本發(fā)明涉及一種微生物限度檢查方法，尤其是一種樟腦中微生物限度檢查方法，屬于化學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

樟腦丸有天然樟腦丸與合成樟腦丸之分。是一種有機(jī)化合物，含有萘的樟腦丸大多呈白色，氣味刺鼻，且沉于水中；而天然樟腦丸則是光滑的呈無色或白色的晶體，氣味清香，會(huì)浮于水中。用于防蟲、防蛀、防霉的天然樟腦丸又被稱為臭珠，原本是從樟樹枝葉中提煉出的有芳香味的有機(jī)化合物。也用來制藥、香料等，醫(yī)藥上用作強(qiáng)心藥。

參考其成品藥用藥途徑和制法，應(yīng)進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定，及控制菌——金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的檢查。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的樟腦中微生物限度檢查方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的：

一種樟腦中微生物限度檢查方法，依次包括下述步驟：

1)菌液制備

取經(jīng)33℃培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)液及25℃培養(yǎng)24h的白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)液，用0.9％無菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)為1000～10000cfu/ml的菌懸液，備用；

取經(jīng)25℃培養(yǎng)7天的黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂斜面，加入5ml含0.05％聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，用帶有棉花的球形吸管吸出孢子懸液，用含0.05％聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液制成含孢子數(shù)為1000～10000cfu/ml的孢子懸液，備用；

2)供試液制備

取本品10g，加入10ml十四烷酸異丙酯，再加入預(yù)熱至45℃的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100ml，45℃氣浴振搖5min，混勻，作為1:10供試液；

3)方法建立及回收率試驗(yàn)

試驗(yàn)組：吸取1:10供試液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗(yàn)菌懸液，搖勻，分別從試驗(yàn)菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另從真菌試驗(yàn)菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿；

菌液對照組：吸取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗(yàn)菌懸液，搖勻，分別從試驗(yàn)菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另從真菌試管中分別吸取1ml至平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿；

中和劑對照組：吸取10ml十四烷酸異丙酯，加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中至100ml，吸取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗(yàn)菌懸液，搖勻，分別從試驗(yàn)菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另從真菌試管中分別吸取1ml至平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿；

供試品組：吸取1:10供試液1ml至平皿，平行制備4個(gè)平皿，其中2個(gè)傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，另外2個(gè)傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；

稀釋劑組：吸取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基1ml至平皿，平行制備4個(gè)平皿，其中2個(gè)傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，另外2個(gè)傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；

中和劑組：吸取10ml十四烷酸異丙酯，加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中至100ml，吸取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基1ml至平皿，平行制備4個(gè)平皿，其中2個(gè)傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，另外2個(gè)傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；

各平皿傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，分別置規(guī)定溫度培養(yǎng)3－5d，測定需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，計(jì)算其回收率；

4)控制菌檢驗(yàn)方法的建立及驗(yàn)證

4.1)菌懸液制備

取含菌量為1000～10000cfu/ml的銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌菌懸液，用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋制成含菌數(shù)為10～100cfu/ml的菌懸液，備用；

4.2)制備供試液

4.3)試驗(yàn)方法

取供試品組樣品做金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌檢查；

取供試品組樣品，并加入相應(yīng)的陽性菌菌液1ml進(jìn)行培養(yǎng)，作金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌檢查；

取稀釋液10ml做金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌檢查，作為陰性對照。

進(jìn)一步的，上述的樟腦中微生物限度檢查方法，所述的金黃色葡萄球菌檢測方法為：取1：10供試液10ml接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24h；取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂平板，33℃培養(yǎng)24h，觀察其菌落形態(tài)；

進(jìn)一步的，上述的樟腦中微生物限度檢查方法，所述的銅綠假單胞菌為取1：10供試液10ml接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24h；取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲胺瓊脂平板，33℃培養(yǎng)24h，觀察其菌落形態(tài)。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)勢：

