本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及鑒定多花多粒小麥-冰草漸滲系的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：小麥?zhǔn)鞘澜缰饕Z食作物之一，然而，在長期的馴化及栽培過程中遺傳多樣性逐漸降低，這嚴(yán)重阻礙了小麥新品種的培育。因此，提高小麥的遺傳多樣性變得尤為重要。小麥野生近緣種長期生長在自然環(huán)境中，經(jīng)受了各種惡劣環(huán)境條件的考驗(yàn)，蘊(yùn)藏著豐富的遺傳變異，攜帶有大量價(jià)值的基因資源可供小麥利用。把這些優(yōu)異基因引入普通小麥?zhǔn)窃黾有←溸z傳多樣性和改良小麥品種的重要途徑。冰草屬(AgropyronGaertn.)是小麥重要的野生近緣屬，由單一P基因組構(gòu)成，具有眾多可用于小麥改良的優(yōu)異基因。李立會(huì)等通過胚拯救的方法獲得了普通小麥‘Fukuhokomugi’與冰草Z559的雜種，之后通過自交和連續(xù)回交創(chuàng)制了一系列小麥-冰草異源二體附加系。目前，利用小麥-冰草附加系產(chǎn)生易位系，已經(jīng)將6P染色體的多花多粒、抗白粉病和葉銹病、多分蘗和高千粒重以及2P染色體的抗白粉病等優(yōu)異性狀導(dǎo)入普通小麥，并獲得了大量攜帶P基因組遺傳特征的疑似漸滲系。盡管許多外源基因已經(jīng)被導(dǎo)入小麥中，但是基因的滲入仍然費(fèi)時(shí)費(fèi)力，很難滿足小麥育種的需求。因此，對已經(jīng)獲得的漸滲系的有效檢測是加速外源種質(zhì)利用過程中迫切需要解決的問題。一直以來，細(xì)胞學(xué)手段，比如染色體帶、GISH和FISH，被廣泛用來檢測小麥中的外源染色體片段。但是這些傳統(tǒng)技術(shù)分辨率較低，且不能高通量檢測雜交后代。普通分子標(biāo)記，例如SSR，能夠檢測小麥中細(xì)胞學(xué)方法無法檢測到的小片段外源染色質(zhì)，但是在高通量檢測時(shí)它們費(fèi)力耗材，這嚴(yán)重限制了它們在小麥育種中的應(yīng)用。SNP即單核苷酸多態(tài)性，是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異，形成的遺傳標(biāo)記。SNP標(biāo)記是第三代分子標(biāo)記技術(shù)，相對傳統(tǒng)的RFLP、SSR標(biāo)記等具有在基因組中遺傳穩(wěn)定、數(shù)量多、位點(diǎn)專一、易檢測、更適合于高通量的檢測分析等優(yōu)點(diǎn)。Tiwari等首次利用卵穗山羊草5MgS特異的SNP標(biāo)記檢測小麥背景下卵穗山羊草染色質(zhì)的滲入。我們的前期研究表明，通過對四倍體冰草轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，冰草與小麥轉(zhuǎn)錄本存在大量高相似性序列，相似度峰值達(dá)到98％，這為冰草特異SNP標(biāo)記的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本研究首次大規(guī)模開發(fā)冰草P基因組特異的SNP標(biāo)記，并試圖將其應(yīng)用于小麥-冰草漸滲系中的P基因組遺傳成分或功能基因的有效檢測。為了有效檢測小麥-冰草漸滲系中的P基因組遺傳成分，本研究利用冰草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得冰草P基因組相對于小麥ABD基因組特異的SNP位點(diǎn)176,135個(gè)，并選擇在功能注釋上與多花多粒、抗病和抗逆等性狀相關(guān)的230個(gè)P基因組SNP位點(diǎn)，以小麥品種Fukuhokomugi、中國春、周麥18、藁城8901和冰草Z559、18個(gè)小麥-冰草附加系和89份疑似漸滲系為材料，利用KASP(CompetitiveAlleleSpecificPCR)技術(shù)進(jìn)行了基因分型檢測與驗(yàn)證。結(jié)果顯示，其中70個(gè)SNP標(biāo)記可有效應(yīng)用于P基因組遺傳成分檢測，并將56個(gè)SNP標(biāo)記定位于不同的P染色體上。對89份疑似漸滲系材料進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，6個(gè)P基因組SNP標(biāo)記分別在不同材料得到驗(yàn)證，涉及功能域包含Mybfamilytranscriptionfactor和NB-ARC的基因，證實(shí)了其為小麥-冰草漸滲系。本發(fā)明提供用于鑒定多花多粒小麥-冰草漸滲系的SNP分子標(biāo)記，所述SNP分子標(biāo)記為Unigene20307-1420，以冰草Unigene20307基因第1420bp處為目標(biāo)(冰草此處堿基為G，普通小麥此處堿基為A)，用于KASP技術(shù)擴(kuò)增后基因分型呈現(xiàn)雜合型為多花多粒小麥-冰草漸滲系。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供所述用于鑒定多花多粒小麥-冰草漸滲系的SNP分子標(biāo)記在檢測小麥-冰草漸滲系基因型中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供以所述用于鑒定多花多粒小麥-冰草漸滲系的SNP分子標(biāo)記檢測多花多粒的小麥-漸滲系的方法，其為以SNP分子標(biāo)記Unigene20307-1420檢測待測植株，基因分型呈現(xiàn)雜合型為多花多粒的小麥-漸滲系。所述以所述用于鑒定多花多粒小麥-冰草漸滲系的SNP分子標(biāo)記檢測多花多粒小麥-冰草漸滲系的方法在小麥育種中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供以Unigene20307-1420的SNP分子標(biāo)記檢測多花多粒小麥-冰草漸滲系在選育多花多粒的小麥品種中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供針對SNP位點(diǎn)Unigene20307-1420設(shè)計(jì)的特異性引物，其核苷酸序列為：標(biāo)有VIC的等位型1引物：atccacgaaaagcagttcccgc，如SEQIDNo.1所示；標(biāo)有FAM的等位型2引物：gatccacgaaaagcagttcccgt，如SEQIDNo.2所示；通用引物：gagagggagcagctccatcactt，如SEQIDNo.3所示。本發(fā)明還提供針對SNP位點(diǎn)Unigene20307-1420設(shè)計(jì)的特異性引物在選育優(yōu)良小麥品種中的應(yīng)用。本發(fā)明首次基于SNP標(biāo)記技術(shù)開發(fā)了在小麥背景下的冰草P基因組特異分子標(biāo)記，為高通量檢測和追蹤小麥-冰草衍生后代中的冰草外源遺傳成分提供了一個(gè)有效的方法，且以此標(biāo)記成功地鑒定出攜帶多花多粒優(yōu)異性狀的小麥-冰草漸滲系，對未來小麥育種中有效利用這些冰草外源基因奠定了重要基礎(chǔ)。附圖說明圖1實(shí)施例1中KASP引物的分型檢測。其中，a為KASP引物在普通小麥中國春、Fukuhokomugi和冰草中成功分型；b為SNP標(biāo)記unigene60281_All-294定位在小麥-冰草附加系4844-12、5113、5114和II-30-5中；c為SNP標(biāo)記unigene20217_All-182定位在小麥-冰草漸滲系材料中。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。小麥品種‘Fukuhokomugi’、中國春、藁城8901和周麥18均為公知品種。冰草品種Z559為公知品種。實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)材料以原始雜交母本普通小麥品種‘Fukuhokomugi’(Triticumaestivum2n＝6x＝42，AABBDD)和父本冰草Z559(Agropyroncristatum(L.)Gaertn.，2n＝4x＝28，PPPP)以及普通小麥中國春(ChineseSpring，CS)、藁城8901和周麥18為對照，用于P基因組特異SNP標(biāo)記篩選。以18個(gè)小麥-冰草二體附加系(表2)(張艷，2013)為材料，用于P基因組特異SNP標(biāo)記的染色體定位。89份小麥-冰草疑似漸滲系材料被用于檢測其是否攜帶P基因組遺傳成分或功能基因，漸滲系材料的詳細(xì)系譜見表1。表1小麥-冰草附加系同源群歸屬注：W代表小麥染色體，P代表冰草染色體。實(shí)驗(yàn)方法小麥背景下冰草特異SNP的篩選基于四倍體冰草Z559轉(zhuǎn)錄組序列，以已經(jīng)發(fā)表的中國春小麥基因組序列為引物，利用BWA/samtools進(jìn)行冰草特異SNPcalling分析，篩選相識度高于95％，僅在冰草中特異的SNP位點(diǎn)，作為初步的冰草特異SNP。冰草轉(zhuǎn)錄組與中國春基因組數(shù)據(jù)均來源于NCBI。按照冰草轉(zhuǎn)錄組注釋結(jié)果[參見ZhangJ,LiuW,HanH,SongL,BaiL,GaoZ,etal.DenovotranscriptomesequencingofAgropyroncristatumtoidentifyavailablegeneresourcesfortheenhancementofwheat.Genomics.2015；106(2):129-36]，選擇P基因組中與多花多粒、抗病和抗逆等性狀相關(guān)的基因進(jìn)行KASP技術(shù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。KASP引物設(shè)計(jì)將選擇的SNP位點(diǎn)及側(cè)翼序列各50bp發(fā)送給LGC公司來設(shè)計(jì)KASP引物(圖1)。KASP分型過程中，我們將小麥基因型作為等位型1(Allele1)，冰草基因型作為等位型2(Allele2)，以水為空白對照。引物設(shè)計(jì)時(shí)將未標(biāo)記的VICtail序列加在Allele1正向引物的5’端，將未標(biāo)記的FAMtail序列加在Allele2正向引物的5’端，以此來區(qū)分不同的基因型。具體如下：標(biāo)有VIC的等位型1引物：atccacgaaaagcagttcccgc，如SEQIDNo.1所示；標(biāo)有FAM的等位型2引物：gatccacgaaaagcagttcccgt，如SEQIDNo.2所示；通用引物：gagagggagcagctccatcactt，如SEQIDNo.3所示。SNP分型KASP分型反應(yīng)需要Mastermix、Assaymix和DNA模板。PCR反應(yīng)采用96孔板，總體系10μL，包括5μLhighroxKASPmastermix，0.14μLprimermix，1μL基因組DNA(濃度為50ng/μL)和4μLH2O。實(shí)驗(yàn)在ABIStepOnePlusReal-TimePCR儀上進(jìn)行(反應(yīng)中以ROX作為內(nèi)參)[SuZ,JinS,LuY,ZhangG,ChaoS,BaiG.SinglenucleotidepolymorphismtightlylinkedtoamajorQTLonchromosome7Aforbothkernellengthandkernelweightinwheat.MolecularBreeding.2016；36(2).]，熒光強(qiáng)度檢測以及數(shù)據(jù)分析采用ABIStepOneSoftwarev2.1。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃15min，接著為Touchdown程序94℃20s，61℃1min，每個(gè)循環(huán)降0.6度，共10個(gè)循環(huán)，然后94℃20s，55℃1min，共26個(gè)循環(huán)，在25℃下完成讀板。實(shí)驗(yàn)結(jié)果基于小麥參照基因組的冰草SNPcalling分析冰草轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果拼接成73664條冰草unigenes序列(GenBank，GBAU00000000)，與小麥基因組序列進(jìn)行比對獲得29535條高相似度序列，并以小麥基因組序列作為引物進(jìn)行SNPcalling分析尋找P基因組特異SNPs。在小麥ABD基因組中有相同基因型而在冰草中有不同基因型的SNPs是目標(biāo)SNPs。經(jīng)過比對，我們發(fā)現(xiàn)176,135個(gè)SNPs在小麥ABD中有相同基因型，而在冰草中為另一基因型。同時(shí)為了消除目標(biāo)SNP側(cè)翼序列變異帶來的干擾，我們會(huì)選取SNP側(cè)翼序列50bp在小麥ABD與冰草P基因組之間沒有任何變異的SNP作為P基因組特異SNPs。根據(jù)小麥-冰草附加系以及漸滲系的多花多粒、抗病和抗逆的農(nóng)藝性狀，并結(jié)合Zhang等對冰草unigenes的功能注釋，我們從中隨機(jī)選擇了可能與育性、抗病相關(guān)的230個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分型檢測與驗(yàn)證，包括花發(fā)育途徑相關(guān)基因以及功能域包含AP2、Myb_DNA-binding和NB-ARC的基因(表2)。表2KASP引物篩選統(tǒng)計(jì)KASP實(shí)驗(yàn)篩選小麥背景下的冰草P基因組特異SNP我們對選取的226個(gè)SNPs在冰草、中國春、Fukuhokomugi進(jìn)行了KASP分型實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)。若目標(biāo)SNP在普通小麥中國春與Fukuhokomugi中呈現(xiàn)相同基因型Allele1(在坐標(biāo)系的左上方)，在冰草中為另一基因型Allele2(在坐標(biāo)系的右下方)，而在普通小麥與與冰草的混合樣品中呈現(xiàn)雜合型(圖1a，在坐標(biāo)系的對稱軸位置)，則證明此SNP成功分型，并且為冰草特異標(biāo)記，可以用來有效檢測P基因組遺傳成分。