本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別地，涉及一種包含干細(xì)胞分泌因子的組合物及其制備方法，以及用該組合物制備的包含干細(xì)胞分泌因子的口腔噴劑。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞(stem cells，SC)是一類具有自我復(fù)制能力(self-renewing)的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞。干細(xì)胞是一種未充分分化，尚不成熟的細(xì)胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱之為“萬用細(xì)胞”。干細(xì)胞可以在機(jī)體生命過程中無限期分裂，并在合適的條件或給予恰當(dāng)?shù)臈l件后，能分化產(chǎn)生多種不同的細(xì)胞類型。
干細(xì)胞可分泌許多生物活性分子，如間充質(zhì)干細(xì)胞至少分泌免疫調(diào)節(jié)因子(HGF、LIF)、趨化因子(RANTES、SDF-1α、fractalkine、MIP-1α、MCP-1、MCP-2)、支持祖細(xì)胞的營養(yǎng)因子(IL-6、FGF-2、PDGF-AA、PDGF-BB、EGF)、血管再生因子(VEGF165、FGF-2、PDGF-AA、PDGF-BB、EGF)、抑制疤痕因子(HGF、FGF-2)、抗凋亡因子(VEGF165、FGF-2、HGF)、傷口愈合相關(guān)因子(IL-6、IL-8、TGF-β1、MCP-1、VEGF、GM-CSF)、TIMP-1)、各型膠原蛋白(I、II、III、IV型膠原蛋白)以及各種溶菌酶等。
人口腔的舌下粘膜上皮未被角質(zhì)化，最有利于生物有效分子的全身吸收；其次是齒齦和硬腭，一般來說，人口腔粘膜對(duì)生物分子的通透性：舌下粘膜>頰粘膜>牙齦。
人體的呼吸系統(tǒng)主要由鼻、咽、喉、氣管、支氣管、細(xì)支氣管、終末細(xì)支氣管、呼吸細(xì)支氣管、肺泡管及肺泡囊組成。從氣管到肺泡，氣道的管徑越來越小，但數(shù)量卻大大增加。呼吸道表面覆蓋假復(fù)層纖毛柱狀上皮，纖毛細(xì)胞間夾有杯狀細(xì)胞，柱狀細(xì)胞游離面可見纖毛。
生物有效分子在肺部主要的吸收部位是肺泡。正常成人大約有幾億個(gè)肺泡，總表面積約為200m2，與小腸粘膜的微絨毛總面積大致相當(dāng)。肺泡是半球狀的囊泡，由單層扁平上皮細(xì)胞構(gòu)成，厚度僅0.1-0.5μm，相鄰肺泡之間的薄層結(jié)締組織為肺泡隔。肺泡隔內(nèi)有豐富的毛細(xì)血管及膠原纖維和彈性纖維。肺泡壁和毛細(xì)血管壁間的厚度僅約1μm，是氣體交換和生物有效分子吸收的良好場所。由于肺泡吸收表面積大、毛細(xì)血管網(wǎng)豐富、轉(zhuǎn)運(yùn)距離極小，因此肺部給藥吸收迅速。另外，肺部吸收相對(duì)胃腸道吸收來說，對(duì)生物有效分子的代謝作用小，可避免肝臟的首過效應(yīng)影響。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種制備包含干細(xì)胞分泌因子的組合物的方法，其包括以下步驟：
S1：從胚性組織中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞；
S2：擴(kuò)增培養(yǎng)所述間充質(zhì)干細(xì)胞，得到包含干細(xì)胞分泌因子的培養(yǎng)物；
S3：從所述培養(yǎng)物中去除間充質(zhì)干細(xì)胞得到包含干細(xì)胞分泌因子的溶液；
S4：純化所述溶液，并進(jìn)行真空冷凍干燥得到包含干細(xì)胞分泌因子的組合物。
進(jìn)一步地，所述胚性組織來自臍帶。
進(jìn)一步地，去除臍帶外膜，得到華通膠組織，剪成1mm3的組織塊。
進(jìn)一步地，通過用胰酶和膠原酶消化所述組織塊來分離。時(shí)間為1-2小時(shí)左右。
進(jìn)一步地，消化后用200目篩網(wǎng)過濾，然后用生理鹽水洗滌，所得細(xì)胞加入干細(xì)胞培養(yǎng)基于含5％CO2的37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
進(jìn)一步地，待細(xì)胞長至80％融合時(shí)傳代培養(yǎng)，得到所述間充質(zhì)干細(xì)胞。
進(jìn)一步地，S2中用干細(xì)胞培養(yǎng)基來擴(kuò)增培養(yǎng)所述間充質(zhì)干細(xì)胞，直至所述間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)志CD29和CD105。
進(jìn)一步地，S4中通過離心的方法從所述培養(yǎng)物中去除所述間充質(zhì)干細(xì)胞。
進(jìn)一步地，S5中通過硫酸銨沉淀去除雜質(zhì)然后通過透析除鹽，由此純化所述溶液。
本發(fā)明還提供了一種通過上述方法制備得到的包含干細(xì)胞分泌因子的組合物。
