技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種美容用表皮干細(xì)胞生長因子制備方法。
背景技術(shù)：
表皮干細(xì)胞作為人體表皮基底部具有不斷增殖和分化能力的干細(xì)胞，同時也是皮膚組織中的專能干細(xì)胞，其可增殖和分化為皮膚中的各種細(xì)胞成分，使得皮膚保持正常的表皮結(jié)構(gòu)。
細(xì)胞保持活性、增殖和分化能力直接依賴細(xì)胞生存的微環(huán)境，因此直接將干細(xì)胞應(yīng)用于美容領(lǐng)域所達(dá)到的效果并不理想。同時，細(xì)胞死亡破碎形成的細(xì)胞碎片還可能帶來安全隱患。
由于表皮干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中即分泌表皮干細(xì)胞生長因子并且擴散進入細(xì)胞培養(yǎng)基中，很難從培養(yǎng)基中有效提取表皮干細(xì)胞所分泌的生長因子。同時，因細(xì)胞培養(yǎng)基中含有大量營養(yǎng)成分，容易發(fā)生細(xì)菌滋生等問題。
因此，有必要提出一種旨在用于美容領(lǐng)域的表皮干細(xì)胞生長因子制備方法，將分泌的生長因子應(yīng)用于皮膚再生、修復(fù)、去皺等美容途徑。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的狀況，提供一種美容用表皮干細(xì)胞生長因子制備方法。
本發(fā)明采用以下技術(shù)方案，所述美容用表皮干細(xì)胞生長因子制備方法包括步驟：
步驟A：將表皮干細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)；
步驟B：選擇對數(shù)生長期的表皮干細(xì)胞，經(jīng)1000rpm和5分鐘離心處理以去除細(xì)胞培養(yǎng)基，獲得經(jīng)離心分離的表皮干細(xì)胞；
步驟C：將經(jīng)離心分離的表皮干細(xì)胞使用生理鹽水洗滌并稀釋至1*107/ml；
步驟D：將經(jīng)生理鹽水稀釋的表皮干細(xì)胞于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中無營養(yǎng)條件培養(yǎng)6小時，提取表皮干細(xì)胞分泌的表皮干細(xì)胞生長因子。
根據(jù)上述技術(shù)方案，在上述步驟A中，所述表皮干細(xì)胞采用以下步驟制備：
步驟A.1：獲取角朊細(xì)胞懸液；
步驟A.2：分離角朊細(xì)胞懸液獲得表皮干細(xì)胞。
根據(jù)上述技術(shù)方案，在上述步驟A.1中，所述角朊細(xì)胞懸液采用以下步驟制備：
步驟A.1.1：分離包皮的表皮和真皮層，使用胰蛋白酶消化剪碎的表皮以形成混合物；
步驟A.1.2：過濾混合物獲得細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液重懸獲得角朊細(xì)胞懸液。
根據(jù)上述技術(shù)方案，在上述步驟A.2中，將角朊細(xì)胞懸液置于預(yù)先包被IV型膠原蛋白的六孔板，以分離角朊細(xì)胞懸液并且獲得貼壁的表皮干細(xì)胞。
根據(jù)上述技術(shù)方案，所述表皮干細(xì)胞生長因子包括成纖維細(xì)胞生長因子、干細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子和表皮生長因子。
根據(jù)上述技術(shù)方案，在上述步驟D中，還可提取表皮干細(xì)胞分泌的膠原蛋白。
本發(fā)明公開的美容用表皮干細(xì)胞生長因子制備方法，旨在通過實驗室培養(yǎng)表皮干細(xì)胞，提取和制備用于維持和促進表皮干細(xì)胞增殖和分化的各種細(xì)胞因子，繼而應(yīng)用于相應(yīng)的美容產(chǎn)品。表皮干細(xì)胞生長因子具有純度高、不含雜質(zhì)等特點，包括：成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、干細(xì)胞生長因子（SCF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和表皮生長因子（EGF）等，還可收集得到膠原蛋白。
具體實施方式
本發(fā)明公開了一種美容用表皮干細(xì)胞生長因子制備方法，下面結(jié)合優(yōu)選實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步描述。
優(yōu)選地，所述美容用表皮干細(xì)胞生長因子制備方法包括以下步驟：
步驟A：將表皮干細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)；
