專利名稱：微生物催化法生產(chǎn)丙烯酰胺的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種微生物催化法生產(chǎn)丙烯酰胺。
背景技術(shù)：
丙烯酰胺是一種用途廣泛的有機(jī)化工原料。
1964年美國(guó)的氰氨公司首先開發(fā)了硫酸水合法生產(chǎn)丙烯酰胺的技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了丙烯酰胺的工業(yè)化生產(chǎn)。但該技術(shù)存在工藝復(fù)雜、產(chǎn)品精制困難、環(huán)境污染嚴(yán)重等問(wèn)題。70年代初日本和美國(guó)同時(shí)開發(fā)了以銅為主的各類催化水合方法來(lái)生產(chǎn)丙烯酰胺，它和硫酸法相比有不少優(yōu)點(diǎn)，產(chǎn)品純度、轉(zhuǎn)化率都有較大提高，環(huán)境污染少，成本低。
1985年，日本日東公司采用日本京都大學(xué)山田研究室的成果，建造了世界上第一個(gè)微生物法生產(chǎn)丙烯酰胺的工業(yè)性試驗(yàn)裝置。上海市農(nóng)藥研究所也在1986年從泰山的土壤中找到了一株產(chǎn)腈水合酶的菌株，并開始了微生物法生產(chǎn)丙烯酰胺的研究。微生物法較銅催化法具有較大優(yōu)勢(shì)，在整個(gè)生產(chǎn)工藝中微生物法可省去丙烯腈回收工段和銅分離工段，而且反應(yīng)在常溫常壓下進(jìn)行，降低了能耗，提高了生產(chǎn)過(guò)程的安全性，丙烯腈的轉(zhuǎn)化率可達(dá)99.99％，幾乎沒(méi)有副產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所屬解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服上述不足之處，設(shè)計(jì)一種應(yīng)用微生物技術(shù)制備丙烯酰胺的方法。
本發(fā)明提供了一種微生物催化法生產(chǎn)丙烯酰胺的方法，該方法是通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)含有腈水合酶的丙酸棒桿菌或其誘變菌株細(xì)胞，在一定條件下用游離細(xì)胞法或者固定化細(xì)胞法催化丙烯腈水合成丙烯酰胺，而后通過(guò)較為簡(jiǎn)單的后處理獲得高純度的丙烯酰胺產(chǎn)品。
本發(fā)明的具體實(shí)施方式
如下
(1)產(chǎn)酶細(xì)胞的制備先進(jìn)行發(fā)酵種子的培養(yǎng)，在三角瓶或種子罐中裝入適量的種子培養(yǎng)基(10-70％)，滅菌后接入一定量的菌種(1-10％)，在20-40℃下，旋轉(zhuǎn)式搖床中(100-400rpm)振蕩培養(yǎng)30-120小時(shí)，或者用50L-2M3的種子罐，實(shí)罐滅菌后接入斜面種子，空氣通量在1∶0.2-1∶1(V.V.M)，攪拌速度為10-400rpm，罐壓保持在0.03-0.06mPa，溫度為20-40℃，培養(yǎng)30-200小時(shí)。然后在50L-20m3的發(fā)酵罐其發(fā)酵培養(yǎng)基裝入量為40％-70％，實(shí)罐消毒后接入2-7％的種子液，在通氣量1∶0.2-1∶1(V.V.M)；攪拌轉(zhuǎn)速50-400rpm；罐壓0.03-0.06MP；溫度20-40℃。發(fā)酵30-200小時(shí)；種子培養(yǎng)基組成0.5-2％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.05-0.15％Nacl，0.05-0.3％K2HPO4，0.01-0.03％MgSo4，尿素0.1-1％，PH7.0-7.5；發(fā)酵培養(yǎng)基1-2.5％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.1-2％尿素，0.03-0.1％K2HPO4，0.03-0.1％KH2PO4，0.03-0.1％MgSO4，2-20ppmCoCl2，味精0.04-0.2％，PH6.5-7.5；(2)細(xì)胞固定化工藝將發(fā)酵液離心去上清，與海藻酸鈉溶液配制成含菌量