本發(fā)明提供的方法，微生物計(jì)數(shù)法、1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法、1107非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)規(guī)定，進(jìn)行微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)，以確保檢查方法的準(zhǔn)確、可靠。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的權(quán)利要求書做進(jìn)一步說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何對本發(fā)明做有限次修改可得的技術(shù)方案仍然屬于本發(fā)明所要保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

1、實(shí)驗(yàn)用品

1.l儀器設(shè)備

生物安全柜、生化培養(yǎng)箱、全自動(dòng)壓力滅菌器、電熱恒溫干燥箱、電冰箱、微波爐、恒溫水浴箱、電子天平(感量0.1g)、Thermo Scientific Maxi Mix II渦旋振蕩器、氣浴恒溫振蕩器。

1.2玻璃器皿

錐形瓶、平皿、燒杯、分度吸管、試管及硅膠塞，均于180℃干熱滅菌2h或高壓蒸汽121℃滅菌15min。

1.3用具

無菌衣、帽、口罩、手套、皮乳頭、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球及碘伏棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、滅菌過濾筒、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號(hào)筆、實(shí)驗(yàn)記錄紙等。

1.4試液及培養(yǎng)基

l.4.1消毒液

0.1％苯扎溴銨溶液(供洗手、擦拭操作臺(tái)面用)，5％苯酚溶液(配好后裝入玻璃消毒缸內(nèi)供消毒帶菌吸管用)、75％乙醇溶液、碘伏溶液。

1.4.2稀釋劑

0.9％無菌氯化鈉溶液(稀釋菌液用)、含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(稀釋供試品用)。

1.4.3中和劑

十四烷酸異丙酯

1.4.4培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基。

1.5樣品

樟腦(合成)，批號(hào)：YZ1503002、YZ1508006、YZ1510006，生產(chǎn)廠家：黃埔化工藥業(yè)有限公司

2、需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)的建立及驗(yàn)證

2.1菌種

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

枯草芽孢桿菌(Bacillus Sulticis)[CMCC(B)63501]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]

黑曲霉(Aspeigillus niger)[CMCC(F)98003]

中國食品藥品檢定研究院提供

2.2菌液制備

取經(jīng)33℃培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)液及25℃培養(yǎng)24h的白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)液，用0.9％無菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)為1000～10000cfu/ml的菌懸液，備用；取經(jīng)25℃培養(yǎng)7天的黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂斜面，加入5ml含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，用帶有棉花的球形吸管吸出孢子懸液，用含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液制成含孢子數(shù)為1000～10000cfu/ml的孢子懸液，備用。

2.3供試液制備

取本品10g，加入10ml十四烷酸異丙酯，再加入預(yù)熱至45℃的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100ml，45℃氣浴振搖5min，混勻，作為1:10供試液。

2.4方法建立及回收率試驗(yàn)

2.4.1中和法：

試驗(yàn)組：吸取1:10供試液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗(yàn)菌懸液，搖勻，分別從試驗(yàn)菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另從真菌試驗(yàn)菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿；

菌液對照組：吸取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗(yàn)菌懸液，搖勻，分別從試驗(yàn)菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另從真菌試管中分別吸取1ml至平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿；

中和劑對照組：吸取10ml十四烷酸異丙酯，加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中至100ml，吸取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗(yàn)菌懸液，搖勻，分別從試驗(yàn)菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另從真菌試管中分別吸取1ml至平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿；

供試品組：吸取1:10供試液1ml至平皿，平行制備4個(gè)平皿，其中2個(gè)傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，另外2個(gè)傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；

稀釋劑組：吸取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基1ml至平皿，平行制備4個(gè)平皿，其中2個(gè)傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，另外2個(gè)傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

中和劑組：吸取10ml十四烷酸異丙酯，加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中至100ml，吸取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基1ml至平皿，平行制備4個(gè)平皿，其中2個(gè)傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，另外2個(gè)傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

各平皿傾注規(guī)定的瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，分別置規(guī)定溫度培養(yǎng)3－5d，測定需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，計(jì)算其回收率。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的各株試驗(yàn)菌回收率均在50％－200％，表明中和法可以消除樟腦(合成)對細(xì)菌、真菌的抑制作用，采用中和法進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)測定可行。