本發(fā)明還提供了一種由上述組合物制備得到的包含干細(xì)胞分泌因子的口腔噴劑。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明制備的口腔噴劑通過呼吸道由口腔、咽、喉、氣管、支氣管、肺部等部分完成吸收過程。主要經(jīng)過口腔黏膜及肺部吸收，人口腔的舌下粘膜上皮未被角質(zhì)化，最有利于生物有效分子的全身吸收；其次是齒齦和硬腭，一般來說，人口腔粘膜對(duì)生物分子的通透性：舌下粘膜>頰粘膜>牙齦?？谇徽衬の諞]有肝臟的首過效應(yīng)，有效成分直接由頸內(nèi)豐富的靜脈進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，迅速發(fā)揮作用。起效所需時(shí)間短。對(duì)生物有效分子的依從性好，吸收過程和吸收效果易于控制；粘膜不易損傷，易于修復(fù)；避免胃腸道的消化酶的消化作用；可發(fā)揮局部或全身作用。
肺部具有巨大的表面積，毛細(xì)血管豐富，能夠快速高效的吸收分子量較大的蛋白多肽類物質(zhì)，有效吸收率高，肺泡囊壁由單層上皮細(xì)胞構(gòu)成，這些細(xì)胞緊靠毛細(xì)血管網(wǎng)，氣血屏障較小，蛋白和多肽類通過空氣血液途徑交換的距離短，速度快；肺部酶分布集中而且生物活性低，蛋白質(zhì)和多肽類物質(zhì)通過肺部吸收仍可保持生物活性；肺部吸收生物有效分子可以避免胃腸道對(duì)生物有效分子的不良影響及能避開肝臟的首關(guān)效應(yīng)，提高生物利用度。
本發(fā)明的組合物和口腔噴劑中包含間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，間充質(zhì)干細(xì)胞至少分泌免疫調(diào)節(jié)因子(HGF、LIF)、趨化因子(RANTES、SDF-1α、fractalkine、MIP-1α、MCP-1、MCP-2)、支持祖細(xì)胞的營養(yǎng)因子(IL-6、FGF-2、PDGF-AA、PDGF-BB、EGF)、血管再生因子(VEGF165、FGF-2、PDGF-AA、PDGF-BB、EGF)、抑制疤痕因子(HGF、FGF-2)、抗凋亡因子(VEGF165、FGF-2、HGF)、傷口愈合相關(guān)因子(IL-6、IL-8、TGF-β1、MCP-1、VEGF、GM-CSF)、TIMP-1)、各型膠原蛋白(I、II、III、IV型膠原蛋白)以及各種溶菌酶等。干細(xì)胞分泌的這些生物活性分子可以支持干細(xì)胞自身的生物活性功能，同時(shí)改善機(jī)體整體健康狀態(tài)，調(diào)節(jié)整體或者局部的微環(huán)境，修復(fù)細(xì)胞、改善細(xì)胞代謝、激活衰老細(xì)胞的功能，促進(jìn)機(jī)體組織再生和器官功能恢復(fù)，刺激機(jī)體其他成體細(xì)胞的抗衰老作用。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
1.干細(xì)胞口腔噴劑的制備
1)收集健康人體臍帶，對(duì)臍帶作進(jìn)一步清洗，再用無菌手術(shù)剪將臍帶切割分為細(xì)小組織；
2)剪碎后的細(xì)小組織通過加入適當(dāng)濃度的胰酶、膠原酶等消化臍帶組織塊1-2小時(shí)，以分化出細(xì)胞。收集分化出的細(xì)胞用干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；
3)間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)，用干細(xì)胞培養(yǎng)基通過常規(guī)干細(xì)胞培養(yǎng)的方式進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長狀況進(jìn)行換液，補(bǔ)液；
4)觀察細(xì)胞生長情況，取細(xì)胞檢測細(xì)胞表面標(biāo)志CD29、CD105的表達(dá)情況，高表達(dá)上述檢測物質(zhì)時(shí)，離心去除細(xì)胞，得到含間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子的細(xì)胞培養(yǎng)液；
5)取細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行硫酸銨沉淀，透析除鹽后，經(jīng)真空冷凍干燥制成包含干細(xì)胞分泌因子的組合物，然后將該組合物制備成口腔噴劑。
2.培養(yǎng)液中一些干細(xì)胞分泌因子的含量
照常規(guī)方法培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察間充質(zhì)干細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％-90％融合時(shí)，取部分上清，用ELISA法定量測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-8、MCP-1、TIMP-1的含量，設(shè)3個(gè)平行孔，得到的結(jié)果如表1所示
表1培養(yǎng)液中一些細(xì)胞因子的含量
由表1中可知，培養(yǎng)液中含有一定濃度的干細(xì)胞分泌因子，因此，尤其制備的組合物和口腔噴劑中也含有干細(xì)胞分泌因子?？捎糜趤喗】等巳?，需要改善免疫狀態(tài)的人群、需要提高機(jī)體抗炎能力的人群，有抗衰老需求的人群。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。