本發(fā)明屬于生物領域，特別涉及細菌的計數(shù)方法，具體為一種確定細黃連霉菌培養(yǎng)物中細菌數(shù)量的方法。
背景技術：
：近來有關細黃連霉菌的研究引起了越來越多的關注。其中的菌落計數(shù)是微生物制劑有關研究的基礎，如研究細黃連霉菌的培養(yǎng)條件、增殖特性、使用劑量、制劑含菌量等等均離不開細菌計數(shù)。細菌計數(shù)的方法有計數(shù)器測定法、電子計數(shù)器計數(shù)法、平板菌落計數(shù)法、比濁法、測定細胞重量法、測定細胞總氮量或總碳量、顏色改變單位法等，其中比濁法和菌落計數(shù)法可滿足絕大多數(shù)細菌的計數(shù)且也是最常用的方法。菌落計數(shù)法是根據(jù)每個活的細菌能培養(yǎng)長出一個菌落的原理設計的，不需要特殊儀器，操作簡單，測定時取一定容量的菌懸液作一系列的倍比稀釋，然后將定量的稀釋液進行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)，可算出培養(yǎng)物中的活菌數(shù)，此法靈敏度高，是一種檢測活菌數(shù)的好方法，但該法費時，至少需24小時才能出結果，且需判斷選擇好適宜的稀釋度(一般選取菌落數(shù)在30-300之間的平板進行計數(shù)，過多或過少均不準確)，因此其操作的復雜性、花費及時間等均增大。比濁法是根據(jù)菌懸液的透光量間接地測定細菌的數(shù)量。細菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與透光度成反比，與光密度成正比，所以，可用光電比色計測定菌液，用光密度(OD值)表示樣品菌液濃度。但光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細胞大小、形態(tài)、培養(yǎng)液成分以及所采用的光波長等因素的影響，且通常只能檢測含有大量細菌的懸浮液，得出相對的細菌數(shù)目，對顏色太深的樣品或組織樣品等，不能用此法測定，但此法簡便快捷。比濁法測定細菌的數(shù)量主要的關鍵是如何排除樣品中的干擾物、所采用的光波波長的確定和測定的OD值與細菌數(shù)量間對應關系，否則只能判斷出相對的細菌數(shù)目而不能確定出準確的細菌數(shù)目。目前，利用紫外分光光度計來測定細黃連霉菌數(shù)量還需摸索。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種確定細黃連霉菌培養(yǎng)物中細菌數(shù)量的方法，該方法快速簡單，使用于細黃連霉菌液體培養(yǎng)液中細菌的技術。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案為：確定細黃連霉菌培養(yǎng)物中細菌數(shù)量的方法，包括以下步驟：取待檢樣品設置梯度稀釋倍數(shù)(表1)，得到梯度稀釋溶液，測定并記錄OD600值與細菌數(shù)量，根據(jù)統(tǒng)計方法建立起細菌數(shù)量與稀釋倍數(shù)和OD600值的函數(shù)關系，得到細菌數(shù)量與稀釋倍數(shù)和OD600值的相關系數(shù)；利用所述函數(shù)關系和所述相關系數(shù)計算出細黃連霉菌液體培養(yǎng)物的細菌數(shù)量；所述相關系數(shù)為2.5。表1、稀釋倍數(shù)及菌落總數(shù)稀釋倍數(shù)OD600值(nm)菌落總數(shù)(CFU/ml)50.9126.245×101070.8945.661×101090.8695.157×1010100.8443.865×1010120.8153.124×1010140.7412.595×1010160.6492.595×1010180.5772.595×1010200.5192.595×1010220.4722.595×1010240.43252.595×1010260.3992.595×1010280.3712.595×1010300.3462.595×1010320.3242.595×1010進一步，所述稀釋倍數(shù)是指所述稀釋溶液相對于所述待檢樣品的體積稀釋倍數(shù)。進一步，所述函數(shù)關系為：細菌數(shù)量＝OD600值×稀釋倍數(shù)×2.5×109CFU/mL。進一步，所述OD600值為0.1-0.8。將洗滌干凈的樣品用稀釋液稀釋至OD600值不大于0.1-0.8，僅在上述范圍內(nèi)，OD600值與細菌數(shù)量才存在線性關系。超出上述范圍，將導致計數(shù)出現(xiàn)誤差或錯誤?？焖俅_定細黃連霉菌液體培養(yǎng)物中細菌數(shù)量的方法，具體步驟為：取樣品并洗滌，所取的樣品指細黃連霉菌液體培養(yǎng)物，也可以是其他培養(yǎng)物，或形狀和細黃連霉菌液體培養(yǎng)物相似的樣品；洗滌的目的在于去除其它雜物，避免后期讀取OD600值時受其他雜物影響而產(chǎn)生誤差，將洗滌干凈的樣品用稀釋液稀釋至OD600值不大于0.8得稀釋菌液，記錄稀釋倍數(shù)，所述稀釋倍數(shù)是指所述稀釋菌液相對于所述樣品的體積稀釋倍數(shù)；根據(jù)統(tǒng)計方法建立起細菌數(shù)量與稀釋倍數(shù)和OD600值的函數(shù)關系，得到細菌數(shù)量與稀釋倍數(shù)和OD600值的相關系數(shù)，所述函數(shù)關系為：細菌數(shù)量＝OD600值×稀釋倍數(shù)×2.5×109CFU/mL。具體思路是：將經(jīng)具體確認細菌(細黃連霉菌)數(shù)量的樣品與該樣品的OD600值統(tǒng)計分析得到的系數(shù)。進一步，所述細黃連霉菌培養(yǎng)物為液體培養(yǎng)物或菌液。進一步，所述待檢樣品在稀釋前進行3-5次的離心洗滌。作為一種優(yōu)選，所述離心洗滌用生理鹽水連續(xù)離心洗滌。進一步，離心洗滌的條件為：3000-5000轉/分鐘，離心5-10分鐘。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供一種快速確定細黃連霉菌液體培養(yǎng)物中細菌數(shù)量的方法，該方法簡便、快速，結果準確，填補了利用紫外分光光度計準確測定細黃連霉菌的細菌數(shù)這一空白。1)實現(xiàn)了利用儀器自動化檢測和計數(shù)。傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)計數(shù)是人工操作，因此結果的可靠性與檢測人員的經(jīng)驗有較大的影響，儀器自動化檢測表明了檢測方法的進步。2)傳統(tǒng)的細菌計數(shù)涉及培養(yǎng)試劑選擇與準備、培養(yǎng)基的制備、培養(yǎng)條件的準備、多步驟的人工操作等，因此操作復雜，需要具有微生物學知識特別是要掌握細黃連霉菌的培養(yǎng)特性。本發(fā)明操作簡便，無微生物學和細黃連霉菌知識的人員根據(jù)操作步驟即可測定。3)傳統(tǒng)的霉菌培養(yǎng)計數(shù)不僅操作復雜，且培養(yǎng)時間需3-7天，而本發(fā)明可在0.5-1小時出結果，大大地縮短了檢測時間。4)確定了檢測所采用的光波波長和所測定的OD值與細黃連霉菌數(shù)量間的對應關系，結果準確。本發(fā)明根據(jù)菌懸液的透光量可反映測定樣品中的細菌的數(shù)量，對比濁法測定細菌的數(shù)量的兩個主要的關鍵一測定所采用的光波波長和所測定的OD值及稀釋倍數(shù)與細黃連霉菌數(shù)量間對應關系進行了摸索，確定了OD值及稀釋倍數(shù)與細黃連霉菌數(shù)量間對應關系，同時，本發(fā)明通過用生理鹽水連續(xù)離心洗滌所測定的菌液，除去樣品中的干擾物，結果準確。具體實施方式下面將對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例樣品為細黃連霉菌CSY1-3-10-1株用高氏合成培養(yǎng)基30-40℃通氣發(fā)酵24小時后，檢測發(fā)酵液中細黃連霉菌的含菌數(shù)。取發(fā)酵菌液lml作為樣品。方法1計數(shù)器計數(shù)法：取上述樣品，用血細胞計數(shù)器進行計數(shù)。取1ml該樣品，置于血細胞計數(shù)器的計數(shù)室內(nèi)，三名技術員各用顯微鏡計數(shù)三次，以降低主觀錯誤的可能。每毫升該發(fā)酵液中細黃連霉菌的含菌數(shù)為2.595×1010CFU/ml，約為260億個。方法2取上述樣品進行離心。對于上述樣品，分別設置兩種條件離心，條件1為：以3000轉/分鐘離心10分鐘樣品后，在離心的樣品中添加生理鹽水，連續(xù)離心5000轉/分鐘，5分鐘，洗滌3次；條件2為：以5000轉/分鐘離心5分鐘，在離心的樣品中添加生理鹽水，連續(xù)離心3000轉/分鐘，10分鐘，洗滌3次。