為10-35％，海藻酸鈉為0.5-4％的均勻漿料，經(jīng)造粒器滴入0.1-0.5M的氯化鈣溶液，在低溫下經(jīng)24小時(shí)固化后，用蒸餾水清洗2-4次，即成固定化細(xì)胞，直徑約1-5mm，在4℃下低溫了冷藏保存；(3)游離細(xì)胞催化水合生產(chǎn)過(guò)程將發(fā)酵液在分離因素≥3000，離心分離，去上清液，將細(xì)胞懸浮于去離子水或者純凈水或PH7.0-8.0的緩沖液中，發(fā)酵液與反應(yīng)液的比例維持在≥1％，在5-55℃的溫度下，50-300rpm的攪拌速度下進(jìn)行酶催化反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)流加丙烯腈使底物濃度控制在0.001％-10％，經(jīng)過(guò)1-24h的反應(yīng)，獲得濃度在10％以上的丙烯酰胺溶液。它的產(chǎn)物溶液累積到一定濃度后(≥10％)一次性出罐，最終轉(zhuǎn)化率為≥99％，溶液中丙烯酸、丙烯醛濃度≤0.0001％；
(4)固定化細(xì)胞催化水合生產(chǎn)過(guò)程將獲得的固定化細(xì)胞加入到去離子水或者純凈水或PH7.0-8.0的緩沖液中，固定化細(xì)胞和水溶液的比例維持在≥1％，在5-55℃的溫度下，50-300rpm的攪拌速度下進(jìn)行酶催化反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)流加丙烯腈使底物濃度控制在0.001％-10％，經(jīng)過(guò)1-24h的反應(yīng)，獲得濃度在10％以上的丙烯酰胺溶液。它的產(chǎn)物溶液累積到一定濃度后(≥10％)一次性出罐，最終轉(zhuǎn)化率為≥99％，溶液中丙烯酸、丙烯醛濃度≤0.0001％。
本發(fā)明使用丙酸棒桿菌及其誘變菌種產(chǎn)生的腈水合酶將丙烯腈轉(zhuǎn)化成丙烯酰胺，其操作過(guò)程簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、減少環(huán)境污染，且分離提純簡(jiǎn)單，產(chǎn)品純度高。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列特點(diǎn)現(xiàn)有技術(shù)用于催化腈成酰胺的菌株主要是紅球菌屬的細(xì)菌，本發(fā)明采用的是丙酸棒桿菌及其經(jīng)誘變的菌種。該菌種由本所在含腈的土壤中分離獲得，經(jīng)初步鑒定為丙酸棒桿菌。該菌株已于2003年1月23日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No.0886.本菌株的分類命名為接近棒桿菌Corynebacterium propinguum。該菌株產(chǎn)酶能力強(qiáng)，在本發(fā)明的發(fā)酵條件下能獲得較高的生物量，最高可達(dá)40毫克/毫升發(fā)酵液，因而其單位體積發(fā)酵液的總酶活也較高，最高可達(dá)2400萬(wàn)單位/毫升發(fā)酵液。(注酶活單位定義，在一小時(shí)里將1微克的丙烯腈轉(zhuǎn)化為丙烯酰胺的酶量，單位微克/小時(shí))。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、在1m3的種子罐中加入60％的培養(yǎng)基，實(shí)罐消毒后，接入1茄子瓶的斜面菌種，發(fā)酵前期的通氣量為1∶0.3，攪拌速度為50rpm，后期的通氣量為1∶0.5，攪拌速度為100rpm，罐壓0.05mp，溫度28℃，培養(yǎng)50小時(shí)。
在10m3的發(fā)酵罐中加入60％的發(fā)酵培養(yǎng)基，實(shí)罐消毒后接入5％的種子液，在通氣量1∶0.5(V.V.M)；罐壓0.05MP；攪拌轉(zhuǎn)速前期180rpm，后期100rpm；溫度28℃。發(fā)酵60小時(shí)。
