本發(fā)明屬于基因工程領域，具體涉及一種特異性敲除二氫葉酸還原酶基因的sgrna序列及其應用。
背景技術：
：中國倉鼠卵巢細胞(chinesehamsterovarycell，cho細胞)是目前生產(chǎn)藥物蛋白最常用的宿主細胞，其表達產(chǎn)物在分子結構、理化性質和生物學功能等方面接近天然蛋白，被廣泛應用于抗體、重組蛋白藥物和疫苗等產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)中，提高cho細胞中表達產(chǎn)物的產(chǎn)量是研究者們長期的追求。二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase，dhfr)是一種催化5，6-二氫葉酸還原為5，6，7，8-四氫葉酸的蛋白酶，參與細胞內(nèi)的嘌呤代謝過程。當細胞株缺失了dhfr基因，將攜帶dhfr基因的表達載體轉染細胞，陽性細胞也就獲得了dhfr基因，此時在培養(yǎng)基中加入甲氨喋呤(methotrexate，mtx)，會導致dhfr基因擴增，連帶其兩側片段也得到相應擴增，可使目的基因的拷貝數(shù)增加幾百到幾千倍，從而達到目的基因的高效表達。因此，急需要敲除cho細胞株的dhfr基因，以提高外源基因蛋白表達量。crispr/cas9系統(tǒng)，是細菌和古細菌在進化過程中演變出來的一種用于抵御外來侵害的免疫入侵系統(tǒng)，在現(xiàn)代基因工程應用領域與talen(transcriptionactivator-likeeffectornuclease)以及zfn(zinc-fingernuclease)技術并列成為三大基因組編輯工具。crispr-cas9技術具有特異性dna識別能力，cas9核酸內(nèi)切酶在向導核糖核酸(guiderna，sgrna)引導下切割雙鏈dna，造成基因組雙鏈斷裂，利用細胞基因組修復的不穩(wěn)定性產(chǎn)生非特異重組來產(chǎn)生修復錯誤(插入或者缺失)，從而可能產(chǎn)生移碼突變而造成基因功能的喪失，實現(xiàn)基因敲除的目的。相比較于talen及zfn技術，其sgrna的設計和合成工作量遠遠小于talen和zfn識別模塊的構建過程，易于操作，而且毒性低、效率更高、更容易得到純合子突變體?，F(xiàn)有報道中，僅見sigma公司利用zfn技術敲除dhfr，構建dhfr-/-型的cho細胞系，細胞毒性較大。設計出特異性靶向敲除dhfr基因的sgrna，利用crispr-cas9系統(tǒng)構建dhfr-/-型的cho細胞系，對外源蛋白高效表達意義重大。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種sgrna序列及其應用。本發(fā)明提供了一種特異性敲除二氫葉酸還原酶基因的sgrna序列，序列如seqidno：3所示。本發(fā)明還提供了一種核苷酸序列，序列如seqidno：11所示。本發(fā)明還提供了一種重組質粒，它包括seqidno：3或11所示的序列。本發(fā)明還提供了上述序列在敲除二氫葉酸還原酶基因中的用途。本發(fā)明還提供了上述序列在制備二氫葉酸還原酶基因缺失細胞株中的用途。本發(fā)明還提供了一種用于敲除二氫葉酸還原酶基因的試劑盒，它包括上述sgrna序列或重組質粒。本發(fā)明還提供了一種敲除cho細胞中二氫葉酸還原酶基因的方法，它是利用crispr/cas9系統(tǒng)在cho細胞中對二氫葉酸還原酶基因進行改造，步驟如下：a、合成上述序列及其互補鏈，變性、退火，形成雙鏈；b、將步驟a制備的雙鏈插入到cas9表達載體的多克隆位點，得到重組表達質粒；c、將步驟b的重組表達載體轉染cho細胞，挑取單個細胞，接種培養(yǎng)；d、待單個細胞增殖為單克隆后，鑒定并確認cho細胞中的二氫葉酸還原酶基因被敲除，并獲得二氫葉酸還原酶基因缺失的cho細胞。其中，所述cho細胞為cho-s亞型細胞。其中，所述cas9表達載體為crispr/cas9載體。本發(fā)明還提供了上述方法制備得到的二氫葉酸還原酶基因缺失細胞株。本發(fā)明提供的特異性靶向敲除二氫葉酸還原酶基因的sgrna，能夠引導cas9快速、高效、特異性敲除cho細胞中的dhfr基因，實現(xiàn)了在基因組水平對dhfr基因的沉默；獲得的dhfr基因缺失細胞株，與野生型cho-s細胞的細胞形態(tài)和生長特性相同，可大大提高外源蛋白的產(chǎn)量，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)重組蛋白提供了良好基礎。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。附圖說明圖1為cho-s細胞dhfr基因exon1部分序列及sgrna靶向序列圖2為熒光素酶法鑒定各sgrna引導cas9切割目標dna的效率圖圖3為cho-s/dhfr-/-/g3單克隆細胞生長速度圖圖4.為細胞形態(tài)觀察圖：左圖：cho-s/dhfr-/-/g3單克隆細胞；右圖：野生型cho-s細胞(對照)；圖5cho-s/dhfr-/-細胞支原體檢測(pc：陽性對照；nc：陰性對照；a2，g3：單克隆細胞株編號)圖6為不同mtx劑量處理下tnfr2-fc表達量圖。具體實施方式下面以實施例作進一步說明，但本發(fā)明不局限于這些實施例。本發(fā)明所用的實驗試劑如下：lipofectamine2000,invitrogen公司,ref.11668-030,lot.1828123；trypsin0.25％,hyclone公司，sh42605.01,cas.9002-07-7；deme/f-12,gibco公司，ref.c11330500cp，lot.8115411；foetalbovineserum，hyclone公司，cat.sh30084.03，lot.yk0119；opti-mem，gibco公司，ref.31985-062，lot.1800574；phosphatebufferedsaline，hyclone公司，cat.sh30256.01b,lot.nag1428deme,gibco公司，ref.c11995500cp,lot.8116413；renillaluciferaseassaysubstrate，promega公司，ref.e289a,lot.0000119245；renillaluciferaseassaybuffer，promega公司，ref.e290a,lot.0000141517；stop&glosubstrate，promega公司，ref.e640a,lot.0000133610；htsupplement，gibco公司，ref.11067-030,lot.1797757；ucacrispr/cas9快速構建及活性檢測試劑盒，百奧塞圖公司，cat.bcg-dx001,lot.bbctg201409。cho-s細胞：購自invitrogen公司，貨號：a1155701。實施例1利用本發(fā)明sgrna序列敲除cho細胞的二氫葉酸還原酶基因1、設計靶向cho-s細胞dhfr基因的sgrna根據(jù)genbank公布的cho細胞的dhfr基因序列，針對第一外顯子(exon1)，設計不同的sgrna序列，設計的sgrna序列見表1：表1sgrnas序列序號sgrna序列(5‐‐‐3)方向pam序列sgrna序列位置sgrna1‐h(seqidno：1)gcaagaacggagaccuuccc正向tggexon1sgrna2‐h(seqidno：2)gucgccgugucccagaauau正向gggexon1sgrna3‐h(seqidno：3)gccaaugcucagguacuggc正向tggexon1cho-s細胞dhfr基因exon1部分序列及sgrna靶向序列見圖1。提取cho-s細胞基因組dna，使用表2引物擴增基因組dna，凝膠回收擴增產(chǎn)物，連接至precutpuca(luc)載體(百奧賽圖公司的ucacrispr/cas9快速構建及活性檢測試劑盒中試劑)，標記為precutpuca(luc)-dhfr，涂kna抗性平板，挑取4個克隆進行測序，并和genbank公布的dhfr基因序列比對，檢測sgrna靶點位置序列有無突變，結果顯示sgrna靶點序列無突變。表2擴增dhfr基因sgrna靶點所用引物seqidno：6dhfr基因sgrna1-h、2-h、3-h靶點周圍dna序列2、構建靶向dhfr基因的crispr/cas9/sgrna載體分別合成sgrna正向和反向互補序列，并在正向序列5端加入cacc接頭序列，在反向序列5端加入aaac接頭序列，合成序列見表3，通過變性退火方法組建雙鏈sgrna片段。