每次離心后，均去除上清液，取沉淀物。將沉淀物用生理鹽水作20倍體積的稀釋，得稀釋菌液，記錄稀釋倍數(shù)，所述稀釋倍數(shù)是指所述稀釋菌液相對于所述樣品的體積稀釋倍數(shù)；于紫外分光光度計下測定600nm處OD值(注意用生理鹽水調(diào)0)，測得OD600nm值為0.519。根據(jù)以下公式計算出菌液含菌量，含菌總數(shù)(CFU/ml)＝OD600nm值×20×2.5×109CFU/mL＝0.519×20×2.5×109CFU/ml＝2.595×1010CFU/mL。即每毫升該發(fā)酵液中細黃連霉菌的含菌數(shù)約為260億個。公式中的系數(shù)“2.5”是經(jīng)過多次實驗得到的經(jīng)驗系數(shù)，具體思路是：將經(jīng)具體確認細菌(細黃連霉菌)數(shù)量的樣品與該樣品的OD600值統(tǒng)計分析得到的系數(shù)。當公式采用其它系數(shù)，會出現(xiàn)細菌計數(shù)誤差。另外，平行設置其它稀釋倍數(shù)組，所得稀釋菌液的OD600nm值在0.1-0.8內(nèi)，帶入上述公式計算，所得細菌(細黃連霉菌)數(shù)量與稀釋體積呈線性關系。方法3取上述樣品進行離心。對于上述樣品，分別設置兩種條件離心，條件1為：以3000轉/分鐘離心10分鐘樣品后，在離心的樣品中添加生理鹽水，連續(xù)離心5000轉/分鐘，5分鐘，洗滌3次；條件2為：以5000轉/分鐘離心5分鐘，在離心的樣品中添加生理鹽水，連續(xù)離心3000轉/分鐘，10分鐘，洗滌3次。每次離心后，均去除上清液，取沉淀物。將沉淀物用生理鹽水作24倍體積的稀釋，得稀釋菌液，記錄稀釋倍數(shù)，所述稀釋倍數(shù)是指所述稀釋菌液相對于所述樣品的體積稀釋倍數(shù)；于紫外分光光度計下測定600nm處OD值(注意用生理鹽水調(diào)0)，測得OD600nm值為0.433。根據(jù)以下公式計算出菌液含菌量，含菌總數(shù)(CFU/ml)＝OD600nm值×24×2.5×109CFU/mL＝0.433×24×2.5×109CFU/ml＝2.595×1010CFU/mL。即每毫升該發(fā)酵液中細黃連霉菌的含菌數(shù)約為260億個。公式中的系數(shù)“2.5”是經(jīng)過多次實驗得到的經(jīng)驗系數(shù)，具體思路是：將經(jīng)具體確認細菌(細黃連霉菌)數(shù)量的樣品與該樣品的OD600值統(tǒng)計分析得到的系數(shù)。當公式采用其它系數(shù)，會出現(xiàn)細菌計數(shù)誤差。另外，平行設置其它稀釋倍數(shù)組，所得稀釋菌液的OD600nm值在0.1-0.8內(nèi)，帶入上述公式計算，所得細菌(細黃連霉菌)數(shù)量與稀釋體積呈線性關系。方法4取上述樣品進行離心。對于上述樣品，分別設置兩種條件離心，條件1為：以3000轉/分鐘離心10分鐘樣品后，在離心的樣品中添加生理鹽水，連續(xù)離心5000轉/分鐘，5分鐘，洗滌3次；條件2為：以5000轉/分鐘離心5分鐘，在離心的樣品中添加生理鹽水，連續(xù)離心3000轉/分鐘，10分鐘，洗滌3次。每次離心后，均去除上清液，取沉淀物。將沉淀物用生理鹽水分別作5、6、7、8、9、10、11和12倍體積的稀釋，得稀釋菌液，記錄稀釋倍數(shù)，所述稀釋倍數(shù)是指所述稀釋菌液相對于所述樣品的體積稀釋倍數(shù)，于紫外分光光度計下測定600nm處OD值(注意用生理鹽水調(diào)0)5、6、7、8、9、10、11和12倍體積的稀釋測得OD600nm值大于0.8。所計數(shù)的5組含菌總數(shù)(CFU/ml)與稀釋體積不呈線性關系，不予考慮。上述三種方法中，方法2，方法3與方法1計數(shù)結果一致。但是，方法1中，計數(shù)器計數(shù)法必須依賴于顯微鏡；而且計數(shù)器計數(shù)法是通過肉眼觀察后進行計數(shù)，計數(shù)過程中由于主觀原因產(chǎn)生的誤差不易被察覺，必須通過多人計數(shù)來降低誤差。所以，本方法有一定的優(yōu)勢。而方法4中，稀釋倍數(shù)與檢測結果缺少線性關系。最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權利要求書所限定的范圍。當前第1頁1 2 3