種子培養(yǎng)基組成0.6％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.05％K2HPO4，0.05％MgSo4，0.05％KH2PO4，尿素0.1％，PH7.2發(fā)酵培養(yǎng)基2.1％葡萄糖， 0.4％酵母膏，0.9％尿素，0.05％K2HPO4，0.05％KH2PO4，0.1％MgSO4，10ppm CoCl2，味精0.075％，PH7.5實(shí)施例2、將1噸發(fā)酵液在分離因素為3500，離心分離。去上清液，獲得約150kg(濕重)的細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮于去離子水中，發(fā)酵液與反應(yīng)液體積的比例維持在5％(v/v)。在20℃的溫度下，80rpm的攪拌速度下進(jìn)行酶催化反應(yīng)。通過(guò)流加丙烯腈使底物濃度維持在0.1％左右。在反應(yīng)的收尾階段，不再補(bǔ)加底物從而使底物濃度逐漸降低，趨向于零。反應(yīng)結(jié)束后，得到的丙烯酰胺溶液濃度為32％(w/v)，轉(zhuǎn)化率為99.99％。
實(shí)施例3、將1噸發(fā)酵液在分離因素為3500，離心分離。去上清液，獲得約150kg(濕重)的細(xì)胞。將細(xì)胞和海藻酸鈉混合配制成含菌量22％，海藻酸鈉2％的均勻漿料。經(jīng)造粒器滴入0.2M氯化鈣溶液，在4℃下保溫24小時(shí)，而后用蒸餾水洗滌兩次，去除殘留的氯化鈣，4℃低溫冷藏保存。
實(shí)施例4、將獲得的固定化細(xì)胞加入去離子水中，固定化細(xì)胞與去離子水的比例維持在3.6％。在20℃的溫度下，80rpm的攪拌速度下進(jìn)行酶催化反應(yīng)。通過(guò)流加丙烯腈使底物濃度維持在0.1％左右。在反應(yīng)的收尾階段，不再補(bǔ)加底物從而使底物濃度逐漸降低，趨向于零。反應(yīng)結(jié)束后，得到的丙烯酰胺溶液濃度為32％(w/v)，轉(zhuǎn)化率為99.99％。
權(quán)利要求
1.一種微生物催化法生產(chǎn)丙烯酰胺的方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)產(chǎn)酶細(xì)胞的制備先進(jìn)行發(fā)酵種子的培養(yǎng)，在三角瓶或種子罐中裝入10-70％的種子培養(yǎng)基，滅菌后接入1-10％的菌種，在20-40℃下，旋轉(zhuǎn)式搖床中，100-400rpm，振蕩培養(yǎng)30-120小時(shí)，或者用50L-2M3的種子罐，實(shí)罐滅菌后接入斜面種子，空氣通量在1∶0.2-1∶1，V.V.M，攪拌速度為10-400rpm，罐壓保持在0.03-0.06mPa，溫度為20-40℃，培養(yǎng)30-200小時(shí)，然后在50L-20m3的發(fā)酵罐其發(fā)酵培養(yǎng)基裝入量為40％-70％，實(shí)罐消毒后接入2-7％的種子液，在通氣量1∶0.2-1∶1，V.V.M；攪拌轉(zhuǎn)速50-400rpm；罐壓0.03-0.06MP；溫度20-40℃，發(fā)酵30-200小時(shí)；種子培養(yǎng)基組成0.5-2％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.05-0.15％Nacl，0.05-0.3％K2HPO4，0.01-0.03％MgSo4，尿素0.1-1％，PH7.0-7.5；發(fā)酵培養(yǎng)基1-2.5％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.1-2％尿素，0.03-0.1％K2HPO4，0.03-0.1％KH2PO4，0.03-0.1％MgSO4，2-20ppmCoCl2，味精0.04-0.2％，PH6.5-7.5；(2)游離細(xì)胞催化水合生產(chǎn)過(guò)程將發(fā)酵液在分離因素≥3000，離心分離，去上清液，將細(xì)胞懸浮于去離子水或者純凈水或PH7.0-8.0的緩沖液中，發(fā)酵液與反應(yīng)液的比例維持在≥1％，在5-55℃的溫度下，50-300rpm的攪拌速度下進(jìn)行酶催化反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)流加丙烯腈使底物濃度控制在0.001％-10％，經(jīng)過(guò)1-24h的反應(yīng)，獲得濃度在10％以上的丙烯酰胺溶液，它的產(chǎn)物溶液累積到一定濃度后，≥10％，一次性出罐，最終轉(zhuǎn)化率為≥99％，溶液中丙烯酸、丙烯醛濃度≤0.0001％。