十四烷酸異丙酯作為中和劑無抑菌作用，對實(shí)驗(yàn)無干擾。

2.5方法驗(yàn)證

取1批供試品，批號(hào)為：YZ1503002，按中和法進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證，結(jié)果如表2至表6：

表2 第一次試驗(yàn)結(jié)果

表3 第二次試驗(yàn)結(jié)果

表4 第三次試驗(yàn)結(jié)果

3次驗(yàn)證試驗(yàn)總結(jié)：

表5 樟腦----需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)回收率

表6 樟腦----霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)回收率

3次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，以中和法進(jìn)行樟腦需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)測定，五株試驗(yàn)菌的回收率均在50％－200％，符合《中國藥典》2015年版四部1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法的規(guī)定，方法可行。

確定采用中和法進(jìn)行樟腦(合成)的非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查中需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查。

3、控制菌檢驗(yàn)方法的建立及驗(yàn)證

3.1菌種

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供

3.1.1菌懸液制備

取2.2下含菌量為1000～10000cfu/ml的銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌菌懸液，用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋制成含菌數(shù)為10～100cfu/ml的菌懸液，備用。

3.2供試液的制備同2.3

3.3試驗(yàn)方法：

供試品組取規(guī)定量的樣品照“3.3.1”、“3.3.2”操作做控制菌檢查法檢查。

陽性對照試驗(yàn)取規(guī)定量的樣品照“3.3.1”、“3.3.2”操作，并加入相應(yīng)的陽性菌菌液1ml進(jìn)行培養(yǎng)，作相應(yīng)控制菌檢查法檢查。

陰性對照試驗(yàn)取稀釋液10ml代替供試液照“3.3.1”、“3.3.2”做控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。

3.3.1金黃色葡萄球菌：

取1：10供試液10ml接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24h。取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂平板，33℃培養(yǎng)24h，觀察其菌落形態(tài)。

3.3.2銅綠假單胞菌：

取1：10供試液10ml接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24h。取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲胺瓊脂平板，33℃培養(yǎng)24h，觀察其菌落形態(tài)。

3.4試驗(yàn)結(jié)果

3.4.1金黃色葡萄球菌：

供試品組：在甘露醇氯化鈉瓊脂平板中無菌落生長；

陽性對照組：在甘露醇氯化鈉瓊脂平板中有典型金黃色葡萄球菌菌落生長；革蘭氏染色鏡檢為G⁺球菌，血漿凝固酶試驗(yàn)為陽性。

陰性對照組：在甘露醇氯化鈉瓊脂平板中無菌落生長；

表明樟腦(合成)采用常規(guī)法進(jìn)行金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)，方法可行。

3.4.2銅綠假單胞菌：

供試品組：在溴化十六烷基三甲胺瓊脂平板中無菌落生長；

陽性對照組：在溴化十六烷基三甲胺瓊脂平板中有典型金黃色葡萄球菌菌落生長；革蘭氏染色鏡檢為G^-桿菌，生化鑒定結(jié)果為典型銅綠假單胞菌生化反應(yīng)，結(jié)果見表7。表7 銅綠假單胞菌檢測結(jié)果

陰性對照組：在溴化十六烷三甲胺瓊脂平板中無菌落生長；

表明樟腦(合成)采用常規(guī)法進(jìn)行銅綠假單胞菌檢驗(yàn)，方法可行。

3.5確定樟腦(合成)的非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查中控制菌檢查方法為常規(guī)法。

4結(jié)論

經(jīng)過驗(yàn)證：確定采用中和法進(jìn)行樟腦(合成)的非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查。

采用常規(guī)法進(jìn)行樟腦(合成)的非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查中金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌檢查。

5三批樟腦(合成)的微生物限度檢查

按所建立的樟腦(合成)非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查法，對三批樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表8：

需要說明的是，本發(fā)明未詳細(xì)涉及的技術(shù)參數(shù)，均按照本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段或者中國藥典規(guī)定的參數(shù)進(jìn)行。