本發(fā)明涉及一種哌嗪衍生物及其制備方法與用途，屬于有機(jī)合成技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
哌嗪環(huán)為分子中含兩個(gè)氮原子的六元雜環(huán)，是富氮雜環(huán)化合物的理想結(jié)構(gòu)單元，具有生成焓高、熱穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。與傳統(tǒng)的有機(jī)藥物相比，哌嗪雜環(huán)具有更好氮平衡的對(duì)稱結(jié)構(gòu)，已在有機(jī)合成和醫(yī)藥領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。許多類型的哌嗪衍生物都具有高效的藥理活性，有些已經(jīng)開(kāi)發(fā)成了臨床藥物。其中，苯基哌嗪衍生物因?qū)Π┘?xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用而表現(xiàn)出了優(yōu)異的抗癌前景，在對(duì)其抗癌機(jī)制不斷了解的基礎(chǔ)上，通過(guò)結(jié)構(gòu)改造與修飾而對(duì)苯基哌嗪類衍生物進(jìn)行有效的分子設(shè)計(jì)，將會(huì)開(kāi)發(fā)出越來(lái)越多高效、低毒的抗癌藥物，從而推進(jìn)藥物研發(fā)的整體進(jìn)程。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決上述技術(shù)所存在的不足之處，本發(fā)明提供了一種哌嗪衍生物及其制備方法與用途。
為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種哌嗪衍生物，它有如下通式：
式中r為：
一種哌嗪衍生物的制備方法如下：
步驟一、等摩爾比的異硫氰酸苯酯和鄰氨基苯甲酸甲酯，在乙醇溶液中回流反應(yīng)8～9h，控制反應(yīng)溫度為70～95℃；冷卻后過(guò)濾，得到固體?。?/p>
步驟二、將等摩爾比的固體ⅰ和溴乙酸溶于二甲基甲酰胺中，在70～90℃的加熱條件下回流反應(yīng)4～8h；冷卻至室溫后將反應(yīng)溶液倒入冰水中，析出沉淀，過(guò)濾得到固體ⅱ；
步驟三、將等摩爾比的固體ⅱ和取代哌嗪溶于二氯甲烷中進(jìn)行常溫反應(yīng)；向反應(yīng)溶液中添加少量的hobt和edc做為反應(yīng)催化劑，攪拌0.5～1h；減壓蒸餾，得到的固體用水和乙酸乙酯進(jìn)行萃取，保留有機(jī)層，再次減壓蒸餾，得到目的產(chǎn)物。
步驟一中異硫氰酸苯酯與乙醇的配比為1mmol：20～50ml。
步驟二中固體ⅰ和二甲基甲酰胺的配比為1mmol:20～50ml。
步驟三中固體ⅱ、hobt、edc的摩爾比為1:0.5:1.5。
步驟三中的取代哌嗪是指各種取代基取代的哌嗪，例如1-芐基哌嗪、1,2-氯苯基哌嗪、1,3-氯苯基哌嗪、1-2-氟苯基哌嗪、1-2,3-二氯苯基哌嗪、1-3-甲氧基苯基哌嗪、1-4-甲氧基苯基哌嗪、1-苯基哌嗪、1-2-吡啶基哌嗪、1-3-三氟甲基哌嗪、n-甲基哌嗪、1-二苯基甲基哌嗪、1-2,4-二甲基苯基哌嗪、1-2-甲氧基苯基哌嗪、1-3,4-二氯苯基哌嗪、1-4-氯二苯基甲基哌嗪、1-4-硝基苯基哌嗪等。
一種哌嗪衍生物用于制備抗乳腺癌藥物。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：
將具有良好抗癌活性的喹唑啉酮引入苯基哌嗪環(huán)，制備含有喹唑啉酮的苯基哌嗪類衍生物，對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，可以應(yīng)用于制備抗乳腺癌藥物。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
實(shí)施例一、制備2-((2-(4-芐基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)硫基)-3-苯基喹唑啉-4(3h)：
(1)將1mmol異硫氰酸苯酯、1mmol鄰氨基苯甲酸甲酯、25ml乙醇置于帶有回流裝置的圓底燒瓶中，在90℃下油浴加熱，回流反應(yīng)9h；過(guò)濾得到固體?。?/p>
(2)將1mmol固體ⅰ與1mmol的溴乙酸進(jìn)行油浴回流反應(yīng)，反應(yīng)溶劑為25ml的二甲基甲酰胺，反應(yīng)溫度為80℃、時(shí)間為4h；冷卻至室溫后將反應(yīng)溶液倒入冰水中，析出沉淀，過(guò)濾得到固體ⅱ；
(3)將1mmol固體ⅱ、1mmol的1-芐基甲基哌嗪、0.5mmol的hobt(1-hydroxybenzotriazole，1-羥基苯并三唑)、1.5mmol的edc(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)共同置于25ml的二氯甲烷溶液中，常溫反應(yīng)40min；減壓蒸餾，用水和乙酸乙酯萃取，保留有機(jī)溶劑層，無(wú)水硫酸鈉干燥后蒸干，得到化合物3a。
化合物3a是白色粉末，產(chǎn)率為85％，熔點(diǎn)為120.7-121.5℃。1hnmr(500mhz,d6-dmso):8.27-8.25(d,j＝7.92hz,1h),7.77-7.73(m,1h),7.57-7.55(m,4h),7.46-7.42(m,1h),7.37-7.30(m,7h),4.14(s,2h),3.72(s,4h),3.60(s,2h),2.56-2.50(m,4h).ms(esi):471.59(c17h27n4o2s,[m+h]+).anal.calcdforc17h26n4o2s:c,68.91；h,5.57；n,11.91.
實(shí)施例二、制備2-((2-(4-(2-氯苯基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)硫基)-3-苯基喹唑啉-4(3h)：
(1)將1mmol異硫氰酸苯酯、1mmol鄰氨基苯甲酸甲酯、20ml乙醇置于帶有回流裝置的圓底燒瓶中，在95℃下油浴加熱，回流反應(yīng)8h；過(guò)濾得到固體??；
(2)將1mmol固體ⅰ與1mmol的溴乙酸進(jìn)行油浴回流反應(yīng)，反應(yīng)溶劑為20ml的二甲基甲酰胺，反應(yīng)溫度為90℃、時(shí)間為5h；冷卻至室溫后將反應(yīng)溶液倒入冰水中，析出沉淀，過(guò)濾得到固體ⅱ；
(3)將1mmol固體ⅱ、1mmol的1-2-氯苯基哌嗪、0.5mmol的hobt、1.5mmol的edc共同置于20ml的二氯甲烷溶液中，常溫反應(yīng)30min；減壓蒸餾，用水和乙酸乙酯萃取，保留有機(jī)溶劑層，無(wú)水硫酸鈉干燥后蒸干，得到化合物3b。
化合物3b是白色粉末，產(chǎn)率為85％，熔點(diǎn)為128.1-138.3℃。1hnmr(500mhz,d6-dmso):8.28-8.26(d,j＝9.12hz,1h),7.76-7.76(m,1h),7.61-7.57(m,4h),7.46-7.37(m,4h),7.29-7.25(m,1h),7.07-7.03(m,2h),4.21(s,2h),3.89-3.83(m,4h),3.17-3.05(m,4h).ms(esi):492.00(c26h24cln2o2s,[m+h]+).anal.calcdforc26h23cln2o2s:c,63.60；h,4.72；n,11.41.
實(shí)施例三、制備2-((2-(4-(3-氯苯基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)硫基)-3-苯基喹唑啉-4(3h)：
(1)將1mmol異硫氰酸苯酯、1mmol鄰氨基苯甲酸甲酯、25ml乙醇置于帶有回流裝置的圓底燒瓶中，在80℃下油浴加熱，回流反應(yīng)9h；過(guò)濾得到固體??；
(2)將1mmol固體ⅰ與1mmol的溴乙酸進(jìn)行油浴回流反應(yīng)，反應(yīng)溶劑為25ml的二甲基甲酰胺，反應(yīng)溫度為70℃、時(shí)間為6h；冷卻至室溫后將反應(yīng)溶液倒入冰水中，析出沉淀，過(guò)濾得到固體ⅱ；
(3)將1mmol固體ⅱ、1mmol的1-3-氯苯基哌嗪、0.5mmol的hobt、1.5mmol的edc共同置于25ml的二氯甲烷溶液中，常溫反應(yīng)60min；減壓蒸餾，用水和乙酸乙酯萃取，保留有機(jī)溶劑層，無(wú)水硫酸鈉干燥后蒸干，得到化合物3c。
化合物3c是白色粉末，產(chǎn)率為85％，熔點(diǎn)為201.5-203.6℃。1hnmr(500mhz,d6-dmso):8.28-8.26(d,j＝7.4hz,1h),7.88-7.66(m,1h),7.66-7.57(m,5h),7.47-7.43(m,1h),7.38-7.36(m,2h),6.94-7.08(m,3h),4.22-4.14(m,2h),3.99(s,2h),3.92-3.83(m,2h),3.36(s,2h),3.28-3.26(m,2h).ms(esi):492.00(c26h24cln2o2s,[m+h]+).anal.calcdforc26h23cln2o2s:c,63.60；h,4.72；n,11.41.
