海洋細(xì)菌破壁離心得到粗酶液，經(jīng)硫酸銨沉淀、超濾濃縮，sephadexg-100柱層析、噴霧干燥，得到外觀微帶淺藍(lán)綠色、酶活力576.83u/mg的低溫超氧化物歧化酶。

上述的海洋低溫超氧化物歧化酶的提取分離工藝，所述粗酶液的制備方法為：通過無菌操作，將活化好的海樣菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于20℃，160r/min發(fā)酵48h，發(fā)酵菌液于4℃，6000r/min離心30min，得到濕菌體，4℃，6000r/min離心30min，濕菌體用磷酸緩沖液溶解，于480w超聲波冰浴下破碎30min(破碎5s，間隔5s)，破碎后，4℃，12000r/min離心15min，上清即為粗酶液，上述液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方百分比為：葡萄糖2.0，酵母膏0.5，陳海水配制，ph自然。

上述的海洋低溫超氧化物歧化酶的提取分離工藝，所述硫酸銨沉淀的方法為：制備6份25ml粗酶液，分別向其中加入固體冷硫酸銨，使其飽和溶液濃度分別20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，4℃鹽析16h，ph7.8磷酸緩沖液溶解沉淀蛋白，確定低溫超氧化物歧化酶活性最高硫酸銨鹽析條件。

所述冷硫酸銨是將硫酸銨冷至-20℃。

上述的海洋低溫超氧化物歧化酶的提取分離工藝，所述超濾濃縮方法為：將鹽析完成樣品轉(zhuǎn)入經(jīng)過預(yù)處理的截留分子量10kda超濾管，4℃，6000r/min，超濾30min，去除so4^2-和部分小分子蛋白，移液槍小心取出濃縮液，4℃，保藏備用，部分溶于磷酸緩沖液，測定低溫超氧化物歧化酶酶活力，計算蛋白回收率。

上述的海洋低溫超氧化物歧化酶的提取分離工藝，所述sephadexg-100柱層析方法為：用ph7.8磷酸緩沖液平衡sephadexg-100凝膠柱，待基線平衡后，取2ml超濾后酶液加入ph7.8磷酸緩沖液平衡過的sephadexg-100凝膠柱(ф1.6cm×60cm)，調(diào)節(jié)設(shè)置自動收集器，每管收集2ml左右。根據(jù)顯示器上的洗脫峰，確定含sod酶各管，收集并測定其酶活力，合并含酶活力各管，4℃，保藏備用。

上述的海洋低溫超氧化物歧化酶的提取分離工藝，所述噴霧干燥的參數(shù)設(shè)置為進口溫度110℃、出口溫度為60℃、壓力位2kgf/cm²、液體流速為5ml/min。

上述的海洋低溫超氧化物歧化酶的提取分離工藝，所述噴霧干燥中的保護劑中海藻糖、蔗糖、海藻酸鈉的用量為2％-5％，可溶性淀粉的用量為6％-8％，保護劑的總用量控制在10％以內(nèi)。

上述的海洋低溫超氧化物歧化酶的提取分離工藝，所述海洋細(xì)菌為海黏假交替單胞菌、海假交替單胞菌、棲珊瑚假交替單胞菌。

附圖說明

圖1為本發(fā)明海洋低溫超氧化物歧化酶分離純化結(jié)果；

圖2為本發(fā)明海洋低溫超氧化物歧化酶聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果；

圖3為本發(fā)明海洋低溫超氧化物歧化酶酶類型鑒定結(jié)果。

具體實施方式

結(jié)合具體實施方式對說明書做進一步說明。

實施例1

所述的一種海洋低溫超氧化物歧化酶的提取分離工藝，包括以下步驟：

1.粗酶液的制備：1l海洋細(xì)菌海黏假交替單胞菌pseudoalteromonasmariniglutinosa(編號：1.8476，中科院微生物研究所菌種保藏中心)發(fā)酵液得到50克酵母菌菌泥，用蒸餾水洗滌2-3次，4℃，6000r/min離心30min，得到濕菌體，4℃，6000r/min離心30min，濕菌體用磷酸緩沖液溶解，于480w超聲波冰浴下破碎30min(破碎5s，間隔5s)，破碎后，4℃，12000r/min離心15min，上清即為粗酶液，上述液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方百分比為：葡萄糖2.0，酵母膏0.5，陳海水配制，ph自然。

2.硫酸銨沉淀：制備6份25ml粗酶液，分別向其中加入固體冷硫酸銨，使其飽和溶液濃度分別20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，4℃鹽析16h，ph7.8磷酸緩沖液溶解沉淀蛋白，確定sod活性最高硫酸銨鹽析條件。

3.超濾濃縮：將鹽析完成樣品轉(zhuǎn)入經(jīng)過預(yù)處理的截留分子量10kda超濾管，4℃，6000r/min，超濾30min，去除so4^2-和部分小分子蛋白，移液槍小心取出濃縮液，4℃，保藏備用，部分溶于磷酸緩沖液，測定低溫超氧化物歧化酶酶活力，計算蛋白回收率。

4.sephadexg-100柱層析：用ph7.8磷酸緩沖液平衡sephadexg-100凝膠柱，待基線平衡后，取2ml超濾后酶液加入ph7.8磷酸緩沖液平衡過的sephadexg-100凝膠柱(ф1.6cm×60cm)，調(diào)節(jié)設(shè)置自動收集器，每管收集2ml左右。經(jīng)蛋白含量測定和低溫超氧化物歧化酶酶活性測定，將含低溫超氧化物歧化酶活性高的洗脫液合并，即可得到高活力的低溫超氧化物歧化酶酶液20ml，總酶活為576.83u/mg。最后用聚丙酰胺凝膠電泳鑒定超氧化物歧化酶的酶純度，結(jié)果見圖2；經(jīng)酶類型鑒定為銅鋅超氧化物歧化酶，結(jié)果見圖3。

5.噴霧干燥：其參數(shù)設(shè)置為進口溫度110℃、出口溫度為60℃、壓力位2kgf/cm²、液體流速為5ml/min。噴霧干燥中的保護劑中海藻糖、蔗糖、海藻酸鈉的用量為2％-5％，可溶性淀粉的用量為6％-8％，保護劑的總用量控制在10％以內(nèi)。

實施例2

所述的一種海洋低溫超氧化物歧化酶的提取分離工藝，包括以下步驟：

1.粗酶液的制備：1l海洋細(xì)菌海假交替單胞菌pseudoalteromonasmarina(編號：1.10151，中科院微生物研究所菌種保藏中心)發(fā)酵液得到50克酵母菌菌泥，用蒸餾水洗滌2-3次，4℃，6000r/min離心30min，得到濕菌體，4℃，6000r/min離心30min，濕菌體用磷酸緩沖液溶解。于480w超聲波冰浴下破碎30min(破碎5s，間隔5s)。破碎后，4℃，12000r/min離心15min，上清即為粗酶液，上述液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方百分比為：葡萄糖2.0，酵母膏0.5，陳海水配制，ph自然。

2.硫酸銨沉淀：制備6份25ml粗酶液，分別向其中加入固體冷硫酸銨，使其飽和溶液濃度分別20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，4℃鹽析16h，ph7.8磷酸緩沖液溶解沉淀蛋白，確定低溫超氧化物歧化酶活性最高硫酸銨鹽析條件。

3.超濾濃縮：將鹽析完成樣品轉(zhuǎn)入經(jīng)過預(yù)處理的(截留分子量10kda)超濾管，4℃，6000r/min，超濾30min，去除so4^2-和部分小分子蛋白，移液槍小心取出濃縮液，4℃，保藏備用，部分溶于磷酸緩沖液，測定低溫超氧化物歧化酶酶活力，計算蛋白回收率。

4.sephadexg-100柱層析：用ph7.8磷酸緩沖液平衡sephadexg-100凝膠柱，待基線平衡后，取2ml超濾后酶液加入ph7.8磷酸緩沖液平衡過的sephadexg-100凝膠柱(ф1.6cm×60cm)，調(diào)節(jié)設(shè)置自動收集器，每管收集2ml左右。經(jīng)蛋白含量測定和低溫超氧化物歧化酶酶活性測定，將含低溫超氧化物歧化酶活性高的洗脫液合并，即可得到高活力的低溫超氧化物歧化酶酶液20ml，總酶活為576.83u/mg。最后用聚丙酰胺凝膠電泳鑒定超氧化物歧化酶的酶純度，結(jié)果見圖2；經(jīng)酶類型鑒定為銅鋅超氧化物歧化酶，結(jié)果見圖3。

5.噴霧干燥：其參數(shù)設(shè)置為進口溫度110℃、出口溫度為60℃、壓力位2kgf/cm²、液體流速為5ml/min。噴霧干燥中的保護劑中海藻糖、蔗糖、海藻酸鈉的用量為2％-5％，可溶性淀粉的用量為6％-8％，保護劑的總用量控制在10％以內(nèi)。

實施例3

所述的一種海洋低溫超氧化物歧化酶的提取分離工藝，包括以下步驟：

1.粗酶液的制備：1l海洋細(xì)菌棲珊瑚假交替單胞菌pseudoalteromonasparagorgicola(編號：1.10153，中科院微生物研究所菌種保藏中心)發(fā)酵液得到50克酵母菌菌泥，用蒸餾水洗滌2-3次，4℃，6000r/min離心30min，得到濕菌體，4℃，6000r/min離心30min，濕菌體用磷酸緩沖液溶解。于480w超聲波冰浴下破碎30min(破碎5s，間隔5s)。破碎后，4℃，12000r/min離心15min，上清即為粗酶液，上述液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方百分比為：葡萄糖2.0，酵母膏0.5，陳海水配制，ph自然。

2.硫酸銨沉淀：制備6份25ml粗酶液，分別向其中加入固體冷硫酸銨，使其飽和溶液濃度分別20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，4℃鹽析16h，ph7.8磷酸緩沖液溶解沉淀蛋白，確定低溫超氧化物歧化酶活性最高硫酸銨鹽析條件。

3.超濾濃縮：將鹽析完成樣品轉(zhuǎn)入經(jīng)過預(yù)處理的(截留分子量10kda)超濾管，4℃，6000r/min，超濾30min，去除so4^2-和部分小分子蛋白，移液槍小心取出濃縮液，4℃，保藏備用，部分溶于磷酸緩沖液，測定低溫超氧化物歧化酶酶活力，計算蛋白回收率。

4.sephadexg-100柱層析：用ph7.8磷酸緩沖液平衡sephadexg-100凝膠柱，待基線平衡后，取2ml超濾后酶液加入ph7.8磷酸緩沖液平衡過的sephadexg-100凝膠柱(ф1.6cm×60cm)，調(diào)節(jié)設(shè)置自動收集器，每管收集2ml左右。經(jīng)蛋白含量測定和低溫超氧化物歧化酶酶活性測定，將含低溫超氧化物歧化酶活性高的洗脫液合并，即可得到高活力的低溫超氧化物歧化酶酶液20ml，總酶活為576.83u/mg。最后用聚丙酰胺凝膠電泳鑒定超氧化物歧化酶的酶純度，結(jié)果見圖2；經(jīng)酶類型鑒定為銅鋅超氧化物歧化酶，結(jié)果見圖3。

5.噴霧干燥：其參數(shù)設(shè)置為進口溫度110℃、出口溫度為60℃、壓力位2kgf/cm²、液體流速為5ml/min。噴霧干燥中的保護劑中海藻糖、蔗糖、海藻酸鈉的用量為2％-5％，可溶性淀粉的用量為6％-8％，保護劑的總用量控制在10％以內(nèi)。

實施例4

低溫超氧化物歧化酶活性的測定

在試管中分別按照表1加入0.1mol/ltris-hcl緩沖液、雙蒸水、低溫超氧化物歧化酶酶液、10mmol/lhcl，于20℃恒溫20min后，在樣品管和對照管中加入20℃預(yù)熱過的鄰苯三酚(鄰苯三酚添加量以鄰苯三酚自氧化速率為0.07/min為基準(zhǔn))，迅速搖勻，立即用移液槍將樣品移入石英比色杯中，在波長325nm處每30s測定一次吸光值，共測3min，結(jié)果見圖1。

表1鄰苯三酚自氧化法測定低溫sod加樣表

v1：反應(yīng)液總體積，ml；v2：測定樣品體積，ml；n：樣品稀釋液倍數(shù)；

oda：鄰苯三酚自氧化速率；odb：樣品od值變化速率

實施例5

蛋白質(zhì)含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用bradford法，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線測定酶液蛋白質(zhì)含量。

①標(biāo)準(zhǔn)bsa溶液

②染料試劑：100mg考馬斯亮藍(lán)g-250，50ml乙醇(95％)，磷酸(85％)，用水稀釋成1l，過濾備用。

③按下表加入相應(yīng)試劑，5min測定595nm處吸光值。

表2蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護范圍。