表3組建crispr/cas9/sgrna載體用各sgrna正向和反向序列序號sgrna序列(5---3)sgrna1-h-正向(seqidno：7)caccgcaagaacggagaccttcccsgrna1-h-反向(seqidno：8)aaacgggaaggtctccgttcttgcsgrna2-h-正向(seqidno：9)caccgtcgccgtgtcccagaatatsgrna2-h-反向(seqidno：10)aaacatattctgggacacggcgacsgrna3-h-正向(seqidno：11)caccgccaatgctcaggtactggcsgrna3-h-反向(seqidno：12)aaacgccagtacctgagcattggc用bsmbi酶切crispr/cas9載體(百奧賽圖公司的ucacrispr/cas9快速構建及活性檢測試劑盒中試劑)，1％瓊脂糖凝膠回收目的片段，t4dna連接酶連接各sgrna片段和酶切載體，并轉化dh5a感受態(tài)細胞，涂amp抗性平板，每個平板挑選5個陽性克隆進行測序核實。對測序正確質粒用高純度試劑盒進行純化和保存。3、針對dhfr基因的sgrna活性鑒定采取luciferase法鑒定各sgrna引導cas9切割靶基因的活性，具體步驟為：傳代293細胞(293細胞培養(yǎng)基為：高糖deme+10％fbs)至24孔板，次日用脂質體轉染法轉染crispr-cas9-sgrna-h和ssaluciferase-cut-gene載體(每種sgrna做3次轉染)(其中，lipofectamine2000轉染試劑2ul，crispr-cas9-sgrna-h載體0.8ug，ssa-luciferase-cut-gene0.2ug)，以有活性sgrna的crispr-cas9和ssaluciferase-cut-gene載體轉染作為陽性對照(標記為positive)。轉染72小時后取上清40ul，并添加10ulluciferase底物，檢測luciferase強度。檢測結果見表4和圖2。表4熒光素酶法鑒定各sgrna引導cas9切割目標dna的效率sgrna1-hsgrna2-hsgrna3-hpositivea4358805380701554960858650b44177063255014559501075760c42722051572016727101011520ave.434956.7562113.31561207981976.7sgrna/pc0.442940.572431.5898611可見，攜帶sgrna3-h的質粒轉染細胞后，產(chǎn)生的熒光強度顯著優(yōu)于陽性對照，說明其活性好，切割目標dna的效率高，而其它sgrna的效果不佳。4、敲除cho-s細胞內(nèi)的dhfr基因復蘇cho-s細胞，傳至6孔板，采用脂質體轉染法，選擇crispr-cas9-sgrna3-h質粒轉染cho-s細胞(轉染時：lipofectamine2000轉染試劑4ul，crispr-cas9-sgrna3-h載體2ug)，次日傳至25cm2方瓶中，選用含有750ug/mlg418、0.5mm次黃嘌呤鈉、0.08mm胸腺嘧啶的無血清生長培養(yǎng)基進行加壓篩選，每2-3天更換新鮮培養(yǎng)基，加壓2周后，對存活細胞進行有限稀釋法單克隆，培養(yǎng)至4塊96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)2周。5、挑選cho-s/dhfr-/-單克隆細胞挑選30個細胞形態(tài)好、生長速度快的單克隆進行消化，細胞傳至一塊48孔板，次日提取48孔板上細胞基因組dna(30個dna樣本)，使用表2的引物分別擴增sgrna3-h靶點周圍序列，瓊脂糖凝膠回收目的片段，而后連接至t載體，轉化dh5a感受態(tài)細胞，涂amp抗性平板(共60塊平板)，次日從每個平板上挑取5個克隆測序。和原序列進行比對分析，選擇全部為錯意突變、細胞生長狀態(tài)好、生長速度快的單克隆進行二次單克隆培養(yǎng)。從二次單克隆中挑選5個單克隆進行鑒定，挑選全部為錯意突變、細胞生長狀態(tài)好、生長速度快且支原體檢測陰性的單克隆進行放大培養(yǎng)和凍存。