本發(fā)明屬于技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器快速多重檢測(cè)NTPs的方法及試劑盒與應(yīng)用，用于對(duì)ATP、CTP、UTP和GTP進(jìn)行超快速、高選擇性、高靈敏和高通量的檢測(cè)。

背景技術(shù)：

三磷酸核苷(nucleoside triphosphates,NTPs，又稱(chēng)核苷三磷酸)是生命體內(nèi)最基本、最重要的功能分子，由一分子核糖、一分子堿基和三分子磷酸組成。根據(jù)堿基類(lèi)別，NTPs被分為三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、三磷酸胞苷(cytidine triphosphate,CTP)、三磷酸尿苷(uridine triphosphate,UTP)和三磷酸鳥(niǎo)苷(guanosine triphosphate,GTP)。NTPs作為核酸分子的原料，不僅確保核酸的正常復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄，還在幾乎所有的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、新陳代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面起著重要作用(Y.Zhou,et al.Chem.Soc.Rev.2011,40,2222-2235)。NTPs水平的變化或不平衡會(huì)導(dǎo)致生理反應(yīng)異常、代謝紊亂、細(xì)胞凋亡或壞死，并與許多疾病如癌癥、帕金森氏病等密切相關(guān)(D.Davalos,et al.Nat.Neurosci.2005,8,752)。同時(shí)，多種抗癌和抗病毒藥物作為核苷酸類(lèi)似物，以干擾NTPs的生物合成、競(jìng)爭(zhēng)性參與RNA合成或代謝活動(dòng)、擾亂NTPs水平等機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)其藥理作用(L.P.Jordheim,et al.Biochim.Biophys.Acta.2007,1776,138)。因此，發(fā)展對(duì)NTPs的多重體外檢測(cè)和超快速分析方法具有重大需求和意義，可以為研究生理與病理的基本機(jī)制、關(guān)聯(lián)信號(hào)通路(S.Seino,et al.Diabetologia 2012,55,2096)、研發(fā)抗癌藥物及載藥系統(tǒng)(R.Mo,et al.Nat.Commun.2014,5,3364)和監(jiān)測(cè)藥物治療效果等提供必要、便捷和高效的研究技術(shù)和手段。

然而發(fā)展NTPs的多重體外檢測(cè)和超快速分析方法卻是十分困難和具有挑戰(zhàn)性的。眾多結(jié)構(gòu)相似的核苷酸衍生物，例如脫氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphates,dNTPs),二磷酸核苷(nucleoside diphosphates,NDPs)和單磷酸核苷(nucleoside monophosphates,NMPs)，會(huì)對(duì)NTPs的檢測(cè)產(chǎn)生干擾和假陽(yáng)性，從而使檢測(cè)方法缺乏對(duì)NTPs的選擇性。而要同時(shí)滿(mǎn)足NTPs的選擇性、多種NTPs的同步檢測(cè)、超快速(小于5分鐘)、簡(jiǎn)便(無(wú)需大型儀器)和高靈敏(nM)的檢測(cè)要求更是難上加難。目前基于分離的方法如色譜、毛細(xì)管電泳及質(zhì)譜聯(lián)用，雖然可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種NTPs的同步檢測(cè)，但面臨細(xì)胞基質(zhì)和基線(xiàn)噪音的干擾，樣品前處理復(fù)雜耗時(shí)，運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)(大于2小時(shí))，靈敏度相對(duì)有限(低于10pmol或50nM)，且依賴(lài)于昂貴的大型儀器和專(zhuān)門(mén)訓(xùn)練的技術(shù)人員，在臨床分析應(yīng)用受到極大限制(S.Cohen,et al.J.Chromatogr.B 2009,877,3831)。而基于分子間的相互作用，結(jié)合熒光法(Z.Xu,et al.Chem.Soc.Rev.2010,39,1457)、電化學(xué)法(L.Lu,et al.Biosens.Bioelectron.2015,63,14–20)、化學(xué)發(fā)光法(R.Freeman,et al.J.Am.Chem.Soc.2011,133,11597)和比色法(D.Cheng,et al.Chem.Commun.2015,51,8544)等已經(jīng)發(fā)展了各種各樣的傳感識(shí)別手段，其中熒光分析法因操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)快速、高靈敏和高通量的特點(diǎn)在臨床樣品分析獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。具體地，目前NTPs的傳感識(shí)別原理分為六類(lèi)：一是有機(jī)小分子熒光探針(X.Li,et al.Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,7809)，其優(yōu)點(diǎn)是響應(yīng)快，但合成步驟極為復(fù)雜，細(xì)胞毒性、靈敏度(μM)和選擇性都較差；二是基因編碼的熒光蛋白或多肽(H.Yaginuma,et al.Sci.Rep.2014,4,6522)，雖生物相容性好，但表達(dá)和純化步驟復(fù)雜，靈敏度和選擇性也都較差；三是體外篩選的適配體(A.B.Iliuk,et al.Anal.Chem.2011,83,4440)，ATP適配體的本質(zhì)是脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)，對(duì)二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)和一磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)的選擇性較差，GTP的適配體是核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)，穩(wěn)定性不好，且適配體與目標(biāo)分子的孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(大于30分鐘)，而UTP與CTP的適配體卻鮮有報(bào)道；四是基于特異性識(shí)別ATP或GTP的脫氧核酶(A.Sreedhara,et al.J.Am.Chem.Soc.2004,126,3454；S.A.Mcmanus,et al.J.Am.Chem.Soc.2013,135,7181)，但靈敏度(μM)非常差；五是基于ATP依賴(lài)的螢光素酶(P.E.Stanley,et al.Biolumin.Chemilumin.1989,4,289)，其活性容易受到環(huán)境因素的影響，化學(xué)反應(yīng)發(fā)出的熒光不穩(wěn)定，30分鐘后光強(qiáng)可下降10％，并且通用性差，無(wú)法檢測(cè)CTP、UTP和GTP；六是基于ATP依賴(lài)的T4 DNA連接酶(L.M.Lu,et al.J.Am.Chem.Soc.2011,133,11686)，連接時(shí)間至少半小時(shí)，且同樣無(wú)法用于CTP、UTP和GTP的檢測(cè)。綜上所述，現(xiàn)有的傳感方法均是檢測(cè)ATP或GTP的單一目標(biāo)物傳感器，且在選擇性、靈敏度、反應(yīng)時(shí)間和簡(jiǎn)便性上只能滿(mǎn)足其中的一兩個(gè)方面，無(wú)法對(duì)受到外界刺激時(shí)NTP的含量和關(guān)聯(lián)性變化進(jìn)行快速檢測(cè)，難以滿(mǎn)足未來(lái)科學(xué)研究和臨床分析對(duì)快速多重檢測(cè)NTPs的需求。

因此，迫切需要發(fā)展新的傳感識(shí)別機(jī)制，突破現(xiàn)有技術(shù)對(duì)選擇性、多重分析能力、靈敏度和反應(yīng)時(shí)間的限制，開(kāi)發(fā)出同時(shí)具備超快速、高選擇性、高靈敏、高通量、低成本和實(shí)用性強(qiáng)的NTPs的多重檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器快速多重檢測(cè)NTPs的方法及試劑盒與應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)四種不同的NTPs進(jìn)行超快速準(zhǔn)確定量、高選擇性、高靈敏度、高通量、低成本、便于臨床和研究應(yīng)用的檢測(cè)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種基于RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器快速多重檢測(cè)NTPs的方法，包括：

1)預(yù)雜交形成雙鏈DNA的模板鏈和編碼鏈，在RNA聚合酶啟動(dòng)子序列之后的轉(zhuǎn)錄區(qū)域的模板鏈上設(shè)置與待檢測(cè)的目標(biāo)NTP的堿基類(lèi)型互補(bǔ)的堿基作為識(shí)別位點(diǎn)，其余的轉(zhuǎn)錄序列則不含有識(shí)別位點(diǎn)，所述編碼鏈上與識(shí)別位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基是目標(biāo)位點(diǎn)，其后是能被分子信標(biāo)(molecular beacon,MB)識(shí)別的信號(hào)序列；

2)在RNA聚合酶和過(guò)量的其他非目標(biāo)NTPs存在時(shí)，加入目標(biāo)NTP使轉(zhuǎn)錄反應(yīng)順利通過(guò)識(shí)別位點(diǎn)，得到包含目標(biāo)NTP和能被分子信標(biāo)識(shí)別的信號(hào)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA，從而使目標(biāo)NTP轉(zhuǎn)化為攜帶信號(hào)序列的RNA；

3)通過(guò)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的信號(hào)序列與分子信標(biāo)的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)NTP的檢測(cè)。

進(jìn)一步地，所述NTPs包括四種NTP：ATP、CTP、UTP和GTP，所述目標(biāo)NTP為四種NTP中的一種或任意兩種的組合。

進(jìn)一步地，所述目標(biāo)NTP為ATP時(shí)，模板鏈的識(shí)別位點(diǎn)設(shè)置成T，其余的轉(zhuǎn)錄序列不含有T，此時(shí)編碼鏈上的目標(biāo)位點(diǎn)為A，其余與轉(zhuǎn)錄序列互補(bǔ)的部分不含有A。優(yōu)選地，ATP的模板鏈從轉(zhuǎn)錄起始到識(shí)別位點(diǎn)之后的相鄰堿基之間的最優(yōu)序列結(jié)果是(5'→3')CCCCTG(粗體為識(shí)別位點(diǎn))，剩余模板鏈的序列可由任意不含T的堿基組成。

進(jìn)一步地，所述目標(biāo)NTP為CTP時(shí)，模板鏈的識(shí)別位點(diǎn)設(shè)置成G，其余的轉(zhuǎn)錄序列不含有G，此時(shí)編碼鏈上的目標(biāo)位點(diǎn)為C，其余與轉(zhuǎn)錄序列互補(bǔ)的部分不含有C。優(yōu)選地，CTP的模板鏈從轉(zhuǎn)錄起始到識(shí)別位點(diǎn)之后的相鄰堿基之間的最優(yōu)序列結(jié)果是(5'→3')CCCCTGT(粗體為識(shí)別位點(diǎn))，剩余模板鏈的序列可由任意不含G的堿基組成。