2.一種微生物催化法生產(chǎn)丙烯酰胺的方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)產(chǎn)酶細(xì)胞的制備先進(jìn)行發(fā)酵種子的培養(yǎng)，在三角瓶或種子罐中裝入10-70％的種子培養(yǎng)基，滅菌后接入1-10％的菌種，在20-40℃下，旋轉(zhuǎn)式搖床中，100-400rpm，振蕩培養(yǎng)30-120小時(shí)，或者用50L-2M3的種子罐，實(shí)罐滅菌后接入斜面種子，空氣通量在1∶0.2-1∶1，V.V.M，攪拌速度為10-400rpm，罐壓保持在0.03-0.06mPa，溫度為20-40℃，培養(yǎng)30-200小時(shí)，然后在50L-20m3的發(fā)酵罐其發(fā)酵培養(yǎng)基裝入量為40％-70％，實(shí)罐消毒后接入2-7％的種子液，在通氣量1∶0.2-1∶1，V.V.M；攪拌轉(zhuǎn)速50-400rpm；罐壓0.03-0.06MP；溫度20-40℃，發(fā)酵30-200小時(shí)；種子培養(yǎng)基組成0.5-2％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.05-0.15％Nacl，0.05-0.3％K2HPO4，0.01-0.03％MgSo4，尿素0.1-1％，PH7.0-7.5；發(fā)酵培養(yǎng)基1-2.5％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.1-2％尿素，0.03-0.1％K2HPO4，0.03-0.1％KH2PO4，0.03-0.1％MgSO4，2-20ppm CoCl2，味精0.04-0.2％，PH6.5-7.5；(2)細(xì)胞固定化工藝將發(fā)酵液離心去上清，與海藻酸鈉溶液配制成含菌量為10-35％，海藻酸鈉為0.5-4％的均勻漿料，經(jīng)造粒器滴入0.1-0.5M的氯化鈣溶液，在低溫下經(jīng)24小時(shí)固化后，用蒸餾水清洗2-4次，即成固定化細(xì)胞，直徑約1-5mm，在4℃下低溫了冷藏保存；(3)固定化細(xì)胞催化水合生產(chǎn)過(guò)程將獲得的固定化細(xì)胞加入到去離子水或者純凈水或PH7.0-8.0的緩沖液中，固定化細(xì)胞和水溶液的比例維持在≥1％，在5-55℃的溫度下，50-300rpm的攪拌速度下進(jìn)行酶催化反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)流加丙烯腈使底物濃度控制在0.001％-10％，經(jīng)過(guò)1-24h的反應(yīng)，獲得濃度在10％以上的丙烯酰胺溶液，它的產(chǎn)物溶液累積到一定濃度后，≥10％，一次性出罐，最終轉(zhuǎn)化率為≥99％，溶液中丙烯酸、丙烯醛濃度≤0.0001％。
3.一種丙酸棒桿菌，其特征在于該菌株的分類命名為接近棒桿菌，Corynebacterium propinguum，保藏登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No.0886。
全文摘要
本發(fā)明屬微生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種微生物催化法生產(chǎn)丙烯酰胺的方法。本發(fā)明的方法通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)含有腈水合酶的丙酸棒桿菌或其誘變株細(xì)胞，然后用游離細(xì)胞法或固定化細(xì)胞法催化丙烯腈水合成丙烯酰胺，經(jīng)后處理得高純度的丙烯酰胺產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12P13/00GK1524962SQ0311553
公開日2004年9月1日 申請(qǐng)日期2003年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月27日
發(fā)明者薛建萍, 沈寅初 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)藥研究所, 沈寅初, 薛建萍