KASP結(jié)果顯示，在226個(gè)SNP中，有66個(gè)SNP在普通小麥和冰草有不同的基因型(Allele1和Allele2)，在冰草與普通小麥的混合樣中為雜合型(Allele1/Allele2)(圖1a)，這說明這70個(gè)SNP為冰草P基因組特異SNP。這些KASP引物的分型成功率約29％。因此，這些SNP可用于鑒定小麥-冰草附加系、易位系以及漸滲系中的冰草P基因組遺傳成分。P基因組特異SNP在小麥-冰草附加系中的定位為了將分型成功的66個(gè)SNPs進(jìn)一步定位在小麥-冰草二體附加系中，確定其在冰草染色體上的定位和歸屬，我們完成了這些SNP標(biāo)記在附加系中的篩選實(shí)驗(yàn)。若附加系材料含有目標(biāo)SNP，則SNP在附加系材料中應(yīng)呈現(xiàn)雜合型即Allele1/Allele2，即證實(shí)附加系中小麥與冰草染色體同時(shí)存在。SNP分型實(shí)驗(yàn)顯示在分型成功的66對KASP引物中有52對引物在小麥-冰草附加系中得到驗(yàn)證。這52個(gè)SNPs在普通小麥中呈現(xiàn)Allele1，在冰草中呈現(xiàn)Allele2，而在小麥-冰草附加系中呈現(xiàn)雜合型，這證明附加系材料中含有目標(biāo)SNP。根據(jù)SNP在小麥-冰草附加系中的分型情況，在這些SNP標(biāo)記中有28個(gè)SNP定位在在附加系4844-12、5113、5114和II-30-5的6P染色體上(圖1b)，9個(gè)SNP定位在在附加系II-26、II-5-1、5038和5043的7P染色體上，2個(gè)SNP標(biāo)記定位在附加系II-4-2的7P染色體上，6個(gè)SNP標(biāo)記定位在附加系II-21-2和II-21-6的4P染色體上，3個(gè)SNP標(biāo)記定位在附加系II-11-1a的5P染色體上，1個(gè)SNP定位在附加系II-7-1、II-8-1、II-9-3的2P染色體上，另外3個(gè)SNP標(biāo)記在同時(shí)在多個(gè)不同歸屬群的附加系材料中出現(xiàn)。以上結(jié)果顯示，其中47個(gè)SNP標(biāo)記定位的附加系材料的同源群歸屬與比對的小麥染色體位置一致，占90.4％，這進(jìn)一步說明這些SNP標(biāo)記在冰草與小麥之間相對保守。見表3。表3P基因組特異SNP在小麥-冰草附加系中的定位P基因組特異SNP在小麥-冰草漸滲系中的有效檢測在小麥-冰草遠(yuǎn)緣雜交利用中，有一些高代疑似小麥-冰草漸滲系具有突出的冰草優(yōu)異性狀，如多花多粒、抗病等，但是利用常規(guī)的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)如GISH和常規(guī)分子標(biāo)記技術(shù)很難檢出外源染色質(zhì)。因此我們用SNP標(biāo)記技術(shù)檢測漸滲系中的冰草成分。我們將在附加系中檢測到的52個(gè)SNP標(biāo)記，對89份小麥-冰草漸滲系進(jìn)行了篩選鑒定。結(jié)果顯示在52個(gè)SNP標(biāo)記中Unigene20307-1420在攜帶多花多粒優(yōu)異性狀的漸滲系材料中得到驗(yàn)證。這個(gè)SNP在小麥與冰草中為不同的基因型，在漸滲系材料中呈現(xiàn)雜合型(圖1c)，進(jìn)一步證實(shí)漸滲系中含有冰草遺傳成分。Unigene20307-1420定位在漸滲系材料31485-31505中，這表明，我們分離鑒定的SNP標(biāo)記可以有效檢測遠(yuǎn)緣雜交后代中滲入的小片段遺傳物質(zhì)。同時(shí)，漸滲系31485-31505在每穗小穗數(shù)、小穗粒數(shù)和穗粒數(shù)上明顯優(yōu)于普通小麥Fukuhokomugi(表4)，這進(jìn)一步暗示Unigene20307可能與冰草多花多粒相關(guān)。表4漸滲系材料31485-31505與Fukuhokomugi的性狀比較品系每穗小穗數(shù)小穗粒數(shù)穗粒數(shù)31485-3150521.52±1.6a6.37±0.77a96.50±16.95bFukuhokomugi18.5±1.27c4.60±0.70a61.80±7.71b討論小麥野生近緣種對于拓寬小麥遺傳背景，改良小麥抵御生物與非生物脅迫具有巨大潛力。目前，小麥與小麥族23個(gè)屬均雜交成功，已將100余個(gè)外源基因轉(zhuǎn)入小麥。然而外源染色體片段導(dǎo)入小麥上通常會(huì)有不利基因伴隨目的基因一起進(jìn)入小麥中，造成連鎖累贅。而且外源染色體片段越大，連鎖累贅現(xiàn)象越嚴(yán)重，遺傳上也會(huì)越不穩(wěn)定。因此小麥-外源二體附加系和大片段易位系很難被直接應(yīng)用于小麥生產(chǎn)實(shí)踐中。隨著染色體工程的發(fā)展，獲得更小片段易位系和漸滲系成為減少遺傳累贅的最佳途徑，將更有利于轉(zhuǎn)移與利用外源優(yōu)異基因。因此，如何快速高效地檢測小麥中滲入的外源染色質(zhì)是一個(gè)迫切需要解決的問題。本研究中我們隨機(jī)選擇的226個(gè)SNP標(biāo)記中70個(gè)證實(shí)冰草P基因組特異，其中52個(gè)SNP定位到冰草不同染色體上。同時(shí)，在52個(gè)SNP中Unigene20307-1420可以用于多花多粒小麥-冰草漸滲系的檢測。本研究為檢測小麥中的滲入的外源遺傳物質(zhì)提供了一個(gè)快速有效的方法。因此，本研究中的高通量檢測多花多粒的小麥-漸滲系的方法是小麥育種進(jìn)程中重要的一步。在創(chuàng)制易位系利用外源基因中，基因挖掘是相對困難的，因?yàn)橥庠慈旧w片段與小麥染色體間的不交換使常規(guī)的圖位克隆正向遺傳學(xué)方法很難行得通。然而，已經(jīng)證明反向遺傳學(xué)方法挖掘小麥野生近緣種的優(yōu)異基因是一個(gè)有效的途徑，例如Stpk-V(白粉病抗性基因Pm21的一個(gè)重要組分)。這里我們直接從轉(zhuǎn)錄基因，找出特異SNP，為快速挖掘外源染色體片段攜帶的優(yōu)異基因提供了新的途徑。本實(shí)驗(yàn)室通過遠(yuǎn)緣雜交創(chuàng)建了一系列小麥-冰草疑似漸滲系，與親本相比部分材料具有多花多粒、抗白粉病、高千粒重等優(yōu)良性狀。本研究將SNP標(biāo)記成功定位在小麥-冰草漸滲系中，證實(shí)了漸滲系中確實(shí)含有冰草P基因組遺傳成分。而這些SNP標(biāo)記只在部分具有多花多粒的漸滲系中檢測到，說明冰草P染色體片段在調(diào)控多粒性方面具有重要作用。我們對漸滲系中定位的Unigene20307的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了深入挖掘，通過比對發(fā)現(xiàn)Unigene20307的轉(zhuǎn)錄組序列含有完整的編碼框，進(jìn)一步的蛋白比對結(jié)果顯示Unigene20307編碼的蛋白與山羊草、圖小麥、水稻的SWI/SNF復(fù)合體單元SWI3B編碼的蛋白極為相似，相似度分別是97％、89％、75％。對于SWI3復(fù)合蛋白，擬南芥中曾報(bào)道其與擬南芥花器官發(fā)育相關(guān)，AtSWI3突變會(huì)導(dǎo)致植株矮小、胚發(fā)生異常、育性降低。Unigene20307-1420定位的漸滲系材料31408-09和31485-31505具有的多花多粒表型，進(jìn)一步暗示了Unigene20307可能與冰草育性相關(guān)，這對于利用此冰草基因提高小麥育性具有重要意義。本研究在定位在附加系中的56個(gè)冰草特異SNP中得到可有效檢測多花多粒漸滲系的SNP，這為尋找與性狀關(guān)聯(lián)的功能基因奠定了基礎(chǔ)，對于有目的的利用冰草基因資源具有重大意義。本研究首次大規(guī)模開發(fā)了冰草特異SNP標(biāo)記，并有效應(yīng)用于小麥-冰草附加系和漸滲系的檢測，且獲得與多花多粒相關(guān)的SNP標(biāo)記，為有目標(biāo)的高通量篩選衍生后代提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐，同時(shí)這將有利于冰草功能基因的精細(xì)定位與克隆，實(shí)現(xiàn)了種質(zhì)創(chuàng)新從染色體工程向分子染色體工程的技術(shù)轉(zhuǎn)變。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。SEQUENCELISTING<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所<120>鑒定多花多粒小麥-冰草漸滲系的SNP分子標(biāo)記及應(yīng)用<130>KHP161118251.4Q<160>3<170>PatentInversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1atccacgaaaagcagttcccgc22<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2gatccacgaaaagcagttcccgt23<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>3gagagggagcagctccatcactt23當(dāng)前第1頁1 2 3