進(jìn)一步地，所述目標(biāo)NTP為UTP時(shí)，模板鏈的識(shí)別位點(diǎn)設(shè)置成A，其余的轉(zhuǎn)錄序列不含有A，此時(shí)編碼鏈上的識(shí)別位點(diǎn)為T(mén)，其余與轉(zhuǎn)錄序列互補(bǔ)的部分不含有T。優(yōu)選地，UTP的模板鏈從轉(zhuǎn)錄起始到識(shí)別位點(diǎn)之后的相鄰堿基之間的最優(yōu)序列結(jié)果是(5'→3')CCCCGAG(粗體為識(shí)別位點(diǎn))，剩余模板鏈的序列可由任意不含A的堿基組成。

進(jìn)一步地，所述目標(biāo)NTP為GTP時(shí)，模板鏈的識(shí)別位點(diǎn)設(shè)置成C，其余的轉(zhuǎn)錄序列不含有C，此時(shí)編碼鏈上的識(shí)別位點(diǎn)為G，其余與轉(zhuǎn)錄序列互補(bǔ)的部分不含有G。優(yōu)選地，GTP的模板鏈從轉(zhuǎn)錄起始到識(shí)別位點(diǎn)之后的相鄰堿基之間的最優(yōu)序列結(jié)果是(5'→3')GCT(粗體為識(shí)別位點(diǎn))，剩余模板鏈的序列可由任意不含C的堿基組成。

進(jìn)一步地，為節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，可使信號(hào)序列由兩種非目標(biāo)NTPs組成，從而使其中的兩種目標(biāo)NTPs在檢測(cè)時(shí)可以共享一種分子信標(biāo)。例如ATP和CTP的信號(hào)序列可設(shè)計(jì)為UGUUGUGGUGUGUUGGUU；UTP和GTP的信號(hào)序列可設(shè)計(jì)為ACAACACCACACAACCAA。并且信號(hào)序列的位置因在目標(biāo)位點(diǎn)之后，便于在無(wú)需改變分子信標(biāo)的情況下即可探索和優(yōu)化識(shí)別位點(diǎn)的位置及前后堿基的組成，觀測(cè)其對(duì)熒光曲線(xiàn)和信號(hào)窗口的影響，以此設(shè)計(jì)出性能最優(yōu)的模板序列。

進(jìn)一步地，所述目標(biāo)NTP為四種NTP中任意兩種的組合時(shí)，每種目標(biāo)NTP的模板鏈的非識(shí)別位點(diǎn)堿基類(lèi)型不包括自身的識(shí)別位點(diǎn)堿基類(lèi)型及另外一種目標(biāo)NTP的識(shí)別位點(diǎn)堿基類(lèi)型；兩者對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的信號(hào)序列各不相同，且對(duì)應(yīng)的分子信標(biāo)的環(huán)部序列和熒光基團(tuán)標(biāo)記也各不相同，以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同模板鏈的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的分別響應(yīng)。

進(jìn)一步地，本發(fā)明所用的RNA聚合酶可包括各種類(lèi)別和來(lái)源的RNA聚合酶，例如：噬菌體RNA聚合酶(T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶，SP6 RNA聚合酶，K11 RNA聚合酶和BA14 RNA聚合酶)，原核生物RNA聚合酶(大腸桿菌RNA聚合酶)，真核生物的RNA聚合酶(RNA聚合酶Ⅰ,RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ)。

進(jìn)一步地，所述分子信標(biāo)是一條呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的短鏈DNA，一端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記猝滅基團(tuán)，所述熒光基團(tuán)為FAM，猝滅基團(tuán)為DABCYL或BHQ1或TAMRA；或者所述熒光基團(tuán)為ROX，猝滅基團(tuán)為BHQ2。

進(jìn)一步地，步驟3)中還可包括：根據(jù)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的信號(hào)序列與分子信標(biāo)結(jié)合時(shí)生成的實(shí)時(shí)熒光上升曲線(xiàn)對(duì)目標(biāo)NTP進(jìn)行定量檢測(cè)。

進(jìn)一步地，上述定量檢測(cè)中進(jìn)行定量的方法包括：根據(jù)實(shí)時(shí)熒光曲線(xiàn)上升的絕對(duì)速率或相對(duì)速率與目標(biāo)NTP的濃度或絕對(duì)含量建立線(xiàn)性關(guān)系；或根據(jù)熒光強(qiáng)度值與目標(biāo)NTP的濃度或絕對(duì)含量建立線(xiàn)性關(guān)系。

本發(fā)明還提供了一種基于RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器快速多重檢測(cè)NTPs的試劑盒，包括：四種NTP套裝，反應(yīng)緩沖液，四種NTP標(biāo)準(zhǔn)品，RNA酶抑制劑以及RNA聚合酶，四種NTP套裝又包括四種NTP的模板鏈、編碼鏈和分子信標(biāo)的DNA干粉，所述四種NTP包括ATP、CTP、UTP和GTP，所述模板鏈上設(shè)有待檢測(cè)的目標(biāo)NTP堿基類(lèi)型的互補(bǔ)堿基作為識(shí)別位點(diǎn)，其余的轉(zhuǎn)錄序列則不含有識(shí)別位點(diǎn)，所述編碼鏈包含能被分子信標(biāo)(molecular beacon,MB)識(shí)別的信號(hào)序列。

進(jìn)一步地，1x反應(yīng)緩沖液的組成為100μg/mL牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),40mM Tris-HCl(pH 7.9)，6mM MgCl₂，2mM亞精胺，10mM DTT。

本發(fā)明可用于邏輯門(mén)的構(gòu)建。當(dāng)利用CCCCTG作為模板時(shí)，可以構(gòu)建ATP和CTP的與門(mén)，只有體系中同時(shí)存在ATP和CTP(GTP、UTP和聚合酶等過(guò)量)時(shí)，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)才能順利通過(guò)識(shí)別位點(diǎn)而轉(zhuǎn)錄成攜帶信號(hào)序列的RNA，使分子信標(biāo)產(chǎn)生熒光信號(hào)；而當(dāng)利用CCCCTA和CCCCGA同時(shí)作為模板時(shí)，則可以構(gòu)建ATP和CTP的或門(mén)，體系中只要存在ATP或CTP的一種或兩種(GTP、UTP和聚合酶等過(guò)量)，就可以轉(zhuǎn)錄出攜帶信號(hào)序列的RNA，使分子信標(biāo)產(chǎn)生熒光信號(hào)。

本發(fā)明還可用于檢測(cè)樣品中NTP/[NDP+NMP]的比值。當(dāng)將模板鏈上的識(shí)別位點(diǎn)設(shè)置在起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)時(shí)，由于起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)可以摻入NDP和NMP，其反應(yīng)效率與NTP一致，此時(shí)若反應(yīng)體系中同時(shí)存在與目標(biāo)NTP具有相同堿基的NDP和NMP時(shí)，則所測(cè)結(jié)果為[NTP+NDP+NMP]的總含量。而當(dāng)將識(shí)別位點(diǎn)設(shè)置在轉(zhuǎn)錄區(qū)域中間如優(yōu)化的模板序列時(shí)，只有目標(biāo)NTP才能參與轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，NDP和NMP由于缺少r-磷酸基團(tuán)而無(wú)法參與轉(zhuǎn)錄延伸反應(yīng)，因此所測(cè)結(jié)果為NTP的含量，將[NTP+NDP+NMP]的總含量減去NTP的含量即可得[NDP+NMP]的含量，，最終計(jì)算得到樣品NTP/NDP+NMP的比值，從而可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)際樣品中NTP/[NDP+NMP]的值，由此反映細(xì)胞的生理狀態(tài)、監(jiān)測(cè)治療效果、揭示功能機(jī)制。

本發(fā)明首次提出基于RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器快速多重檢測(cè)NTP的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下明顯優(yōu)點(diǎn)：

(1)通用性強(qiáng)，是目前唯一一種可以同時(shí)用于四種NTP的傳感檢測(cè)方法。通過(guò)簡(jiǎn)單的改變模板鏈和編碼鏈的序列、其余過(guò)量NTP的組成和相匹配的分子信標(biāo)，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP、CTP、UTP和GTP的檢測(cè)。

(2)反應(yīng)體系簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜的探針設(shè)計(jì)和合成步驟。反應(yīng)所用的組分均為商業(yè)化試劑，反應(yīng)時(shí)只需將各組分簡(jiǎn)單混合即可。

(3)一鍋法的檢測(cè)模式，有利于反應(yīng)過(guò)程的即時(shí)監(jiān)測(cè)。通過(guò)分子信標(biāo)與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的結(jié)合所導(dǎo)致的熒光基團(tuán)的信號(hào)恢復(fù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)待測(cè)NTP所參與的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的即時(shí)快速監(jiān)測(cè)，無(wú)需復(fù)雜的分離和純化步驟，簡(jiǎn)化操作。而且熒光標(biāo)記基團(tuán)的熒光信號(hào)比化學(xué)發(fā)光更加穩(wěn)定。

(4)超快速檢測(cè)，極大將檢測(cè)時(shí)間縮短至1分鐘之內(nèi)，使得檢測(cè)更加高效快捷。

(5)高靈敏度，可檢測(cè)濃度低至1nM，絕對(duì)含量低至20fmol的待測(cè)NTP樣品，極大地縮減了對(duì)實(shí)際樣品數(shù)量的要求，節(jié)省樣品。

(6)寬的定量范圍，可檢測(cè)1～10000nM的濃度范圍(絕對(duì)含量0.02～200pmol)，且線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