步驟B：選擇對數(shù)生長期的表皮干細(xì)胞，經(jīng)1000rpm和5分鐘離心處理以去處細(xì)胞培養(yǎng)基，獲得經(jīng)離心分離的表皮干細(xì)胞；
步驟C：將經(jīng)離心分離的表皮干細(xì)胞使用生理鹽水洗滌并稀釋至1*107/ml；
步驟D：將經(jīng)生理鹽水稀釋的表皮干細(xì)胞置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中無營養(yǎng)條件培養(yǎng)6小時，提取表皮干細(xì)胞分泌的表皮干細(xì)胞生長因子。
優(yōu)選地，在上述步驟A中，所述表皮干細(xì)胞采用以下步驟制備：
步驟A.1：獲取角朊細(xì)胞懸液；
步驟A.2：分離角朊細(xì)胞懸液獲得表皮干細(xì)胞。
優(yōu)選地，在上述步驟A.1中，所述角朊細(xì)胞懸液采用以下步驟制備：
步驟A.1.1：分離包皮的表皮和真皮層，使用胰蛋白酶消化剪碎的表皮以形成混合物；
步驟A.1.2：過濾混合物獲得細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液重懸獲得角朊細(xì)胞懸液。
優(yōu)選地，在上述步驟A.2中，將角朊細(xì)胞懸液置于預(yù)先包被IV型膠原蛋白的六孔板，以分離角朊細(xì)胞懸液并且獲得貼壁的表皮干細(xì)胞。
優(yōu)選地，所述美容用表皮干細(xì)胞生長因子制備方法用于制備表皮干細(xì)胞生長因子，上述表皮干細(xì)胞生長因子包括成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、干細(xì)胞生長因子（SCF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和表皮生長因子（EGF）。
優(yōu)選地，在上述步驟D中，還可提取表皮干細(xì)胞分泌的膠原蛋白。
根據(jù)上述優(yōu)選實施例，通過控制細(xì)胞生長狀態(tài)和調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量來達(dá)到濃縮表皮干細(xì)胞生長因子的目的。本發(fā)明公開的美容用表皮干細(xì)胞生長因子制備方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)勢：
1：選擇人源干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，與其他物種來源的細(xì)胞相比，安全性更好。
2：與其他種類的人源干細(xì)胞相比，本發(fā)明選用表皮干細(xì)胞，表皮干細(xì)胞在皮膚的再生和修復(fù)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其分泌的各種細(xì)胞因子作用于皮膚再生，修復(fù)，去皺等，在抗衰老方面更有針對性。
3：本發(fā)明選用的表皮干細(xì)胞是通過組織分離原代培養(yǎng)而得，其細(xì)胞生長特性更接近于人體內(nèi)的狀況，細(xì)胞活性等方面更好，因此，選用原代培養(yǎng)的細(xì)胞所分泌的生長因子種類更豐富，濃度更高。
4：本發(fā)明選擇對數(shù)生長期的表皮干細(xì)胞，不僅細(xì)胞數(shù)量能達(dá)到生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，大大減少細(xì)胞分泌的有害代謝產(chǎn)物的沉積。
5：本發(fā)明為了避免培養(yǎng)基因為豐富的營養(yǎng)而導(dǎo)致產(chǎn)品容易滋生細(xì)菌的問題，選用了無營養(yǎng)條件孵育的方法，大大提高了產(chǎn)品的純度，同時使產(chǎn)品可以作為美容產(chǎn)品添加劑得到更廣泛的應(yīng)用從而帶來更客觀的經(jīng)濟效益。
6：本發(fā)明可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生長狀態(tài)和控制細(xì)胞數(shù)量來達(dá)到調(diào)控細(xì)胞因子濃度的目的，避免了使用蒸餾或其他的濃縮工藝帶來的產(chǎn)品損失。此工藝不僅操作簡單，同時避免后續(xù)工藝產(chǎn)品損失，大大提高了生產(chǎn)效益。
對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或?qū)ζ渲胁糠旨夹g(shù)特征進行等同替換，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍。