本發(fā)明涉及一種微生物限度檢查方法，尤其是一種衍宗育子膠囊中微生物限度檢查方法，屬于化學(xué)檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：衍宗育子膠囊為治療腎陽虛衰引起的男性不育，具有補腎壯陽、益氣生精的功效，藥品含有淫羊藿、肉蓯蓉、巴戟天、蛇床子、黃芪、西洋參等成分。根據(jù)其用藥途徑和制法，應(yīng)進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定，及控制菌——大腸埃希菌檢查。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單，方法可行的衍宗育子膠囊中微生物限度檢查方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的：一種衍宗育子膠囊中微生物限度檢查方法，依次包括下述步驟：1)菌液制備取經(jīng)33℃培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)液及25℃培養(yǎng)24h的白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)液，用0.9％無菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)為1000～10000cfu/ml的菌懸液，備用；取經(jīng)25℃培養(yǎng)7天的黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂斜面，加入5ml含0.05％聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，用帶有棉花的球形吸管吸出孢子懸液，用含0.05％聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液制成含孢子數(shù)為1000～10000cfu/ml的孢子懸液，備用；2)供試液制備取本品10g，加入預(yù)熱至45℃的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100ml，45℃氣浴振搖20min，混勻，作為1:10供試液；4)方法建立及回收率試驗采用稀釋法進(jìn)行需氧菌總數(shù)的測定、采用常規(guī)法進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)的測定，采用常規(guī)法進(jìn)行控制菌的檢查。進(jìn)一步的，上述的一種衍宗育子膠囊中微生物限度檢查方法，所述的常規(guī)法依次包括下述步驟：試驗組：吸取1:10供試液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗菌懸液，搖勻，分別從試驗菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另從真菌試管中分別吸取1ml至平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗菌平行制備2個平皿；菌液對照組：吸取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗菌懸液，搖勻，分別從試驗菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另從真菌試管中分別吸取1ml至平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗菌平行制備2個平皿；供試品組：吸取1:10供試液1ml至平皿，平行制備4個平皿，其中2個傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，另外2個傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；稀釋劑組：吸取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基1ml至平皿，平行制備4個平皿，其中2個傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，另外2個傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；各平皿傾注規(guī)定的瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，分別置規(guī)定溫度培養(yǎng)3－5d，測定需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，計算其回收率，計算公式如下；進(jìn)一步的，上述的一種衍宗育子膠囊中微生物限度檢查方法，所述的稀釋法依次包括下述步驟：供試液制備取本品10g，加入預(yù)熱至45℃的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100ml，45℃氣浴振搖20min，混勻，作為1:10供試液；吸取1:10供試液20ml加入80ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，搖勻制成1:50供試液；試驗組：吸取1:50供試液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗菌懸液，搖勻，分別從試驗菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗菌平行制備2個平皿；菌液對照組：吸取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗菌懸液，搖勻，分別從試驗菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗菌平行制備2個平皿；供試品組：吸取1:50供試液1ml至平皿，平行制備2個平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；各平皿傾注規(guī)定的瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)3d，測定需氧菌總數(shù)，計算公式如下；進(jìn)一步的，上述的一種衍宗育子膠囊中微生物限度檢查方法，所述的控制菌檢驗方法的建立及驗證依次包括下述步驟：1)取經(jīng)33℃培養(yǎng)24h的大腸埃希菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)液，用0.9％無菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)為10～100cfu/ml的菌懸液，備用；2)取本品10g，加入預(yù)熱至45℃的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100ml，45℃氣浴振搖20min，混勻，作為1:10供試液；3)試驗方法：取供試品組樣品做大腸埃希菌檢查；取試品組樣品，并加入相應(yīng)的陽性菌菌液1ml進(jìn)行培養(yǎng)，作大腸埃希菌檢查；取稀釋液10ml做大腸埃希菌檢查，作為陰性對照；進(jìn)一步的，上述的一種衍宗育子膠囊中微生物限度檢查方法，所述的大腸埃希菌檢查方法為：取1：10供試液10ml接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24h；取培養(yǎng)物1.0ml，接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，44℃培養(yǎng)24h，取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板，33℃培養(yǎng)24h，觀察其菌落形態(tài)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)勢：本發(fā)明提供的方法，采用稀釋法(1:50)進(jìn)行需氧菌總數(shù)的測定、采用常規(guī)法進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)的測定，采用常規(guī)法進(jìn)行控制菌的檢查。經(jīng)對所采用的方法進(jìn)行適用性試驗，符合2015年版《中國藥典》四部1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法、1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法、1107非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的有關(guān)規(guī)定，方法可行。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的權(quán)利要求書做進(jìn)一步說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何對本發(fā)明做有限次修改可得的技術(shù)方案仍然屬于本發(fā)明所要保護(hù)的范圍。實施例11、實驗用品1.l儀器設(shè)備生物安全柜、生化培養(yǎng)箱、全自動壓力滅菌器、電熱恒溫干燥箱、電冰箱、微波爐、恒溫水浴箱、電子天平(感量0.1g)、ThermoScientificMaxiMixII渦旋振蕩器、氣浴恒溫振蕩器。1.2玻璃器皿錐形瓶、平皿、燒杯、分度吸管、試管及硅膠塞，均于180℃干熱滅菌2h或高壓蒸汽121℃滅菌15min。1.3用具無菌衣、帽、口罩、手套、皮乳頭、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、滅菌不銹鋼藥匙、試管架、打火機、記號筆、實驗記錄紙等。1.4試液及培養(yǎng)基l.4.1消毒液0.1％苯扎溴銨溶液(供洗手、擦拭操作臺面用)，5％苯酚溶液(配好后裝入玻璃消毒缸內(nèi)供消毒帶菌吸管用)、75％乙醇溶液、碘伏溶液。1.4.2稀釋劑0.9％無菌氯化鈉溶液(稀釋菌液用)、含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(稀釋供試品用)。1.4.3培養(yǎng)基胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、。1.5樣品衍宗育子膠囊，批號：20161205、20161206、20161207，生產(chǎn)廠家：南寧協(xié)和醫(yī)院2、需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗的建立及驗證2.1菌種銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]枯草芽孢桿菌(BacillusSulticis)[CMCC(B)63501]白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]黑曲霉(Aspeigillusniger)[CMCC(F)98003]中國食品藥品檢定研究院提供2.2菌液制備取經(jīng)33℃培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)液及25℃培養(yǎng)24h的白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)液，用0.9％無菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)為1000～10000cfu/ml的菌懸液，備用；取經(jīng)25℃培養(yǎng)7天的黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂斜面，加入5ml含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，用帶有棉花的球形吸管吸出孢子懸液，用含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液制成含孢子數(shù)為1000～10000cfu/ml的孢子懸液，備用。2.3供試液制備取本品10g，加入預(yù)熱至45℃的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100ml，45℃氣浴振搖20min，混勻，作為1:10供試液。2.4方法建立及回收率試驗2.4.1常規(guī)法：試驗組：吸取1:10供試液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗菌懸液，搖勻，分別從試驗菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另從真菌試管中分別吸取1ml至平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗菌平行制備2個平皿；菌液對照組：吸取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗菌懸液，搖勻，分別從試驗菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另從真菌試管中分別吸取1ml至平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗菌平行制備2個平皿；供試品組：吸取1:10供試液1ml至平皿，平行制備4個平皿，其中2個傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，另外2個傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；稀釋劑組：吸取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基1ml至平皿，平行制備4個平皿，其中2個傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，另外2個傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。各平皿傾注規(guī)定的瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，分別置規(guī)定溫度培養(yǎng)3－5d，測定需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，計算其回收率，回收率試驗結(jié)果見表1。表1常規(guī)法測定回收率試驗結(jié)果結(jié)果顯示，需氧菌總數(shù)的金黃色葡萄球菌試驗菌回收率均小于0.5，表明衍宗育子膠囊對細(xì)菌有抑制作用，采用常規(guī)法進(jìn)行需氧菌總數(shù)測定不可行。霉菌和酵母菌總數(shù)的各株試驗菌回收率均在0.5-2，表明衍宗育子膠囊對真菌無抑制作用，采用常規(guī)法進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測定可行。2.4.2需氧菌計數(shù)------稀釋法(1:20)：供試液制備取本品10g，加入預(yù)熱至45℃的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100ml，45℃氣浴振搖20min，混勻，作為1:10供試液。吸取1:10供試液40ml加入40ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，搖勻制成1:20供試液；稀釋法(1:20)：試驗組：吸取1:20供試液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗菌懸液，搖勻，分別從試驗菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗菌平行制備2個平皿；菌液對照組：吸取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗菌懸液，搖勻，分別從試驗菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗菌平行制備2個平皿；供試品組：吸取1:20供試液1ml至平皿，平行制備2個平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；各平皿傾注規(guī)定的瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)3d，測定需氧菌總數(shù)，計算其回收率，見表2。表2回收率試驗結(jié)果：稀釋法(1:20)結(jié)果顯示，需氧菌總數(shù)的金黃色葡萄球菌試驗菌回收率小于0.5，表明衍宗育子膠囊對細(xì)菌有抑制作用，采用稀釋法(1:20)進(jìn)行需氧菌總數(shù)測定不可行。2.4.3需氧菌計數(shù)------稀釋法(1:50)：供試液制備取本品10g，加入預(yù)熱至45℃的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100ml，45℃氣浴振搖20min，混勻，作為1:10供試液。吸取1:10供試液20ml加入80ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，搖勻制成1:50供試液；稀釋法(1:50)：試驗組：吸取1:50供試液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗菌懸液，搖勻，分別從試驗菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗菌平行制備2個平皿；菌液對照組：吸取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗菌懸液，搖勻，分別從試驗菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗菌平行制備2個平皿；供試品組：吸取1:50供試液1ml至平皿，平行制備2個平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；各平皿傾注規(guī)定的瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)3d，測定需氧菌總數(shù)，計算其回收率，見表3。表3回收率試驗結(jié)果：稀釋法(1:50)結(jié)果顯示，需氧菌總數(shù)的各株試驗菌回收率均在0.5-2，表明稀釋法(1:50)可以消除衍宗育子膠囊對細(xì)菌的抑制作用，采用稀釋法(1:50)進(jìn)行需氧菌總數(shù)測定可行。2.5方法驗證取1批供試品，批號為：20161206，按稀釋法(1:50)進(jìn)行需氧菌總數(shù)、常規(guī)法進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)的計數(shù)方法驗證，結(jié)果見表4至表8：表4第一次試驗結(jié)果表5第二次試驗結(jié)果表6第三次試驗結(jié)果3次驗證試驗總結(jié)：表7衍宗育子膠囊----需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗回收率表8衍宗育子膠囊----霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗回收率3次驗證試驗結(jié)果表明，以稀釋法(1:50)進(jìn)行衍宗育子膠囊需氧菌總數(shù)、以常規(guī)法進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測定，五株試驗菌的回收率均在0.5－2.0，符合《中國藥典》2015年版四部1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法的規(guī)定，方法可行。確定采用稀釋法(1:50)進(jìn)行衍宗育子膠囊的非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查中需氧菌總數(shù)檢查，采用常規(guī)法進(jìn)行衍宗育子膠囊的非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查中霉菌和酵母菌總數(shù)檢查。3、控制菌檢驗方法的建立及驗證3.1菌種大腸埃希菌(EscherichiaColi)[CMCC(B)44102]中國食品藥品檢定研究院提供3.1.1菌懸液制備同2.2取經(jīng)33℃培養(yǎng)24h的大腸埃希菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)液，用0.9％無菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)為10～100cfu/ml的菌懸液，備用；3.2供試液的制備同2.33.3試驗方法：供試品組取規(guī)定量的樣品照“3.3.1”操作做控制菌檢查法檢查。陽性對照試驗取規(guī)定量的樣品照“3.3.1”操作，并加入相應(yīng)的陽性菌菌液1ml進(jìn)行培養(yǎng)，作相應(yīng)控制菌檢查法檢查。陰性對照試驗取稀釋液10ml代替供試液照“3.3.1”做控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。3.3.1大腸埃希菌：取1：10供試液10ml接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)物1.0ml，接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，44℃培養(yǎng)24h，取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板，33℃培養(yǎng)24h，觀察其菌落形態(tài)。3.4試驗結(jié)果3.4.1大腸埃希菌：供試品組：在麥康凱瓊脂平板中無菌落生長；陽性對照組：在麥康凱瓊脂平板中有典型大腸埃希菌菌落生長；革蘭氏染色鏡檢為G-桿菌，生化鑒定結(jié)果為典型大腸埃希氏菌生化反應(yīng)，結(jié)果見表9。表9大腸埃希菌檢測結(jié)果陰性對照組：在麥康凱瓊脂平板中無菌落生長；表明衍宗育子膠囊可采用常規(guī)法進(jìn)行大腸埃希菌檢驗，方法可行。3.5確定衍宗育子膠囊的非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查中控制菌檢查方法為常規(guī)法。4結(jié)論經(jīng)過驗證：確定采用稀釋法(1:50)進(jìn)行衍宗育子膠囊的非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查中需氧菌總數(shù)檢查，采用常規(guī)法進(jìn)行衍宗育子膠囊的非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查中霉菌和酵母菌總數(shù)檢查。采用常規(guī)法進(jìn)行衍宗育子膠囊的非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查中大腸埃希菌檢查。5三批衍宗育子膠囊的微生物限度檢查按所建立的衍宗育子膠囊非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查法，對三批樣品進(jìn)行檢驗，結(jié)果表10：表10三批衍宗育子膠囊的微生物限度檢查批號需氧菌總數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)大腸埃希菌結(jié)論20161205<50cfu/g<10cfu/g未檢出符合規(guī)定20161206<50cfu/g<10cfu/g未檢出符合規(guī)定20161207<50cfu/g<10cfu/g未檢出符合規(guī)定需要說明的是，本發(fā)明未詳細(xì)涉及的技術(shù)參數(shù)，均按照本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段或者中國藥典規(guī)定的參數(shù)進(jìn)行。當(dāng)前第1頁1 2 3