(7)高選擇性，首次通過(guò)利用RNA聚合酶的活性中心、Watson-Crick堿基配對(duì)原則和來(lái)自酸酐鍵裂解的轉(zhuǎn)錄驅(qū)動(dòng)力分別識(shí)別核糖、堿基和磷酸三個(gè)部分，從而為分子機(jī)器提供一種三重保障選擇性的識(shí)別元件，并通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄序列的篩選和優(yōu)化，有效避免了dNTPs、NDPs和NMPs的干擾，使得檢測(cè)具有更高的可靠性和準(zhǔn)確性。

(8)高通量檢測(cè)，根據(jù)熒光檢測(cè)儀器的通量可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)離心管或96孔板的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)多組樣品的高通量檢測(cè)，加樣可以用排槍加樣，易于自動(dòng)化。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明基于RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器檢測(cè)ATP的原理示意圖。

圖2本發(fā)明實(shí)施例1中對(duì)三種商業(yè)RNA聚合酶的性能比較。

圖3本發(fā)明實(shí)施例2中對(duì)NTPs的模板鏈上識(shí)別位點(diǎn)附近的序列優(yōu)化結(jié)果，其中(a)(b)ATP的模板序列優(yōu)化；(c)CTP的模板序列優(yōu)化；(d)UTP的模板序列優(yōu)化；(e)(f)GTP的模板序列優(yōu)化。

圖4本發(fā)明實(shí)施例3中對(duì)NTPs的檢測(cè)范圍與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)結(jié)果，其中：(a)標(biāo)準(zhǔn)品為ATP；(b)標(biāo)準(zhǔn)品為CTP；(c)標(biāo)準(zhǔn)品為UTP；(d)標(biāo)準(zhǔn)品為GTP。

圖5本發(fā)明實(shí)施例4中NTPs的選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中：(a)對(duì)ATP的選擇性；(b)對(duì)CTP的選擇性；(c)對(duì)UTP的選擇性；(d)對(duì)GTP的選擇性。

圖6本發(fā)明實(shí)施例6中邏輯門(mén)的構(gòu)建原理圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖，通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明的技術(shù)方案是，根據(jù)RNA聚合酶的活性中心、Watson-Crick堿基配對(duì)原則和來(lái)自酸酐鍵裂解的轉(zhuǎn)錄驅(qū)動(dòng)力分別識(shí)別核糖、堿基和磷酸三個(gè)部分，從而為分子機(jī)器提供一種三重保障選擇性的識(shí)別元件，通過(guò)在模板鏈上設(shè)置待測(cè)NTP的互補(bǔ)堿基作為識(shí)別位點(diǎn)，在RNA聚合酶和其他三種非目標(biāo)NTPs過(guò)量存在時(shí)，將目標(biāo)NTP通過(guò)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)而轉(zhuǎn)化為RNA分子，進(jìn)而通過(guò)分子信標(biāo)(molecular beacon,MB)的環(huán)部序列對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的信號(hào)序列進(jìn)行特異性識(shí)別和結(jié)合，使得分子信標(biāo)的構(gòu)象發(fā)生變化而得以恢復(fù)熒光信號(hào)，從而通過(guò)熒光信號(hào)實(shí)時(shí)指示體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器的動(dòng)力學(xué)作用過(guò)程并對(duì)目標(biāo)待測(cè)的NTP進(jìn)行快速準(zhǔn)確的定量檢測(cè)。

所述RNA聚合酶，又稱(chēng)轉(zhuǎn)錄酶，是催化以DNA為模板、NTPs為底物、通過(guò)磷酸二酯鍵合成RNA過(guò)程的酶。作為模板的雙鏈DNA中，指導(dǎo)RNA合成的一股鏈叫做模板鏈(template strand)或反義鏈(antisense strand)，與此相對(duì)的另一股鏈叫做編碼鏈(coding strand)或有意義鏈(sense strand)，除了用T代替U外，編碼鏈的其余堿基序列與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA序列相同。RNA聚合酶辨認(rèn)和結(jié)合的DNA部位稱(chēng)為啟動(dòng)子(promoter)，且對(duì)啟動(dòng)子具有高度專(zhuān)一性。RNA聚合酶可以完整的雙鏈DNA為模板，也可以包含啟動(dòng)子雙鏈的不完整雙鏈DNA為模板。RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄過(guò)程可劃分為三步：(1)啟動(dòng)子DNA結(jié)合RNA聚合酶，并與轉(zhuǎn)錄5’端首位核苷酸形成起始復(fù)合物；(2)轉(zhuǎn)錄延伸，以首位核苷酸的3’-OH逐漸加入NTPs形成磷酸二酯鍵，從5’向3’端合成RNA；(3)轉(zhuǎn)錄終止。RNA聚合酶結(jié)構(gòu)域上重要的氨基酸對(duì)NTPs起著特異性區(qū)分作用，可有效區(qū)分NTPs和dNTPs。

本發(fā)明所用的RNA聚合酶可由任何一種類(lèi)別和來(lái)源的RNA聚合酶參與，例如：噬菌體RNA聚合酶(T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶，SP6 RNA聚合酶，K11 RNA聚合酶和BA14 RNA聚合酶)，原核生物RNA聚合酶(大腸桿菌RNA聚合酶)，真核生物的RNA聚合酶(RNA聚合酶Ⅰ,RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ，現(xiàn)對(duì)噬菌體RNA聚合酶及其啟動(dòng)子序列列舉如下，但不限于以下方案：

1)T7 RNA聚合酶，高度特異識(shí)別T7啟動(dòng)子，序列如下：

編碼鏈(5'→3')：TAATACGACTCACTATAGGGAGA(下劃線(xiàn)為固定序列，加粗部分為轉(zhuǎn)錄生成RNA的起始序列，且可根據(jù)待測(cè)NTP和檢測(cè)需要來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)和優(yōu)化，下同)

2)T3 RNA聚合酶，高度特異識(shí)別T3啟動(dòng)子，序列如下：

編碼鏈(5'→3')：AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA

3)SP6 RNA聚合酶，高度特異識(shí)別SP6啟動(dòng)子，序列如下：

編碼鏈(5'→3')：ATTTAGGTGACACTATAGAAGAA

4)K11 RNA聚合酶，高度特異識(shí)別K11啟動(dòng)子，序列如下：

編碼鏈(5'→3')：AATTAGGGCACACTATAGGGAGA

5)BA14 RNA聚合酶，高度特異識(shí)別BA14啟動(dòng)子，序列如下：

編碼鏈(5'→3')：TAATACGACTCACTAATGCGAGA

所述DNA轉(zhuǎn)錄模板與核苷酸之間的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則是指模板鏈的堿基與NTP的堿基之間存在的一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，即腺嘌呤(adenine,A)一定與尿嘧啶(uracil,U)配對(duì)(在DNA中一定與胸腺嘧啶(Thymine,T)配對(duì))，鳥(niǎo)嘌呤(Guanine,G)一定與胞嘧啶(Cytosine,C)配對(duì)，反之亦然。堿基互補(bǔ)配對(duì)原則確保體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器對(duì)NTPs的堿基具有特異性識(shí)別和選擇作用。

所述模板鏈上的識(shí)別位點(diǎn)是指根據(jù)待測(cè)定NTP的堿基類(lèi)型和堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在模板鏈上設(shè)置與其配對(duì)的堿基作為識(shí)別位點(diǎn)。該識(shí)別位點(diǎn)是人為設(shè)置的，其數(shù)目和位置均可根據(jù)需要調(diào)動(dòng)。與此相反的是非識(shí)別位點(diǎn)，指排除識(shí)別位點(diǎn)堿基類(lèi)型的其余三種堿基類(lèi)型，非識(shí)別位點(diǎn)不能與待測(cè)定NTP互補(bǔ)配對(duì)。模板鏈上除識(shí)別位點(diǎn)之外的其他堿基均為非識(shí)別位點(diǎn)。

本發(fā)明中識(shí)別位點(diǎn)的個(gè)數(shù)與轉(zhuǎn)錄一條RNA產(chǎn)物所消耗的待測(cè)NTP的個(gè)數(shù)呈正相關(guān)，進(jìn)而RNA產(chǎn)物的數(shù)量與體系中待測(cè)NTP的數(shù)量呈正相關(guān)，以此為依據(jù)對(duì)待測(cè)NTP進(jìn)行定量。識(shí)別位點(diǎn)的個(gè)數(shù)至少為1，多則不限，但隨著識(shí)別位點(diǎn)個(gè)數(shù)的增多，體系對(duì)待測(cè)NTP的檢測(cè)范圍和檢測(cè)限會(huì)向高濃度偏移，靈敏度也隨之降低。為追求高的靈敏度，本發(fā)明中識(shí)別位點(diǎn)的典型個(gè)數(shù)設(shè)置為1。另外，識(shí)別位點(diǎn)前后的堿基類(lèi)型及數(shù)目可以根據(jù)需要來(lái)設(shè)計(jì)和優(yōu)化，以最大程度的提高轉(zhuǎn)錄效率和信號(hào)窗口，降低反應(yīng)陰性溶液的背景信號(hào)。

所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA是指在目標(biāo)NTP和其余三種過(guò)量的NTPs存在下，由RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)順利通過(guò)識(shí)別位點(diǎn)，將目標(biāo)NTP分子通過(guò)磷酸二酯鍵合成到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA分子內(nèi)部，并且將模板鏈上識(shí)別位點(diǎn)之后的堿基序列包括能被分子信標(biāo)識(shí)別的信號(hào)序列依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則而完整轉(zhuǎn)錄所得到的RNA鏈。