對最終選取的單克隆細胞(編號cho-s/dhfr-/-/g3、a2)進行生長速度(圖3)、細胞形態(tài)觀察分析(圖4)和支原體檢測(圖5)，結果顯示挑選得到的單克隆細胞生長速度與野生型cho-s細胞相近，細胞形態(tài)無明顯差異，且沒有支原體污染。其中，cho-s/dhfr-/-/g3單克隆細胞的突變情況如下：雙鏈dna突變不一樣，而且插入/缺失bp數(shù)都不是3的整倍數(shù)，其中一條鏈(突變體a-)多2bp，另一條鏈(突變體b-)少4bp。seqidno：13cho-s/dhfr-/-/g3單克隆細胞測序(突變體a-多2bp)seqidno：14cho-s/dhfr-/-/g3單克隆細胞測序(突變體b-少4bp)可知，本發(fā)明sgrna序列可以用于敲除cho細胞的二氫葉酸還原酶基因，并且獲得了二氫葉酸還原酶基因缺失細胞株。獲得的細胞株與野生型cho-s細胞具有相同的細胞形態(tài)和倍增速度，可用于后續(xù)的功能性重組蛋白的表達。以下通過試驗例具體說明本發(fā)明的有益效果：試驗例1本發(fā)明cho-s/dhfr-/-細胞株用于表達外源蛋白的效果驗證按照分子克隆方法，構建含有tnfr2-fc(即腫瘤壞死因子受體-fc融合蛋白)和dhfr基因的表達載體(構建方法為：將pcdna3.1載體上的neo抗性片段替換為dhfr基因，命名為pcdna3.1/dhfr,合成tnfr2-fc基因，將其插入到pcdna3.1/dhfr載體的多克隆位點區(qū)即可)，并分別轉染本發(fā)明的cho-s/dhfr-/-/g3細胞株和wtcho-s細胞株(野生型)，使用2ug/ml的嘌呤霉素加壓5天(殺死未轉染質粒的cho細胞)。取等量細胞至6孔板中，添加不同劑量的mtx加壓2周，更換新的生長培養(yǎng)基，24小時后收集培養(yǎng)基，elisa檢測培養(yǎng)上清中fc融合蛋白表達情況。結果顯示cho-s/dhfr-/-細胞表達的tnfr2-fc遠高于cho-s細胞，而且隨著mtx濃度的升高，其tnfr2-fc表達量也提高(圖6)?？梢?，本發(fā)明構建的cho-s/dhfr-/-細胞株可以用于高效表達外源蛋白。綜上，本發(fā)明特異性靶向敲除二氫葉酸還原酶基因的sgrna，能夠引導cas9快速、高效、特異性敲除cho細胞中的二氫葉酸還原酶基因，并獲得二氫葉酸還原酶基因缺失放入細胞株，能夠大大提高外源蛋白的產(chǎn)量，應用前景良好。sequencelisting<110>四川豐訊科技發(fā)展有限公司<120>一種特異性敲除二氫葉酸還原酶基因的sgrna序列及其應用<130>gy456-17p1184<160>14<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>rna<213>sgrna1-h序列<400>1gcaagaacggagaccuuccc20<210>2<211>20<212>rna<213>sgrna2-h序列<400>2gucgccgugucccagaauau20<210>3<211>20<212>rna<213>sgrna3-h序列<400>3gccaaugcucagguacuggc20<210>4<211>25<212>dna<213>dhfr-exo1-f2引物<400>4cggggcctctgatgttcaaatagga25<210>5<211>25<212>dna<213>dhfr-exo1-r2引物<400>5tgaggaggtggtggtcattctttgg25<210>6<211>584<212>dna<213>dhfr基因sgrna1-h、2-h、3-h靶點周圍dna序列<400>6cggggcctctgatgttcaaataggatgctaggcttgttgagggcgtggcctccgattcac60aagtgggaagcagcgccgggcgactgcaatttcgcgccaaacttgggggaagcacagcgt120acaggctgcctaggtgatcgctgctgctgtcatggttcgaccgctgaactgcatcgtcgc180cgtgtcccagaatatgggcatcggcaagaacggagaccttccctggccaatgctcaggta240ctggctggattgggttagggaaaccgaggcggttcgctgaatcgggtcgagcacttggcg300gagacgcgcgggccaactacttagggacagtcatgaggggtaggcccgccggctgcagcc360cttgcccatgcccgcggtgatccccatgctgtgccagcctttgcccagaggcgctctagc420tgggagcaaagtccggtcactgggcagcaccaccccccggacttgcatgggtagccgctg480agatggagcctgagcacacgtgacagggtccctgttaacgcagtgtttctctaactttca540ggaacgaattcaagtacttccaaagaatgaccaccacctcctca584<210>7<211>24<212>dna<213>sgrna1-h-正向引物<400>7caccgcaagaacggagaccttccc24<210>8<211>24<212>dna<213>sgrna1-h-反向引物<400>8aaacgggaaggtctccgttcttgc24<210>9<211>24<212>dna<213>sgrna2-h-正向引物<400>9caccgtcgccgtgtcccagaatat24<210>10<211>24<212>dna<213>sgrna2-h-反向引物<400>10aaacatattctgggacacggcgac24<210>11<211>24<212>dna<213>sgrna3-h-正向引物<400>11caccgccaatgctcaggtactggc24<210>12<211>24<212>dna<213>sgrna3-h-反向引物<400>12aaacgccagtacctgagcattggc24<210>13<211>472<212>dna<213>cho-s/dhfr-/-/g3單克隆細胞測序，鏈a<400>13ggggcctctgatgttcaaataggatgctaggcttgttgagggcgtggcctccgattcaca60agtgggaagcagcgccgggcgactgcaatttcgcgccaaacttgggggaagcacagcgta120caggctgcctaggtgatcgctgctgctgtcatggttcgaccgctgaactgcatcgtcgcc180gtgtcccagaatatgggcatcggcaagaacggagaccttgtccctggccaatgctcaggt240actggctggattgggttagggaaaccgaggcggttcgctgaatcgggtcgagcacttggc300ggagacgcgcgggccaactacttagggacagtcatgaggggtaggcccgccggctgcagc360ccttgcccatgcccgcggtgatccccatgctgtgccagcctttgcccagaggcgctctag420ctgggagcaaagtccggtcactgggcagcaccaccccccggacttgcatggg472<210>14<211>466<212>dna<213>cho-s/dhfr-/-/g3單克隆細胞測序，鏈b<400>14ggggcctctgatgttcaaataggatgctaggcttgttgagggcgtggcctccgattcaca60agtgggaagcagcgccgggcgactgcaatttcgcgccaaacttgggggaagcacagcgta120caggctgcctaggtgatcgctgctgctgtcatggttcgaccgctgaactgcatcgtcgcc180gtgtcccagaatatgggcatcggcaagaacggagaccctggccaatgctcaggtactggc240tggattgggttagggaaaccgaggcggttcgctgaatcgggtcgagcacttggcggagac300gcgcgggccaactacttagggacagtcatgaggggtaggcccgccggctgcagcccttgc360ccatgcccgcggtgatccccatgctgtgccagcctttgcccagaggcgctctagctggga420gcaaagtccggtcactgggcagcaccaccccccggacttgcatggg466當前第1頁12