實(shí)施例四、制備2-((2-(4-(2-氟苯基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)硫基)-3-苯基喹唑啉-4(3h)：
(1)將1mmol異硫氰酸苯酯、1mmol鄰氨基苯甲酸甲酯、25ml乙醇置于帶有回流裝置的圓底燒瓶中，在85℃下油浴加熱，回流反應(yīng)8h；過(guò)濾得到固體??；
(2)將1mmol固體ⅰ與1mmol的溴乙酸進(jìn)行油浴回流反應(yīng)，反應(yīng)溶劑為20ml的二甲基甲酰胺，反應(yīng)溫度為75℃、時(shí)間為7h；冷卻至室溫后將反應(yīng)溶液倒入冰水中，析出沉淀，過(guò)濾得到固體ⅱ；
(3)將1mmol固體ⅱ、1mmol的1-2-氟苯基哌嗪、0.5mmol的hobt、1.5mmol的edc共同置于20ml的二氯甲烷溶液中，常溫反應(yīng)40min；減壓蒸餾，用水和乙酸乙酯萃取，保留有機(jī)溶劑層，無(wú)水硫酸鈉干燥后蒸干，得到化合物3d。
化合物3d是白色粉末，產(chǎn)率為80％，熔點(diǎn)為124.7-125.4℃。1hnmr(500mhz,d6-dmso):8.28-8.26(d,j＝9.2hz,1h),7.79-7.75(m,1h),7.65-7.62(m,1h),7.59-7.58(m,3h),7.47-7.40(m,2h),7.39-7.36(m,2h),7.19-7.12(m,3h),4.26-4.24(m,2h),4.07-3.92(m,4h),3.44-3.21(m,4h),ms(esi):475.55(c26h24fn4o2s,[m+h]+).anal.calcdforc26h23fn4o2s:c,65.81；h,4.89；n,11.81.
實(shí)施例五、制備2-((2-(4-(2,3-二氯苯基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)硫基)-3-苯基喹唑啉-4(3h)：
制備方法同實(shí)施例一。以1-2,3-二氯苯基哌嗪代替1-芐基甲基哌嗪，得到化合物3e。
化合物3e是白色粉末，產(chǎn)率為80％，熔點(diǎn)為124.7-125.4℃。1hnmr(500mhz,d6-dmso):8.28-8.26(d,j＝9.08hz,1h),7.78-7.74(m,1h),7.61-7.56(m,4h),7.46-7.36(m,3h),7.26-7.18(m,2h),6.96-6.94(m,1h),4.21(s,2h),3.92-3.73(m,4h),3.15-3.04(m,4h),ms(esi):526.45(c26h23cl2n4o2s,[m+h]+).anal.calcdforc26h22cl2n4o2s:c,59.43；h,4.22；n,10.66.
實(shí)施例六、制備2-((2-(4-(3-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)硫基)-3-苯基喹唑啉-4(3h)：
制備方法同實(shí)施例一。以1-3-甲氧基苯基哌嗪代替1-芐基甲基哌嗪，得到化合物3f。
化合物3f是白色粉末，產(chǎn)率為80％，熔點(diǎn)為176.8-177.4℃。1hnmr(500mhz,d6-dmso):8.09-8.08(d,j＝6.12hz,1h),7.83-7.80(m,1h),7.62-7.58(m,4h),7.49-7.46(m,3h),7.16-7.13(m,1h),6.57-6.56(d,j＝6.84hz,1h),6.50-6.49(s,1h),6.43-6.41(d,j＝6.76hz,1h),4.25(s,2h),3.77-3.76(m,2h),3.73(s,3h),3.60-3.58(m,2h),3.33-3.25(m,2h),3.13-3.11(m,2h),ms(esi):486.59(c27h27n4o3s,[m+h]+).anal.calcdforc27h26n4o3s:c,66.65；h,5.39；n,11.51.
實(shí)施例七、制備2-((2-(4-(4-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)硫基)-3-苯基喹唑啉-4(3h)：
制備方法同實(shí)施例一。以1-4-甲氧基苯基哌嗪代替1-芐基甲基哌嗪，得到化合物3g。
化合物3g是白色粉末，產(chǎn)率為80％，熔點(diǎn)為163.1-164.5℃。1hnmr(500mhz,d6-dmso):8.09-8.08(d,j＝6.08hz,1h),7.84-7.81(m,1h),7.62-7.58(m,4h),7.50-7.46(m,3h),6.95-6.93(m,2h),6.86-6.85(m,2h),4.25(s,2h),3.77-3.76(m,2h),3.70(s,3h),3.60-3.59(m,2h),3.12-3.11(m,2h),2.98-2.97(m,2h),ms(esi):486.59(c27h27n4o3s,[m+h]+).anal.calcdforc27h26n4o3s:c,66.65；h,5.39；n,11.51.
實(shí)施例八、制備2-((2-氧代-2-(4-苯基哌嗪-1-基)乙基)硫基)-3-苯基喹唑啉-4(3h)-酮：
制備方法同實(shí)施例二。以1-苯基哌嗪代替1-2-氯苯基哌嗪，得到化合物3h。
化合物3h是白色粉末，產(chǎn)率為80％，熔點(diǎn)為209.7-224.8℃。1hnmr(500mhz,d6-dmso):8.28-8.26(d,j＝6.16hz,1h),7.76-7.73(m,1h),7.59-7.55(m,4h),7.46-7.43(m,1h),7.39-7.33(m,4h),7.04-7.01(m,3h),4.20(s,2h),3.92-3.83(m,4h),3.32-3.23(m,4h),ms(esi):457.56(c26h25n4o2s,[m+h]+).anal.calcdforc26h24n4o2s:c,68.40；h,5.30；n,12.27.
實(shí)施例九、制備2-((2-氧代-2-(4-(吡啶-2-基)哌嗪-1-基)乙基)硫基)-3-苯基喹唑啉-4(3h)：
制備方法同實(shí)施例二。以1-2-吡啶基哌嗪代替1-2-氯苯基哌嗪，得到化合物3i。
化合物3i是白色粉末，產(chǎn)率為80％，熔點(diǎn)為199.5-201.4℃。1hnmr(500mhz,d6-dmso):8.15-8.14(m,1h),8.10-8.18(d,j＝6.12hz,1h),7.82-7.19(m,1h),7.62-7.56(m,5h),7.49-7.46(m,3h),6.88-6.86(d,j＝5.76hz,1h),6.70-6.68(m,1h),4.25(s,2h),3.75-3.74(m,2h),3.66-3.64(m,2h),3.57-3.56(m,2h),3.50-3.49(m,2h),ms(esi):457.55(c25h24n5o2s,[m+h]+).anal.calcdforc25h23n5o2s:c,65.63；h,5.07；n,15.31.
實(shí)施例十、制備2-((2-(4-(3-氟苯基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)硫基)-3-苯基喹唑啉-4(3h)：
制備方法同實(shí)施例二。以1-3-氟苯基哌嗪代替1-2-氯苯基哌嗪，得到化合物3j。
化合物3j是白色粉末，產(chǎn)率為80％，熔點(diǎn)為221.0-202.9℃。1hnmr(500mhz,d6-dmso):8.28-8.26(d,j＝9.12hz,1h),7.76-7.72(m,1h),7.58-7.54(m,4h),7.46-7.43(m,4h),7.20-7.12(m,3h),4.20(s,2h),3.92-3.83(m,4h),3.37-3.25(m,4h),ms(esi):475.55(c26h24fn4o2s,[m+h]+).anal.calcdforc26h23fn4o2s:c,65.81；h,4.89；n,11.81.
實(shí)施例十一、制備((2-氧代-2-(哌嗪-1-基)乙基)硫基)-3-苯基喹唑啉-4(3h)-酮：
制備方法同實(shí)施例三。以n-甲基哌嗪代替1-3-氯苯基哌嗪，得到化合物3k。
化合物3k是白色粉末，產(chǎn)率為80％，熔點(diǎn)為128.4-130.9℃。1hnmr(500mhz,d6-dmso):8.09-8.08(d,j＝6.16hz,1h),7.87-7.84(m,1h),7.61-7.58(m,4h),7.50-7.45(m,3h),4.19(s,2h),3.61-3.59(m,2h),3.44-3.43(m,2h),2.53-2.50(m,2h),5.26-2.24(m,2h),ms(esi):380.46(c20h21n4o2s,[m+h]+).anal.calcdforc20h20n4o2s:c,63.14；h,5.30；n,14.73.
實(shí)施例十二、制備2-((2-(4-二苯甲基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)硫基)-3-苯基喹唑啉-4(3h)：
制備方法同實(shí)施例三。以1-二苯甲基哌嗪代替1-3-氯苯基哌嗪，得到化合物3l。
化合物3l是白色粉末，產(chǎn)率為80％，熔點(diǎn)為238.0-240.7℃。1hnmr(500mhz,d6-dmso):8.08-8.07(d,j＝5.96hz,1h),7.86-7.83(m,1h),7.60-7.58(m,3h),7.55-7.53(m,1h),7.50-7.44(m,7h),7.33-7.30(m,4h),7.23-7.20(m,2h),4.38(s,1h),4.16(s,2h),3.64(s,2h),3.47(s,2h),2.38(s,2h),2.28(s,2h),ms(esi):546.68(c33h31n4o2s,[m+h]+).anal.calcdforc33h30n4o2s:c,72.50；h,5.53；n,10.25.
實(shí)施例十三、制備2-((2-(4-(2,4-二甲基苯基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)硫基)-3-苯基喹唑啉-4(3h)：
制備方法同實(shí)施例三。以1-2，4-二甲基苯基哌嗪代替1-3-氯苯基哌嗪，得到化合物3m。
化合物3m是白色粉末，產(chǎn)率為80％，熔點(diǎn)為150.9-153.8℃。1hnmr(500mhz,d6-dmso):8.28-8.26(d,j＝5.24hz,1h),7.77-7.74(m,1h),7.61-7.56(m,4h),7.45-7.43(m,1h),7.38-7.37(m,2h),7.06(s,1h),7.03-7.01(d,j＝5.4hz,1h),6.94-6.93(m,j＝5.36hz,1h),4.21(s,2h),3.92-3.73(m,4h),2.9-2.91(m,4h),2.34(s,3h),2.31(s,3h),ms(esi):485.61(c28h29n4o2s,[m+h]+).anal.calcdforc28h28n4o2s:c,69.40；h,5.82；n,11.56.
實(shí)施例十四、制備2-((2-(4-(2-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)硫基)-3-苯基喹唑啉-4(3h)：
制備方法同實(shí)施例三。以1-2-甲基苯基哌嗪代替1-3-氯苯基哌嗪，得到化合物3n。
化合物3n是白色粉末，產(chǎn)率為80％，熔點(diǎn)為192.3-192.8℃。1hnmr(500mhz,d6-dmso):8.28-8.26(d,j＝6.04hz,1h),7.77-7.74(m,1h),7.61-7.57(m,5h),7.45-7.43(m,1h),7.38--7.36(m,2h),7.28-7.11(m,1h),7.01-6.96(m,2h),4.21-4.14(m,2h),4.03-3.83(m,8h),3.26-3.22(m,3h),ms(esi):487.59(c27h27n4o3s,[m+h]+).anal.calcdforc27h26n4o3s:c,66.65；h,5.39；n,11.51.
實(shí)施例十五、制備2-((2-(4-(3,4-二氯苯基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)硫基)-3-苯基喹唑啉-4(3h)：
制備方法同實(shí)施例四。以1-3,4-二氯苯基哌嗪代替1-2-氟苯基哌嗪，得到化合物3o。
化合物3o是白色粉末，產(chǎn)率為80％，熔點(diǎn)為189.1-190.2℃。1hnmr(500mhz,d6-dmso):8.09-8.08(d,j＝6.2hz,1h),7.83-7.80(m,1h),7.61-7.57(m,4h),7.50-7.43(m,4h),7.19-7.18(m,1h),6.99-6.97(m,1h),4.25(s,2h),3.78-3.76(m,2h),3.59-3.57(m,2h),3.35-3.33(m,2h),3.20-3.18(m,2h),ms(esi):526.45(c26h23cl2n4o2s,[m+h]+).anal.calcdforc26h22cl2n4o2s:c,59.43；h,4.22；n,10.66.
實(shí)施例十六、制備2-((2-(4-((4-氯苯基)(苯基)甲基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)硫基)-3-苯基喹唑啉-4(3h)：
制備方法同實(shí)施例四。以1-4-氯二苯基甲基哌嗪代替1-2-氟苯基哌嗪，得到化合物3p。
化合物3p是白色粉末，產(chǎn)率為80％，熔點(diǎn)為130.2-133.2℃。1hnmr(500mhz,d6-dmso):8.26-8.25(d,j＝5.04hz,1h),7.75-7.72(m,1h),7.57-7.52(m,5h),7.44-7.34(m,10h),7.30-7.26(m,1h),4.27(m,1h),4.13(m,2h),3.75-3.66(m,4h),2.47-2.40(m,4h),ms(esi):582.13(c33h30cln4o2s,[m+h]+).anal.calcdforc33h29cln4o2s:c,68.20；h,5.03；n,9.64.
實(shí)施例十七、制備2-((2-(4-(4-硝基苯基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)硫基)-3-苯基喹唑啉-4(3h)：
制備方法同實(shí)施例四。以1-4-硝基苯基哌嗪代替1-2-氟苯基哌嗪，得到化合物3q。
化合物3q是白色粉末，產(chǎn)率為80％，熔點(diǎn)為243.5-245.2℃。1hnmr(500mhz,d6-dmso):8.28-8.26(d,j＝8.00hz,1h),8.21-8.19(d,j＝9.32hz,2h),7.75-7.71(m,1h),7.59-7.53(m,4h),7.46-7.43(m,1h),7.38-7.36(m,2h),6.88-6.86(m,2h),4.18-4.14(m,2h),3.96-3.93(m,2h),3.87-3.83(m,2h),3.61-3.59(m,2h),3.50-3.48(m,2h),ms(esi):502.56(c26h24n5o4s,[m+h]+).anal.calcdforc26h23n5o4s:c,62.26；h,4.62；n,13.96.
為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果，對(duì)上述17個(gè)實(shí)施例進(jìn)行如下體外抗癌活性研究：
1、實(shí)驗(yàn)材料
1.1細(xì)胞株
人乳腺癌細(xì)胞株mcf-7
1.2試劑
dmembasic(1×)培養(yǎng)基(gibco)，新生牛血清(杭州四季青生物工程材料)，胰蛋白酶(sigma)，mtt(sigma)，青鏈霉素混合(100×)(solarhbio)，其它常用化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
2、實(shí)驗(yàn)方法
2.1培養(yǎng)基的配制
dmembasic(1×)培養(yǎng)基(gibco)90ml培養(yǎng)基加滅活新生牛血清10ml加1ml青鏈霉素混合即為完全培養(yǎng)液。胰蛋白酶用d-hanks緩沖液配成0.25％溶液，過(guò)濾除菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.2藥液的配制
準(zhǔn)確稱取被測(cè)樣品1.0mg，加到滅菌的1.5ml離心管中，加入dmso100μl和2.9ml配成1mg/3ml原液，-40℃冷凍保存。臨用前融化后用適量d-hanks稀釋成相應(yīng)濃度應(yīng)用。
2.3細(xì)胞培養(yǎng)及傳代
細(xì)胞均貼壁培養(yǎng)于含10ml完全培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37℃、5％co2、飽和濕度下培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后用滅菌d-hanks液洗兩次，加0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞2min，倒掉胰蛋白酶，待輕搖細(xì)胞能完全脫落后，加完全培養(yǎng)液30ml后，用移液管吹散細(xì)胞，分裝于3個(gè)新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。
2.4抗癌活性測(cè)試
取剛剛長(zhǎng)成完整單層的細(xì)胞一瓶，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，用移液管吹打均勻，取兩滴細(xì)胞懸液錐蟲(chóng)藍(lán)(trypanblue)染色，于顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目(死細(xì)胞數(shù)目不得超過(guò)5％)，用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)目至1×104個(gè)細(xì)胞/ml。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入90μl細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板置于co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取出培養(yǎng)板后于每孔中加10μl含不同濃度被測(cè)樣品的溶液，使得藥物終濃度分別為33.3，16.7，8.33，4.17，2.08μg/ml，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，另設(shè)6孔細(xì)胞作正常對(duì)照孔和陽(yáng)性五氟尿嘧啶對(duì)照孔。加完藥后培養(yǎng)板于微孔板振蕩器上振蕩混勻，置于co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。取出培養(yǎng)板，每孔加入25μl5mg/ml的mtt液，振蕩混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4h。加入每孔150μldmso后培養(yǎng)10min。酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光吸收(od值)，測(cè)定波長(zhǎng)570nm。根據(jù)各孔o(hù)d值通過(guò)spss軟件計(jì)算藥物對(duì)兩種細(xì)胞增殖的抑制率，即ic50值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。
表1
上述實(shí)施方式并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不僅限于上述舉例，本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的技術(shù)方案范圍內(nèi)所做出的變化、改型、添加或替換，也均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。