所述分子信標(biāo)是一條呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的短鏈DNA，一端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記猝滅基團(tuán)。熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)選自常用的FRET基團(tuán)對(duì)，如熒光基團(tuán)FAM和猝滅基團(tuán)DABCYL或BHQ1或TAMRA，熒光基團(tuán)ROX和猝滅基團(tuán)BHQ2等。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的信號(hào)序列可通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與分子信標(biāo)結(jié)合，導(dǎo)致分子信標(biāo)的構(gòu)象發(fā)生變化，由初始莖部結(jié)合和熒光基團(tuán)被猝滅基團(tuán)猝滅的狀態(tài)變?yōu)榍o部打開(kāi)和熒光基團(tuán)熒光信號(hào)恢復(fù)的狀態(tài)，從而生成實(shí)時(shí)熒光上升曲線(xiàn)來(lái)對(duì)RNA聚合酶催化、待測(cè)NTP參與的體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器的運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)反應(yīng)。

本發(fā)明的定量模式可選用以下任意一種，但不限于以下方法：

(1)根據(jù)熒光上升速率或相對(duì)速率與待測(cè)NTP的濃度或絕對(duì)含量建立線(xiàn)性關(guān)系。熒光曲線(xiàn)隨時(shí)間呈現(xiàn)直線(xiàn)上升階段的斜率值，即為熒光上升速率。相對(duì)速率等于含目標(biāo)物體系的熒光上升速率與不含目標(biāo)物的空白溶液的熒光上升速率的比值。通過(guò)取反應(yīng)前1分鐘內(nèi)的熒光上升速率或相對(duì)速率，可將檢測(cè)時(shí)間極大縮短至1分鐘。以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果默認(rèn)采用此定量方法。

(2)根據(jù)熒光強(qiáng)度值與待測(cè)NTP的濃度或絕對(duì)含量建立線(xiàn)性關(guān)系。具體可以根據(jù)同一時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，也可根據(jù)熒光平臺(tái)值。

本發(fā)明對(duì)待測(cè)NTP的檢測(cè)模式可以分為兩類(lèi)：第一類(lèi)，每個(gè)反應(yīng)離心管中只檢測(cè)一種NTP；第二類(lèi)，每個(gè)反應(yīng)離心管中同時(shí)檢測(cè)兩種NTPs?，F(xiàn)列舉檢測(cè)思路如下，但不限于以下方案：

(1)每個(gè)反應(yīng)離心管中只檢測(cè)一種NTP，可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)離心管中不同種類(lèi)NTPs的檢測(cè)。

(2)每個(gè)反應(yīng)離心管中同時(shí)檢測(cè)兩種NTPs，并可進(jìn)行任意兩種NTPs的組合。這里以ATP與CTP組合為例進(jìn)行說(shuō)明：ATP模板鏈的非識(shí)別位點(diǎn)僅由C、A組成，不設(shè)置G；與此同時(shí)，CTP模板鏈的非識(shí)別位點(diǎn)也僅由C、A組成，不設(shè)置T，但兩者的信號(hào)序列和分子信標(biāo)的環(huán)部設(shè)計(jì)不相同，熒光基團(tuán)也用不同種類(lèi)來(lái)分別標(biāo)記兩者的分子信標(biāo)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同模板鏈的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分別響應(yīng)。如此，對(duì)于ATP的檢測(cè)，轉(zhuǎn)錄僅消耗GTP、UTP和目標(biāo)物ATP，不消耗CTP，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA僅能識(shí)別其相應(yīng)的分子信標(biāo)，產(chǎn)生相應(yīng)的熒光信號(hào)，而對(duì)CTP的檢測(cè)毫無(wú)影響。同樣CTP的檢測(cè)也不會(huì)影響ATP的檢測(cè)。在雙熒光通道的檢測(cè)模式下，實(shí)現(xiàn)同一反應(yīng)體系中對(duì)兩種NTPs的同時(shí)檢測(cè)，互不干擾。

下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1<以ATP為待測(cè)目標(biāo)物，比較三種商業(yè)RNA聚合酶對(duì)體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器的性能影響>

根據(jù)圖1的原理示意圖，以ATP為模型，在其余NTPs過(guò)量存在的情況下，向基于RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器中加入ATP時(shí)，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將順利通過(guò)識(shí)別位點(diǎn)，合成包括待測(cè)ATP和后續(xù)信號(hào)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA，該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的信號(hào)序列被分子信標(biāo)的環(huán)部識(shí)別，使分子信標(biāo)的構(gòu)象發(fā)生變化而導(dǎo)致熒光基團(tuán)的信號(hào)得以恢復(fù)，從而將ATP以1:1的信號(hào)模式轉(zhuǎn)換為RNA和分子信標(biāo)的熒光信號(hào)。

為比較三種常見(jiàn)的商業(yè)RNA聚合酶對(duì)該體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器的性能影響，現(xiàn)選用T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶，分別將模板鏈和編碼鏈的啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)為各自的啟動(dòng)子序列，識(shí)別位點(diǎn)前后堿基與信號(hào)序列完全一致。三種RNA聚合酶各自擁有空白體系和目標(biāo)物體系，通過(guò)綜合比較各自空白體系的熒光上升速率、目標(biāo)物體系的熒光上升速率以及由目標(biāo)物與空白比值所得的相對(duì)速率，熒光上升速率和相對(duì)速率均較大者視為性能較優(yōu)的RNA聚合酶。

檢測(cè)具體步驟如下：

如無(wú)特殊說(shuō)明，反應(yīng)體積均為20μL，實(shí)驗(yàn)條件均為1x反應(yīng)緩沖液[100μg/mL BSA，40mM Tris-HCl(pH 7.9)，6mM MgCl₂，2mM亞精胺，10mM DTT]，反應(yīng)時(shí)加入用1x反應(yīng)緩沖液溶解的預(yù)雜交的模板鏈和編碼鏈(濃度比1:1)、用1x反應(yīng)緩沖液溶解的預(yù)退火的分子信標(biāo)(終濃度均為200nM)，并加入終濃度各0.5mM的其余三種非待測(cè)NTPs，另加入RNase inhibitor(終濃度1U/μL)以避免轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的降解，最后加入與模板啟動(dòng)子相匹配的RNA聚合酶，在37℃進(jìn)行溫育。以上所述即為空白體系組成。向反應(yīng)中加入ATP(終濃度為1μM)，則為目標(biāo)物體系。同一反應(yīng)原則上保證至少三份平行樣。

檢測(cè)時(shí)使用的儀器為Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀，采用488nm氬離子激光器光源，一次最多可同時(shí)分析96個(gè)樣品，可檢測(cè)大量實(shí)驗(yàn)樣品。熒光檢測(cè)時(shí)的參數(shù)設(shè)置：Green通道，37℃,5s/cycle,200cycles，即每5s檢測(cè)一次熒光強(qiáng)度。

模板鏈與編碼鏈的預(yù)雜交、分子信標(biāo)的預(yù)退火條件：90℃90s，70℃90s，50℃90s，37℃180s。

定量步驟：(a)取各反應(yīng)從起始到1分鐘內(nèi)熒光曲線(xiàn)隨時(shí)間呈現(xiàn)直線(xiàn)上升階段的斜率值，即為熒光上升速率。(b)目標(biāo)物體系與空白體系的熒光上升速率之比，即為相對(duì)速率，其中空白體系的相對(duì)速率為1。(c)以不同種類(lèi)的RNA聚合酶為x軸，其目標(biāo)物體系和空白體系的熒光上升速率為左y軸，相對(duì)速率為右y軸，分別做柱狀與折線(xiàn)圖，如圖2所示。

在本實(shí)施例中，編碼鏈、模板鏈、分子信標(biāo)的序列如下：

T7 RNA聚合酶體系

編碼鏈5’-TAATACGACTCACTATAGGGATTGTTGTGGTGTGTTGGTT-3’

模板鏈5’-AACCAACACACCACAACAATCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’

T3 RNA聚合酶體系

編碼鏈5’-AATTAACCCTCACTAAAGGGATTGTTGTGGTGTGTTGGTT-3’

模板鏈5’-AACCAACACACCACAACAATCCCTTTAGTGAGGGTTAATT-3’

SP6 RNA聚合酶體系

編碼鏈5’-ATTTAGGTGACACTATAGGGATTGTTGTGGTGTGTTGGTT-3’

模板鏈5’-AACCAACACACCACAACAATCCCTATAGTGTCACCTAAAT-3’

以上三類(lèi)RNA聚合酶的體系均用下述分子信標(biāo)

分子信標(biāo)5’-FAM-CCTGGCAACCAACACACCACAACATGCCAGG-DABCYL-3’

(編碼鏈中斜體對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)錄序列，下劃線(xiàn)為目標(biāo)位點(diǎn)，粗體對(duì)應(yīng)于RNA的信號(hào)序列可被分子信標(biāo)識(shí)別。模板鏈中斜體為轉(zhuǎn)錄序列，下劃線(xiàn)為識(shí)別位點(diǎn)。分子信標(biāo)中下劃線(xiàn)為莖部序列，粗體為用于識(shí)別RNA信號(hào)序列的環(huán)部。)

其余NTP組成為：CTP、UTP、GTP，T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶的濃度均為2U/μL。Rotor-Gene Q的Gain設(shè)為7。

從圖2可以看出，T7 RNA聚合酶的相對(duì)速率遠(yuǎn)大于T3 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶，即T7 RNA聚合酶的性能最優(yōu)。因此以下實(shí)施例中默認(rèn)所用的RNA聚合酶為T(mén)7 RNA聚合酶。

實(shí)施例2<基于RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器中不同NTPs的模板鏈的序列優(yōu)化>

在該實(shí)施例中，我們首先以ATP為目標(biāo)物，當(dāng)改變目標(biāo)位點(diǎn)T前后的堿基類(lèi)型時(shí)，發(fā)現(xiàn)可以顯著改變目標(biāo)體系和空白體系的熒光上升速率，并由此影響相對(duì)速率的大小。而相對(duì)速率作為信號(hào)窗口的指示，其數(shù)值越大，則表明信號(hào)窗口越大，轉(zhuǎn)錄機(jī)器的性能更優(yōu)。在對(duì)ATP的模板轉(zhuǎn)錄區(qū)域序列進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，主要分為三步：(1)固定識(shí)別位點(diǎn)及上游序列相同，比較識(shí)別位點(diǎn)下游相鄰堿基類(lèi)型；(2)將下游相鄰堿基設(shè)為最優(yōu)堿基，改變和比較識(shí)別位點(diǎn)上游相鄰堿基的類(lèi)型；(3)將上下游相鄰堿基均設(shè)為最優(yōu)堿基，比較轉(zhuǎn)錄起始模板堿基C的個(gè)數(shù)。并且將ATP的檢測(cè)原理(圖1)和上述模板優(yōu)化的規(guī)律，分別擴(kuò)展至CTP、UTP和GTP的檢測(cè)及模板轉(zhuǎn)錄區(qū)域的序列優(yōu)化(圖3)。

檢測(cè)具體步驟如下：

如無(wú)特殊說(shuō)明，反應(yīng)體積均為20μL，實(shí)驗(yàn)條件均為1x反應(yīng)緩沖液[100μg/mL BSA，40mM Tris-HCl(pH 7.9)，6mM MgCl₂，2mM亞精胺，10mM DTT]，反應(yīng)時(shí)加入用1x反應(yīng)緩沖液溶解的預(yù)雜交的模板鏈和編碼鏈(濃度比1:1)、用1x反應(yīng)緩沖液溶解的預(yù)退火的分子信標(biāo)(終濃度均為200nM)，并加入終濃度各0.5mM的其余三種非待測(cè)NTPs，另加入RNase inhibitor(終濃度1U/μL)以避免轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的降解，最后加入一定濃度的T7 RNA聚合酶，在37℃進(jìn)行溫育。以上所述即為空白體系組成。向反應(yīng)中加入一定濃度的目標(biāo)NTP，則為目標(biāo)物體系。同一反應(yīng)原則上保證至少三份平行樣。

檢測(cè)時(shí)使用的儀器為Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀，采用488nm氬離子激光器光源，一次最多可同時(shí)分析96個(gè)樣品，可檢測(cè)大量實(shí)驗(yàn)樣品。熒光檢測(cè)時(shí)的參數(shù)設(shè)置：Green通道，37℃,5s/cycle,200cycles，即每5s檢測(cè)一次熒光強(qiáng)度。

模板鏈與編碼鏈的預(yù)雜交、分子信標(biāo)的預(yù)退火條件：90℃90s，70℃90s，50℃90s，37℃180s。

定量步驟：(a)取各反應(yīng)從起始到1分鐘內(nèi)熒光曲線(xiàn)隨時(shí)間呈現(xiàn)直線(xiàn)上升階段的斜率值，即為熒光上升速率。(b)目標(biāo)物體系與空白體系的熒光上升速率之比，即為相對(duì)速率，其中空白體系的相對(duì)速率為1。(c)以某一組模板鏈的含目標(biāo)物體系的熒光上升速率為參照值，對(duì)同一目標(biāo)NTP的不同模板序列的目標(biāo)體系和空白體系的熒光上升速率均除以同一實(shí)驗(yàn)條件下該參照序列的目標(biāo)體系的熒光上升速率，由此得到歸一化的熒光上升速率；將不同模板序列的相對(duì)速率均除以同一條件下該參照序列的相對(duì)速率，由此得到歸一化的相對(duì)速率；(d)以不同目標(biāo)NTP的模板序列為x軸，其目標(biāo)物體系和空白體系的歸一化的熒光上升速率為左y軸，歸一化的相對(duì)速率為右y軸，分別做柱狀與折線(xiàn)圖。

1.ATP的模板序列優(yōu)化

在該實(shí)施例中，作為歸一化參照序列的編碼鏈、模板鏈、分子信標(biāo)的序列如下：

編碼鏈5’TAATACGACTCACTATAGGGACTGTTGTGGTGTGTTGGTT-3’

模板鏈5’-AACCAACACACCACAACAGTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’

分子信標(biāo)5’-FAM-CCTGGCAACCAACACACCACAACATGCCAGG-DABCYL-3’

(編碼鏈中斜體對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)錄序列，下劃線(xiàn)為包含識(shí)別位點(diǎn)的優(yōu)化區(qū)域(可變區(qū))，粗體對(duì)應(yīng)于RNA的信號(hào)序列可被分子信標(biāo)識(shí)別。模板鏈中斜體為轉(zhuǎn)錄序列，下劃線(xiàn)為包含識(shí)別位點(diǎn)的優(yōu)化區(qū)域(可變區(qū))。分子信標(biāo)中下劃線(xiàn)為莖部序列，粗體為識(shí)別RNA信號(hào)序列的環(huán)部。下同)

其中包含識(shí)別位點(diǎn)的模板序列優(yōu)化區(qū)域(可變區(qū))從3’末端起始轉(zhuǎn)錄點(diǎn)至5’方向如下：

CCCTG、CCCTA、CCCTC、CCCATG、CCCGTG、CCCCTG、CCCCCTG、CCCCCCTG、CCCCCCCTG(轉(zhuǎn)錄起始區(qū)連續(xù)C序列可以縮寫(xiě)為(C)n，n為C的個(gè)數(shù))

ATP的模板序列優(yōu)化結(jié)果如圖3(a)和(b)所示，不同的熒光上升速率和相對(duì)速率反映了RNA聚合酶對(duì)不同堿基類(lèi)型的不同親和力及對(duì)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和保真性的影響。

(1)當(dāng)識(shí)別位點(diǎn)T的下游相鄰堿基為G時(shí)具有更大的相對(duì)速率，相比之下當(dāng)下游相鄰堿基為A時(shí)，目標(biāo)體系的熒光上升速率較低導(dǎo)致相對(duì)速率較低，這表明RNA聚合酶對(duì)UTP的親和力非常弱，對(duì)A堿基的親和力較強(qiáng)，使得RNA聚合酶在模板鏈上的遷移減緩，從而使后續(xù)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的速率降低；而當(dāng)下游相鄰堿基為C時(shí)，空白體系的熒光上升速率較大導(dǎo)致相對(duì)速率減小，這表明RNA聚合酶對(duì)GTP有著非常強(qiáng)的親和力，與模板鏈C的親和作用較弱，RNA聚合酶在模板鏈上的遷移非常快，使得在沒(méi)有目標(biāo)物ATP存在下，識(shí)別位點(diǎn)的錯(cuò)誤摻入率增加，從而影響了識(shí)別位點(diǎn)的保真性，使相對(duì)速率降低。

(2)在固定下游相鄰堿基為G時(shí)，比較識(shí)別位點(diǎn)上游相鄰堿基發(fā)現(xiàn)，C堿基比G和A更優(yōu)，這是因?yàn)镽NA聚合酶對(duì)模板G和A的親和力較強(qiáng)，從而使其在模板鏈上的遷移速率大大降低，與此同時(shí)相鄰堿基為A時(shí)，UTP的摻入會(huì)增加識(shí)別位點(diǎn)處的錯(cuò)誤摻入率，從而使其空白體系的熒光上升速率增加，導(dǎo)致其相對(duì)速率比模板G更低。

(3)由于RNA聚合酶對(duì)GTP作為起始聚合核苷酸具有非常強(qiáng)的偏好性，因此固定識(shí)別位點(diǎn)上下游堿基分別為C和G，比較模板鏈起始轉(zhuǎn)錄區(qū)C堿基的個(gè)數(shù)發(fā)現(xiàn)4個(gè)連續(xù)的C最佳。隨著C的繼續(xù)增加，雖然目標(biāo)體系的熒光上升速率大大增加，但空白體系的熒光上升速率同時(shí)急劇增大，導(dǎo)致相對(duì)速率反而減小。

綜上所述，ATP的最優(yōu)模板序列(可變區(qū)3’→5’)為CCCCTG。

2.標(biāo)準(zhǔn)品CTP的檢測(cè)及其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢測(cè)限

在該實(shí)施例中，作為歸一化參照序列的編碼鏈、模板鏈、分子信標(biāo)的序列如下：

編碼鏈5’-TAATACGACTCACTATAGGGGACATGTTGTGGTGTGTTGGTT-3’

模板鏈5’-AACCAACACACCACAACATGTCCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’

分子信標(biāo)5’-FAM-CCTGGCAACCAACACACCACAACATGCCAGG-DABCYL-3’

其中包含識(shí)別位點(diǎn)的模板序列優(yōu)化區(qū)域(可變區(qū))從3’末端起始轉(zhuǎn)錄點(diǎn)至5’方向如下：

CCCCTGT、CCCCTGA、CCCCTGC、CCCCAGT、CCCCGT、CCCCCTGT(轉(zhuǎn)錄起始區(qū)連續(xù)C序列可以縮寫(xiě)為(C)n，n為C的個(gè)數(shù))

CTP的模板序列優(yōu)化結(jié)果如圖3(c)所示：

(1)當(dāng)識(shí)別位點(diǎn)G的下游相鄰堿基為T(mén)時(shí)具有更大的相對(duì)速率，相比之下當(dāng)下游相鄰堿基為A時(shí)，目標(biāo)體系的熒光上升速率較低導(dǎo)致相對(duì)速率較低，這表明RNA聚合酶對(duì)UTP的親和力非常弱，對(duì)A堿基的親和力較強(qiáng)，使得RNA聚合酶在模板鏈上的遷移減緩，從而使后續(xù)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的速率降低；而當(dāng)下游相鄰堿基為C時(shí)，空白體系的熒光上升速率較大導(dǎo)致相對(duì)速率減小，這表明RNA聚合酶對(duì)GTP有著非常強(qiáng)的親和力，與模板鏈C的親和作用較弱，RNA聚合酶在模板鏈上的遷移非常快，使得在沒(méi)有目標(biāo)物CTP存在下，識(shí)別位點(diǎn)的錯(cuò)誤摻入率增加，從而影響了識(shí)別位點(diǎn)的保真性，使相對(duì)速率降低。這一點(diǎn)與ATP的模板優(yōu)化結(jié)果非常一致。

(2)在固定下游相鄰堿基為T(mén)時(shí)，比較識(shí)別位點(diǎn)上游相鄰堿基發(fā)現(xiàn)，T堿基比C和A更優(yōu)，這是因?yàn)镽NA聚合酶對(duì)模板A的親和力較強(qiáng)，從而使其在模板鏈上的遷移速率大大降低，與此同時(shí)相鄰堿基為A時(shí)，UTP的摻入會(huì)增加識(shí)別位點(diǎn)處的錯(cuò)誤摻入率，從而使其空白體系的熒光上升速率增加，導(dǎo)致其相對(duì)速率比模板G更低。而當(dāng)相鄰堿基為C時(shí)，雖然目標(biāo)體系的熒光上升速率比堿基為A時(shí)較大，但由于RNA聚合酶在此位點(diǎn)遷移過(guò)快，而使識(shí)別位點(diǎn)的錯(cuò)誤摻入率有所增加，從而也使相對(duì)速率較低。

(3)與ATP的模板優(yōu)化結(jié)果相同，CTP的模板鏈起始轉(zhuǎn)錄區(qū)也是4個(gè)連續(xù)的C堿基最佳。隨著C的繼續(xù)增加，雖然目標(biāo)體系的熒光上升速率大大增加，但空白體系的熒光上升速率同時(shí)急劇增大，導(dǎo)致相對(duì)速率反而減小。

綜上所述，CTP的最優(yōu)模板序列(可變區(qū)3’→5’)為CCCCTGT。

3.標(biāo)準(zhǔn)品UTP的檢測(cè)及其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢測(cè)限

在該實(shí)施例中，作為歸一化參照序列的編碼鏈、模板鏈、分子信標(biāo)的序列如下：

編碼鏈5’-TAATACGACTCACTATAGGGGCTCACAACACCACACAACCAA-3’

模板鏈5’-TTGGTTGTGTGGTGTTGTGAGCCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’

分子信標(biāo)5’-FAM-CCTGGCTTGGTTGTGTGGTGTTGTAGCCAGG-DABCYL-3’

其中包含識(shí)別位點(diǎn)的模板序列優(yōu)化區(qū)域(可變區(qū))從3’末端起始轉(zhuǎn)錄點(diǎn)至5’方向如下：

CCCCGAG、CCCCGAT、CCCCGAC、CCCCTAG、CCCCAG(轉(zhuǎn)錄起始區(qū)連續(xù)C序列可以縮寫(xiě)為(C)n，n為C的個(gè)數(shù))

UTP的模板序列優(yōu)化結(jié)果如圖3(d)所示，與ATP和CTP所不同的是UTP作為目標(biāo)NTP時(shí)的空白體系熒光上升速率較大，表明UTP的識(shí)別位點(diǎn)處本身容易摻入錯(cuò)誤堿基，造成較差的保真性。由于不同序列的相對(duì)速率較為接近，因此主要通過(guò)比較空白體系的熒光上升速率來(lái)選擇最優(yōu)的模板序列。

(1)當(dāng)識(shí)別位點(diǎn)A的下游相鄰堿基為G時(shí)空白體系的熒光上升速率較低，相比之下當(dāng)下游相鄰堿基為T(mén)或C時(shí)，由于RNA聚合酶在模板鏈上的遷移速率過(guò)快，使得空白體系的熒光上升速率也較大，識(shí)別位點(diǎn)處的保真性降低。

(2)在固定下游相鄰堿基為G時(shí)，比較識(shí)別位點(diǎn)上游相鄰堿基發(fā)現(xiàn)，G堿基比C和T更優(yōu)，這是因?yàn)镽NA聚合酶對(duì)模板G的親和力較強(qiáng)，從而使其在模板鏈上的遷移速率大大降低，也使識(shí)別位點(diǎn)處錯(cuò)配的風(fēng)險(xiǎn)降低。而當(dāng)上游堿基為C和T時(shí)，RNA聚合酶的遷移過(guò)快，會(huì)使識(shí)別位點(diǎn)的錯(cuò)誤摻入率大大增加，從而也使相對(duì)速率較低。

綜上所述，UTP的最優(yōu)模板序列(可變區(qū)3’→5’)為CCCCGAG。

4.標(biāo)準(zhǔn)品GTP的檢測(cè)及其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢測(cè)限

在該實(shí)施例中，作為歸一化參照序列的編碼鏈、模板鏈、分子信標(biāo)的序列如下：

編碼鏈5’-TAATACGACTCACTATAGGACACAACACCACACAACCAA-3’

模板鏈5’-TTGGTTGTGTGGTGTTGTGTCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’

分子信標(biāo)5’-FAM-CCTGGCTTGGTTGTGTGGTGTTGTAGCCAGG-DABCYL-3’

其中包含識(shí)別位點(diǎn)的模板序列優(yōu)化區(qū)域(可變區(qū))從3’末端起始轉(zhuǎn)錄點(diǎn)至5’方向如下：CCT、CCG、CCA、CG、GCT、TCT、ACT

GTP的模板序列優(yōu)化結(jié)果如圖3(e)和(f)所示，由于GTP作為目標(biāo)物時(shí)，識(shí)別位點(diǎn)為C，為了保證體系的靈敏度，需要降低起始轉(zhuǎn)錄區(qū)域C即識(shí)別位點(diǎn)的個(gè)數(shù)，如1～2。

(1)當(dāng)識(shí)別位點(diǎn)C的下游相鄰堿基為T(mén)時(shí)空白體系的熒光上升速率較低，相對(duì)速率較大，為最優(yōu)堿基；相比之下當(dāng)下游相鄰堿基為G或A時(shí)，由于RNA聚合酶在模板鏈上的遷移速率過(guò)慢，使得目標(biāo)體系的熒光上升速率也較小，從而相對(duì)速率較低。

(2)在固定下游相鄰堿基為T(mén)時(shí)，比較識(shí)別位點(diǎn)上游相鄰堿基發(fā)現(xiàn)，G堿基比C和T更優(yōu)，此時(shí)模板鏈與RNA聚合酶的結(jié)合力強(qiáng)弱成為轉(zhuǎn)錄速率的決定因素，當(dāng)模板起始?jí)A基為G時(shí)，RNA聚合酶對(duì)模板G的強(qiáng)親和力使得其與模板鏈的結(jié)合力增強(qiáng)，從而使目標(biāo)體系的熒光上升速率較大；而模板起始?jí)A基為T(mén)和A時(shí)，由于RNA聚合酶較弱的親和力，從而使轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和熒光上升速率較低。

(3)盡管起始CG和CCT也有較大的相對(duì)速率，但由于轉(zhuǎn)錄起始核苷酸并不要求GTP酸酐鍵的斷裂和磷酸二酯鍵的形成，因此GMP和GDP也可以代替GTP參與轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從而使體系缺乏對(duì)GTP的選擇性。

綜上所述，GTP的最優(yōu)模板序列(可變區(qū)3’→5’)為GCT。

實(shí)施例3<基于RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器和優(yōu)化的模板序列對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品NTPs的檢測(cè)及其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)>

根據(jù)上述NTPs的轉(zhuǎn)錄區(qū)域模板序列優(yōu)化結(jié)果，采用各NTPs的最優(yōu)模板序列進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品NTPs的濃度梯度檢測(cè)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以獲得其線(xiàn)性范圍和檢測(cè)限。

檢測(cè)具體步驟如下：

如無(wú)特殊說(shuō)明，反應(yīng)體積均為20μL，實(shí)驗(yàn)條件均為1x反應(yīng)緩沖液[100μg/mL BSA，40mM Tris-HCl(pH 7.9)，6mM MgCl₂，2mM亞精胺，10mM DTT]，反應(yīng)時(shí)加入用1x反應(yīng)緩沖液溶解的預(yù)雜交的模板鏈和編碼鏈(濃度比1:1)、用1x反應(yīng)緩沖液溶解的預(yù)退火的分子信標(biāo)(終濃度均為200nM)，并加入終濃度各0.5mM的其余三種非待測(cè)NTP，另加入RNase inhibitor(終濃度1U/μL)以避免轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的降解，最終加入一定濃度的T7 RNA聚合酶，在37℃進(jìn)行溫育。以上所述即為反應(yīng)空白體系組成。向反應(yīng)中加入一定濃度的待測(cè)NTP，則為反應(yīng)目標(biāo)體系。同一反應(yīng)原則上保證至少三份平行樣。

檢測(cè)時(shí)使用的儀器為Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀，采用488nm氬離子激光器光源，一次最多可同時(shí)分析96個(gè)樣品，可檢測(cè)大量實(shí)驗(yàn)樣品。熒光檢測(cè)時(shí)的參數(shù)設(shè)置：Green通道，37℃,5s/cycle,200cycles，即每5s檢測(cè)一次熒光強(qiáng)度。

模板鏈與編碼鏈的預(yù)雜交、分子信標(biāo)的預(yù)退火條件：90℃90s，70℃90s，50℃90s，37℃180s。

定量步驟：(a)取各反應(yīng)從起始到1分鐘內(nèi)熒光曲線(xiàn)隨時(shí)間呈現(xiàn)直線(xiàn)上升階段的斜率值，即為熒光上升速率?？瞻左w系熒光上升速率的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差的數(shù)值所對(duì)應(yīng)的最低濃度即為檢測(cè)限。(b)目標(biāo)體系與空白體系的熒光上升速率之比，即為相對(duì)速率，其中空白體系的相對(duì)速率為1。(c)將各目標(biāo)體系待測(cè)NTP的絕對(duì)含量或濃度為x軸，其相對(duì)速率為y軸，做一次函數(shù)關(guān)系圖。(d)線(xiàn)性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、線(xiàn)性范圍和線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)。

1.標(biāo)準(zhǔn)品ATP的檢測(cè)及其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢測(cè)限

在該實(shí)施例中，編碼鏈、模板鏈、分子信標(biāo)的序列如下：

編碼鏈5’-TAATACGACTCACTATAGGGGACTGTTGTGGTGTGTTGGTT-3’

模板鏈5’-AACCAACACACCACAACAGTCCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’

分子信標(biāo)5’-FAM-CCTGGCAACCAACACACCACAACATGCCAGG-DABCYL-3’

(編碼鏈中斜體對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)錄序列，下劃線(xiàn)為目標(biāo)位點(diǎn)，粗體對(duì)應(yīng)于RNA的信號(hào)序列可被分子信標(biāo)識(shí)別。模板鏈中斜體為轉(zhuǎn)錄序列，下劃線(xiàn)為識(shí)別位點(diǎn)。分子信標(biāo)中下劃線(xiàn)為莖部序列，粗體為用于識(shí)別RNA信號(hào)序列的環(huán)部。下同)

體系中分別加入不同絕對(duì)含量的ATP(pmol):0,0.02,0.1,0.2,1,2,8,12,20,200。

ATP的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖4(a)所示，線(xiàn)性范圍是0.02～20pmol(1～1000nM)，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R²為0.998，檢測(cè)限低于0.02pmol(1nM)。

2.標(biāo)準(zhǔn)品CTP的檢測(cè)及其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢測(cè)限

在該實(shí)施例中，編碼鏈、模板鏈、分子信標(biāo)的序列如下：

編碼鏈5’-TAATACGACTCACTATAGGGGACATGTTGTGGTGTGTTGGTT-3’

模板鏈5’-AACCAACACACCACAACATGTCCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’

分子信標(biāo)5’-FAM-CCTGGCAACCAACACACCACAACATGCCAGG-DABCYL-3’

體系中分別加入不同絕對(duì)含量的CTP(pmol):0,0.2,0.4,1,2,10,20,40,80,200。

CTP的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖4(b)所示，線(xiàn)性范圍是0.2～80pmol(10～4000nM)，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R²為0.994，檢測(cè)限低于0.2pmol(10nM)。

3.標(biāo)準(zhǔn)品UTP的檢測(cè)及其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢測(cè)限

在該實(shí)施例中，編碼鏈、模板鏈、分子信標(biāo)的序列如下：

編碼鏈5’-TAATACGACTCACTATAGGGGCTCACAACACCACACAACCAA-3’

模板鏈5’-TTGGTTGTGTGGTGTTGTGAGCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’

分子信標(biāo)5’-FAM-CCTGGCTTGGTTGTGTGGTGTTGTAGCCAGG-DABCYL-3’

體系中分別加入不同絕對(duì)含量的UTP(pmol):0,0.1,0.2,0.4,1,2,8,16,20,40,80,200。

UTP的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖4(c)所示，線(xiàn)性范圍是0.1～80pmol(5～4000nM)，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R²為0.994，檢測(cè)限低于0.1pmol(5nM)。

4.標(biāo)準(zhǔn)品GTP的檢測(cè)及其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢測(cè)限

在該實(shí)施例中，編碼鏈、模板鏈、分子信標(biāo)的序列如下：

編碼鏈5’-TAATACGACTCACTATACGACACAACACCACACAACCAA-3’

模板鏈5’-TTGGTTGTGTGGTGTTGTGTCGTATAGTGAGTCGTATTA-3’

分子信標(biāo)5’-FAM-CCTGGCTTGGTTGTGTGGTGTTGTAGCCAGG-DABCYL-3’

體系中分別加入不同絕對(duì)含量的GTP(pmol):0,0.02,0.2,1,2,8,12,20,60,100,200。

GTP的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖4(d)所示，線(xiàn)性范圍是0.2～200pmol(10～10000nM)，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R²為0.990，檢測(cè)限為0.02pmol(1nM)。

實(shí)施例4<基于RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器對(duì)NTPs檢測(cè)的選擇性>

在該實(shí)施例中，由于相對(duì)速率將空白體系熒光上升速率的扣除，已經(jīng)排除了不同堿基類(lèi)型對(duì)目標(biāo)堿基的干擾。而基于RNA聚合酶對(duì)同一堿基類(lèi)型的不同類(lèi)核苷酸的區(qū)別能力，可能對(duì)目標(biāo)NTP的檢測(cè)造成干擾的物質(zhì)是同一堿基類(lèi)型的dNTP，NDP和NMP。為了證明基于RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器對(duì)NTP具有非常好的選擇性，向各NTP檢測(cè)體系中加入與目標(biāo)NTP等濃度的干擾物質(zhì)，根據(jù)各體系相對(duì)速率的大小和目標(biāo)NTP回收率的大小，驗(yàn)證本發(fā)明對(duì)NTP檢測(cè)的選擇性，具體步驟如下：

如無(wú)特殊說(shuō)明，反應(yīng)體積均為20μL，實(shí)驗(yàn)條件均為1x反應(yīng)緩沖液[100μg/mL BSA，40mM Tris-HCl(pH 7.9)，6mM MgCl₂，2mM亞精胺，10mM DTT]，反應(yīng)時(shí)加入預(yù)雜交的模板鏈和編碼鏈、預(yù)退火的分子信標(biāo)(終濃度均為200nM)，并加入終濃度各0.5mM的其余三種非待測(cè)NTP，另加入RNase inhibitor(終濃度1U/μL)以避免轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的降解，最終加入一定濃度的T7 RNA聚合酶，在37℃進(jìn)行溫育。以上所述即為反應(yīng)空白體系組成。向反應(yīng)中加入400nM的待測(cè)NTP，則為反應(yīng)目標(biāo)體系。向反應(yīng)中加入400nM的干擾物質(zhì)如dNTP，NDP和NMP，則為反應(yīng)干擾體系。向反應(yīng)中同時(shí)加入400nM的待測(cè)NTP和400nM的干擾物質(zhì)，則為反應(yīng)混合體系。同一反應(yīng)原則上保證至少三份平行樣。

檢測(cè)時(shí)使用的儀器為Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀，采用488nm氬離子激光器光源，一次最多可同時(shí)分析96個(gè)樣品，可檢測(cè)大量實(shí)驗(yàn)樣品。熒光檢測(cè)時(shí)的參數(shù)設(shè)置：Green通道，37℃,5s/cycle,200cycles，即每5s檢測(cè)一次熒光強(qiáng)度。

模板鏈與編碼鏈的預(yù)雜交、分子信標(biāo)的預(yù)退火條件：90℃90s，70℃90s，50℃90s，37℃180s。

數(shù)據(jù)處理步驟：(a)取各反應(yīng)從起始到1分鐘內(nèi)熒光曲線(xiàn)隨時(shí)間呈現(xiàn)直線(xiàn)上升階段的斜率值，即為熒光上升速率。各反應(yīng)體系與空白體系的熒光上升速率之比，即為相對(duì)速率。(b)反應(yīng)混合體系與反應(yīng)目標(biāo)物體系的熒光上升速率之比，即為待測(cè)NTP的回收率。(c)以目標(biāo)NTP及其干擾物質(zhì)為x軸，其各體系的相對(duì)速率為左y軸，待測(cè)NTP的回收率為右y軸，做柱狀圖。

1.ATP的選擇性

在該實(shí)施例中，編碼鏈、模板鏈、分子信標(biāo)的序列如下：

編碼鏈5’-TAATACGACTCACTATAGGGGACTGTTGTGGTGTGTTGGTT-3’

模板鏈5’-AACCAACACACCACAACAGTCCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’

分子信標(biāo)5’-FAM-CCTGGCAACCAACACACCACAACATGCCAGG-DABCYL-3’

各反應(yīng)體系中分別加入400nM的ATP、dATP、ADP、AMP、ATP+dATP、ATP+ADP、ATP+AMP。

ATP的選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5(a)所示，dATP、ADP和AMP的相對(duì)速率接近于1，ATP的相對(duì)速率明顯高于三者，回收率均控制在100±10％，證明本發(fā)明對(duì)ATP具有非常好的選擇性。

2.CTP的選擇性

在該實(shí)施例中，編碼鏈、模板鏈、分子信標(biāo)的序列如下：

編碼鏈5’-TAATACGACTCACTATAGGGGACATGTTGTGGTGTGTTGGTT-3’

模板鏈5’-AACCAACACACCACAACATGTCCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’

分子信標(biāo)5’-FAM-CCTGGCAACCAACACACCACAACATGCCAGG-DABCYL-3’

各反應(yīng)體系中分別加入400nM的CTP、dCTP、CDP、CMP、CTP+dCTP、CTP+CDP、CTP+CMP。

CTP的選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5(b)所示，dCTP、CDP和CMP的相對(duì)速率接近于1，CTP的相對(duì)速率明顯高于三者，回收率均控制在100±10％，證明本發(fā)明對(duì)CTP具有非常好的選擇性。

3.UTP的選擇性

在該實(shí)施例中，編碼鏈、模板鏈、分子信標(biāo)的序列如下：

編碼鏈5’-TAATACGACTCACTATAGGGGCTCACAACACCACACAACCAA-3’

模板鏈5’-TTGGTTGTGTGGTGTTGTGAGCCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’

分子信標(biāo)5’-FAM-CCTGGCTTGGTTGTGTGGTGTTGTAGCCAGG-DABCYL-3’

各反應(yīng)體系中分別加入400nM的UTP、dTTP、dUTP、UDP、UMP、UTP+dTTP、UTP+dUTP、UTP+UDP、UTP+UMP。

UTP的選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5(c)所示，dTTP、dUTP、UDP和UMP的相對(duì)速率接近于1，UTP的相對(duì)速率明顯高于四者，回收率均控制在100±10％，證明本發(fā)明對(duì)UTP具有非常好的選擇性。

4.GTP的選擇性

在該實(shí)施例中，編碼鏈、模板鏈、分子信標(biāo)的序列如下：

編碼鏈5’-TAATACGACTCACTATACGACACAACACCACACAACCAA-3’

模板鏈5’-TTGGTTGTGTGGTGTTGTGTCGTATAGTGAGTCGTATTA-3’

分子信標(biāo)5’-FAM-CCTGGCTTGGTTGTGTGGTGTTGTAGCCAGG-DABCYL-3’

各反應(yīng)體系中分別加入400nM的GTP、dGTP、GDP、GMP、GTP+dGTP、GTP+GDP、GTP+GMP。

GTP的選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5(d)所示，dGTP、GDP和GMP的相對(duì)速率接近于1，GTP的相對(duì)速率明顯高于三者，回收率均控制在100±10％，證明本發(fā)明對(duì)GTP具有非常好的選擇性。

實(shí)施例5<基于RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器對(duì)實(shí)際樣品中NTPs的檢測(cè)>

在該實(shí)施例中，實(shí)際樣品可為體外培養(yǎng)的組織樣品、細(xì)胞裂解液、腦脊液或血清等，既可檢測(cè)NTPs的正常含量水平、也可用作外界刺激或藥物處理后NTPs的含量變化。檢測(cè)時(shí)，根據(jù)實(shí)施例1做各NTPs的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和線(xiàn)性擬合關(guān)系式，并將實(shí)際樣品稀釋一定倍數(shù)使其相對(duì)速率落在相應(yīng)NTPs的線(xiàn)性范圍內(nèi)，根據(jù)所得線(xiàn)性擬合的一次函數(shù)關(guān)系式，將實(shí)際樣品的相對(duì)速率值代入獲得相應(yīng)NTPs的絕對(duì)含量或濃度。

樣品加標(biāo)回收率：取兩份相同樣品，其中一份加入定量的目標(biāo)NTP的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；兩份同時(shí)按實(shí)施例1進(jìn)行分析，加標(biāo)的一份所得的結(jié)果減去未加標(biāo)一份所得的結(jié)果，其差值同加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的理論值之比即為樣品加標(biāo)回收率。

以A549人小非肺癌細(xì)胞的細(xì)胞裂解液為例，具體實(shí)施步驟如下：

(1)細(xì)胞培養(yǎng)與裂解液的制備：A549細(xì)胞在含有10％胎牛血清、1％青霉素-鏈霉素的Ham’s F-12K(Kaighn’s)培養(yǎng)液中和37℃、5％CO₂的條件下培養(yǎng)。每2-3天傳代一次。當(dāng)細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用胰酶消化并分散在冰冷PBS中，用TC 10自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器和臺(tái)盼染料對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)和求比活率。然后3000g 4℃離心5min，細(xì)胞團(tuán)用500μL 60％甲醇懸浮，95℃3min，超聲30s。提取物離心16000g 4℃5min。用3kDa超濾管在14000g 4℃超濾2h。濾液在真空70℃條件下離心蒸發(fā)溶劑1h，所得顆粒再次懸浮于一定體積的無(wú)酶水中。存儲(chǔ)于-80℃以備檢測(cè)。

(2)對(duì)細(xì)胞提取物進(jìn)行不同稀釋倍數(shù)的探索，使其落在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性區(qū)間內(nèi)。根據(jù)實(shí)施例1中所描述的步驟做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、待測(cè)樣品、加標(biāo)樣品的檢測(cè)。這里用10⁴個(gè)細(xì)胞即可對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確定量，且檢測(cè)限低至10²～10³個(gè)細(xì)胞。結(jié)果如下：

實(shí)施例6<基于RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器用于邏輯門(mén)的構(gòu)建>

基于RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器不僅可以用于實(shí)際樣品中NTPs的檢測(cè)，還可用于邏輯門(mén)的構(gòu)建。由于其多重分析能力和簡(jiǎn)便的組裝特點(diǎn)，通過(guò)改變模板鏈和編碼鏈以及體系中非目標(biāo)NTPs的組成，即可將機(jī)器轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌倪壿嬮T(mén)。

在該實(shí)施例中，以ATP和CTP的“與”門(mén)和“或”門(mén)的構(gòu)建為代表進(jìn)行闡述，如圖6所示。

空白體系中含有模板鏈與編碼鏈的雙鏈DNA、分子信標(biāo)、反應(yīng)緩沖液、T7 RNA聚合酶、RNAP inhibitor和過(guò)量的GTP與UTP。

當(dāng)ATP或CTP的物質(zhì)的量大于0.02pmol時(shí)，邏輯輸入為1，當(dāng)n小于0.02pmol時(shí)，邏輯輸入為0；當(dāng)體系的相對(duì)速率大于1.0時(shí)，邏輯輸出為1，當(dāng)相對(duì)速率小于或等于1.0時(shí)，邏輯輸出為0。

(1)ATP和CTP的“與”門(mén)

在該實(shí)施例中，編碼鏈、模板鏈、分子信標(biāo)的序列如下：

編碼鏈5’-GATCACTAATACGACTCACTATAGGGGACTGTTGTGGTGTGTTGGTT-3’

模板鏈5’-AACCAACACACCACAACAGTCCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC-3’

分子信標(biāo)5’-FAM-CCTGGCAACCAACACACCACAACATGCCAGG-DABCYL-3’

ATP和CTP的“與”門(mén)所對(duì)應(yīng)的真值表為：只有當(dāng)ATP和CTP的邏輯輸入值均為1時(shí)，體系的邏輯輸出為1；其余輸入值時(shí)體系的邏輯輸出均為0.

(2)ATP和CTP的“或”門(mén)

在該實(shí)施例中，編碼鏈、模板鏈、分子信標(biāo)的序列如下：

編碼鏈-1 5’-TAATACGACTCACTATAGGGGATTGTTGTGGTGTGTTGGTT-3’

模板鏈-1 5’-AACCAACACACCACAACAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’

編碼鏈-2 5’-TAATACGACTCACTATAGGGGCTTGTTGTGGTGTGTTGGTT-3’

模板鏈-2 5’-AACCAACACACCACAACAAGCCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’

分子信標(biāo)5’-FAM-CCTGGCAACCAACACACCACAACATGCCAGG-DABCYL-3’

ATP和CTP的“或”門(mén)所對(duì)應(yīng)的真值表為：只有當(dāng)ATP和CTP的邏輯輸入值均為0時(shí)，體系的邏輯輸出為0；其余輸入值時(shí)體系的邏輯輸出均為1。

實(shí)施例7<基于RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器用于NTP/[NDP+NMP]的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)>

本發(fā)明還可用于NTP/[NDP+NMP]的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。當(dāng)將模板鏈上的識(shí)別位點(diǎn)設(shè)置在起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)時(shí)，由于起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)可以摻入NDP和NMP，其反應(yīng)效率與NTP一致，此時(shí)若反應(yīng)體系中同時(shí)存在與目標(biāo)NTP具有相同堿基的NDP和NMP時(shí)，則所測(cè)結(jié)果為[NTP+NDP+NMP]的總和。而當(dāng)將識(shí)別位點(diǎn)設(shè)置在轉(zhuǎn)錄區(qū)域中間如優(yōu)化的模板序列時(shí)，只有目標(biāo)NTP才能參與轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，NDP和NMP由于缺少r-磷酸基團(tuán)而無(wú)法參與轉(zhuǎn)錄延伸反應(yīng)，因此所測(cè)結(jié)果為NTP的值，將[NTP+NDP+NMP]減去NTP即可得[NDP+NMP]的含量，從而可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)際樣品中NTP/[NDP+NMP]的值，由此反映細(xì)胞的生理狀態(tài)、監(jiān)測(cè)治療效果、揭示功能機(jī)制。

在該實(shí)施例中，以GTP/[GDP+GMP]的計(jì)算為例：

編碼鏈、模板鏈、分子信標(biāo)的序列如下

編碼鏈-1 5’-TAATACGACTCACTATACGACACAACACCACACAACCAA-3’

模板鏈-1 5’-TTGGTTGTGTGGTGTTGTGTCGTATAGTGAGTCGTATTA-3’

編碼鏈-2 5’-TAATACGACTCACTATAGCACAACACCACACAACCAA-3’

模板鏈-2 5’-TTGGTTGTGTGGTGTTGTGTGCTATAGTGAGTCGTATTA-3’

分子信標(biāo)5’-FAM-CCTGGCTTGGTTGTGTGGTGTTGTAGCCAGG-DABCYL-3’

空白體系中含有模板鏈與編碼鏈的雙鏈DNA、分子信標(biāo)、反應(yīng)緩沖液、T7 RNA聚合酶、RNAP inhibitor和過(guò)量的ATP、CTP與UTP。在上述空白體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品GTP，或GTP、GDP和GMP的混合物，或包含有GTP、GDP和GMP的實(shí)際樣品，即為反應(yīng)目標(biāo)體系。

GTP/[GDP+GMP]的定量方法如下：(1)利用編碼鏈-1和模板鏈-1，參照實(shí)施例3中所述步驟繪制GTP的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并參照實(shí)施例5中所述由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)得樣品混合體系中GTP的含量；(2)利用編碼鏈-2和模板鏈-2參照實(shí)施例3中所述步驟繪制GTP的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并參照實(shí)施例5中所述由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)得樣品混合體系中[GTP+GDP+GMP]的總量；(3)將計(jì)算所得[GTP+GDP+GMP]的總量減去計(jì)算所得GTP的含量，即得[GDP+GMP]的總量，從而可獲得GTP/[GDP+GMP]的結(jié)果。

綜上所述，本發(fā)明基于RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄機(jī)器為四種不同的NTP提供了一種超快速、操作簡(jiǎn)單、定量準(zhǔn)確、高選擇性、高靈敏度、高通量、低成本的檢測(cè)方法，是目前唯一一種兼具以上優(yōu)點(diǎn)的方法，且易于開(kāi)發(fā)試劑盒，極大地方便了研究應(yīng)用和臨床檢測(cè)，具有非常大的科學(xué)意義和商業(yè)價(jià)值。