本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種葡萄糖腦苷脂酶基因檢測試劑盒，及其檢測方法。

背景技術(shù)：

編碼葡糖腦苷脂酶的基因(Glucocerebmsidas，以下簡述GBA)突變會(huì)造成該酶的缺乏，從而引起葡糖腦苷脂在肝、脾、骨骼和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的單核-巨噬細(xì)胞內(nèi)蓄積而發(fā)病，產(chǎn)生肝脾腫大、骨骼畸形、生長發(fā)育落后、貧血等臨床表現(xiàn)。

然而目前檢測GBA的主要技術(shù)為基因測序，存在低通量、操作復(fù)雜、耗時(shí)長等缺點(diǎn)。

熒光定量PCR技術(shù)是一項(xiàng)發(fā)展較為成熟的核酸檢測方法。其優(yōu)勢在于：操作簡便，因閉管操作可以減少污染，結(jié)果分析快捷。其中Taqman探針技術(shù)是一種通過檢測聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，以下簡稱PCR)過程中產(chǎn)生的熒光信號(hào)來區(qū)分等位基因類型的基因檢測技術(shù)。針對(duì)待檢測的基因位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)Taqman探針及其對(duì)應(yīng)上下游引物，所述探針對(duì)分別檢測目標(biāo)位點(diǎn)的兩種等位基因。每條探針的5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。在PCR擴(kuò)增過程中，利用Taq酶5’端核酸酶活性降解因與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)而結(jié)合在單鏈上的探針，令熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離從而產(chǎn)生熒光。若探針與目標(biāo)序列存在錯(cuò)配，則不能與單鏈結(jié)合，亦不會(huì)產(chǎn)生熒光。因此通過熒光定量PCR儀收集PCR擴(kuò)增期間熒光信號(hào)的變化，可以判別檢測樣本的基因型。Taqman探針技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是不需要分離或洗脫等PCR后處理過程，簡化操作流程并提高了檢測速度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種高準(zhǔn)確性、低成本、高通量、快速的檢測試劑盒，可用于檢測葡糖腦苷脂酶基因是否存在突變。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種葡萄糖腦苷脂酶基因檢測試劑盒，包括用于特異性識(shí)別葡萄糖腦苷脂酶基因上4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的Taqman探針及用于擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)所在基因片段所對(duì)應(yīng)的引物對(duì)，4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)分別為N188S、F213I、D409H和L444P。

所述Taqman探針包括野生型探針和突變型探針，對(duì)應(yīng)4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的野生型探針和突變型探針如下表所示：

表1、各個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的探針序列

W代表野生型特異探針，M代表突變型特異探針。

Taqman探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)、3'端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)，所述熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM、VIC、TAMRA或ROX中的一種，所述淬滅基團(tuán)是BHQ-1或BHQ-2。

所述引物對(duì)包括上游引物和下游引物，對(duì)應(yīng)4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的上游引物和下游引物如下表所示：

表2、各個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的引物序列

F代表上游引物，R代表下游引物。

優(yōu)選地，所述引物對(duì)以2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)為一組進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。所述多態(tài)性位點(diǎn)的分組為：第一組，N188S、F213I；第二組，D409H、L444P。

優(yōu)選地，所述檢測試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品包括含有4種質(zhì)粒。單個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)具有3種分型，兩種純合子型以及一種雜合子型。針對(duì)一組體系，應(yīng)用到2份純合子標(biāo)準(zhǔn)品及1份雜合子標(biāo)準(zhǔn)品。所述純合子標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)對(duì)應(yīng)于兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的純合子型，雜合子標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)于兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的雜合子型。標(biāo)準(zhǔn)品均由含多態(tài)性位點(diǎn)擴(kuò)增片段的質(zhì)粒組成。一組體系的純合子標(biāo)準(zhǔn)品由1種質(zhì)粒構(gòu)成，雜合子標(biāo)準(zhǔn)品由2種質(zhì)粒構(gòu)成。

體系1的野生型純合子標(biāo)準(zhǔn)品1由含有N188S-A型和F213I-T型的質(zhì)粒組成，其對(duì)應(yīng)的檢測熒光報(bào)告基團(tuán)分別為FAM及VIC，突變型純合子標(biāo)準(zhǔn)品2由含有N188S-G型和F213I-A型的質(zhì)粒組成，其對(duì)應(yīng)的檢測熒光報(bào)告基團(tuán)分別為TAMRA及ROX，雜合子標(biāo)準(zhǔn)品3由野生型純合子標(biāo)準(zhǔn)品1和突變型純合子標(biāo)準(zhǔn)品2的質(zhì)粒混合組成，其檢測熒光報(bào)告基團(tuán)分別為FAM、TAMRA、VIC及ROX。所述野生型純合子標(biāo)準(zhǔn)品1的質(zhì)粒包含如下序列：

CCTTTGTCTCTAGATACCCCTGATTCACCGAGCCCTGCAGTTGGCCCAGCGTCCCGTTTCACTCCTTGCCAGCCCCTGGACATCACCCACTTGGCTCAAGACCAATGGAGCGGTGAATGGGAAGGGGTCACTCAAGGGACAGCCCGGAGACATCTACCACCAGACCTGGGCCAGATACTTTGTGAAGTAAGGGATCAGCAAGGATGTGGGATCAGGACTGGCCTCCCATTTAGCCATGCTGATCTGTGTCCCAACCCTCAACCTAGTTCCACTTCCAGATCTGCCTGTCCTCAGCTCACCTTTCTACCT(SEQ ID NO.17)。

所述突變型純合子標(biāo)準(zhǔn)品2的質(zhì)粒包含如下序列：

GGCTGGACCGACTGGAACCTTGCCCTGAACCCCGAAGGAGGACCCAATTGGGTGCGTAACTTTGTCGACAGTCCCATCATTGTAGACATCACCAAGGACACGTTTTACAAACAGCCCATGTTCTACCACCTTGGCCACTTCAGGTGAGTGGAGGGCGGGCACCCCCATTCCATACCAGGCCTATCATCTCCTACATCGGAGCTCCAGGCCTAGAGAGCCAGGGCAGAGCCTCTGCAGGAGTTATGGGGTGGGTCCGTGGGTGGGTGACTTCTTAGATGAGGGTTTCATGGGAGGTACCCCGAGGGACTCTGACCATCTGTTCCCACATTCAGCAAGTTCATTCCTGAGGGCTCCCAGAGAGTGGGGCTGGTTGCCAGTCAGAAGAACGACCTGGACGCAGTGGCACTGATGCATCCCGATGGCTCTGCTGTTGTGGTCGTGCTAAACCGGTGAGGGCAATGGTGAGGTCTGGGAAGTGGGCTGAAGACAGCGTTGGGGGCCTTGG(SEQ ID NO.18)。

體系2的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品組合與此類似，純合子標(biāo)準(zhǔn)品4由含有D409H-G型和L444P-T型的質(zhì)粒組成，其對(duì)應(yīng)的檢測熒光報(bào)告基團(tuán)分別為FAM及VIC，純合子標(biāo)準(zhǔn)品5由含有D409H-C型和L444P-C型的質(zhì)粒組成，其對(duì)應(yīng)的檢測熒光報(bào)告基團(tuán)分別為TAMRA及ROX，雜合子標(biāo)準(zhǔn)品6由野生型純合子標(biāo)準(zhǔn)品4和突變型純合子標(biāo)準(zhǔn)品5的質(zhì)?；旌辖M成，其檢測熒光報(bào)告基團(tuán)分別為FAM、TAMRA、VIC及ROX。所述野生型純合子標(biāo)準(zhǔn)品4的質(zhì)粒包含如下序列：

CCTTTGTCTCTAGATACCCCTGATTCACCGAGCCCTGCAGTTGGCCCAGCGTCCCGTTTCACTCCTTGCCAGCCCCTGGACATCACCCACTTGGCTCAAGACCAGTGGAGCGGTGAATGGGAAGGGGTCACTCAAGGGACAGCCCGGAGACATCTACCACCAGACCTGGGCCAGATACATTGTGAAGTAAGGGATCAGCAAGGATGTGGGATCAGGACTGGCCTCCCATTTAGCCATGCTGATCTGTGTCCCAACCCTCAACCTAGTTCCACTTCCAGATCTGCCTGTCCTCAGCTCACCTTTCTACCT(SEQ ID NO.19)。

所述突變型純合子標(biāo)準(zhǔn)品5的質(zhì)粒包含如下序列：

GGCTGGACCGACTGGAACCTTGCCCTGAACCCCGAAGGAGGACCCAATTGGGTGCGTAACTTTGTCGACAGTCCCATCATTGTAGACATCACCAAGCACACGTTTTACAAACAGCCCATGTTCTACCACCTTGGCCACTTCAGGTGAGTGGAGGGCGGGCACCCCCATTCCATACCAGGCCTATCATCTCCTACATCGGAGCTCCAGGCCTAGAGAGCCAGGGCAGAGCCTCTGCAGGAGTTATGGGGTGGGTCCGTGGGTGGGTGACTTCTTAGATGAGGGTTTCATGGGAGGTACCCCGAGGGACTCTGACCATCTGTTCCCACATTCAGCAAGTTCATTCCTGAGGGCTCCCAGAGAGTGGGGCTGGTTGCCAGTCAGAAGAACGACCCGGACGCAGTGGCACTGATGCATCCCGATGGCTCTGCTGTTGTGGTCGTGCTAAACCGGTGAGGGCAATGGTGAGGTCTGGGAAGTGGGCTGAAGACAGCGTTGGGGGCCTTGG(SEQ ID NO.20)。

標(biāo)準(zhǔn)品中同種質(zhì)粒的拷貝數(shù)一致。標(biāo)準(zhǔn)品的制備可以根據(jù)NCBI上公開的葡萄糖腦苷脂酶基因序列采用常規(guī)的T-A克隆方法制備得到。

所述檢測試劑盒還包括10x熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、dNTPs混合液、HS-Taq酶和超純水。

一種葡萄糖腦苷脂酶基因檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于：使用如權(quán)利要求1～3、5～8任一項(xiàng)所述的葡萄糖腦苷脂酶基因檢測試劑盒對(duì)樣本中葡萄糖腦苷脂酶基因的4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的擴(kuò)增采用四重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)，以熒光定量PCR儀對(duì)反應(yīng)過程中的熒光信號(hào)進(jìn)行收集。

其中，所述四重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)的擴(kuò)增程序?yàn)椋撼跏甲冃裕?5℃保持2分鐘；熱循環(huán)40次，每次先95℃保持15秒，隨后60℃保持1分鐘；循環(huán)完畢后16℃保溫。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，提高了多態(tài)性位點(diǎn)檢測的模板量，大大降低假陽性；

(2)Taqman探針通過配備不同的熒光報(bào)告基團(tuán)，在一次四重?zé)晒舛縋CR下最多可以檢測2個(gè)位點(diǎn)的基因分型，具有高效節(jié)約的特點(diǎn)；

(3)四重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)在2個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，Taqman探針特異性高，此檢測方法具有用時(shí)少，快速和準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)；

(4)閉管檢測，減少人為及環(huán)境污染，提高準(zhǔn)確性。

(5)操作及結(jié)果判定簡單：整個(gè)PCR擴(kuò)增過程可以通過電腦軟件進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測,能夠隨時(shí)掌握PCR擴(kuò)增情況；PCR擴(kuò)增結(jié)果在電腦上直接顯示,無需電泳、染色等步驟,避免了使用有毒試劑和肉眼判斷結(jié)果的主觀性。

附圖說明

圖1是試劑盒中純合子標(biāo)準(zhǔn)品1的檢測圖譜，菱形(FAM)代表N188S野生型、正方形(VIC)代表F213I野生型；

圖2是試劑盒中純合子標(biāo)準(zhǔn)品2的檢測圖譜，三角形(TAMRA)代表N188S突變型、星號(hào)(ROX)代表F213I突變型；

圖3是試劑盒中雜合子標(biāo)準(zhǔn)品3的檢測圖譜,菱形(FAM)代表N188S野生型、三角形(TAMRA)代表N188S突變型、正方形(VIC)代表F213I野生型、星號(hào)(ROX)代表F213I突變型；

圖4是試劑盒中純合子標(biāo)準(zhǔn)品4的檢測圖譜，菱形(FAM)代表D409H野生型、正方形(VIC)代表L444P野生型；

圖5是試劑盒中純合子標(biāo)準(zhǔn)品5的檢測圖譜，三角形(TAMRA)代表D409H突變型、星號(hào)(ROX)代表L444P突變型；

圖6是試劑盒中雜合子標(biāo)準(zhǔn)品6的檢測圖譜,菱形(FAM)代表D409H野生型、三角形(TAMRA)代表D409H突變型、正方形(VIC)代表L444P野生型、星號(hào)(ROX)代表L444P突變型；

圖7與圖8是實(shí)施例1的檢測圖譜，圖7的菱形(FAM)代表N188S野生型、正方形(VIC)代表F213I野生型，圖8的菱形(FAM)代表D409H野生型、正方形(VIC)代表L444P野生型；

圖9與圖10是實(shí)施例2的檢測圖譜，圖9的菱形(FAM)代表N188S野生型、星號(hào)(ROX)代表F213I突變型，圖10的菱形(FAM)代表D409H野生型、正方形(VIC)代表L444P野生型；

圖11和圖12是實(shí)施例3的檢測圖譜，圖11的菱形(FAM)代表N188S野生型、三角形(TAMRA)代表N188S突變型、正方形(VIC)代表F213I野生型，圖12的菱形(FAM)代表D409H野生型、正方形(VIC)代表L444P野生型；

圖13和圖14是實(shí)施例4的檢測圖譜，圖13的三角形(TAMRA)代表N188S突變型、正方形(VIC)代表F213I野生型，圖14的菱形(FAM)代表D409H野生型、正方形(VIC)代表L444P野生型、星號(hào)(ROX)代表L444P突變型。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1：葡萄糖腦苷脂酶基因檢測試劑盒的組成和使用方法

所述檢測試劑盒包括的用于特異性識(shí)別葡萄糖腦苷脂酶基因上4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的Taqman探針及用于擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)所在基因片段所對(duì)應(yīng)的引物對(duì)，具體為如下表所示：

表3、檢測試劑盒的組成

所述葡萄糖腦苷脂酶基因檢測試劑盒的使用方法：

1、樣本DNA的提取

根據(jù)樣本的實(shí)際情況，選擇合適的方法提取樣本DNA，常見的方法有磁珠法、陰離子交換樹脂法和堿裂解法等等；

2、熒光定量PCR反應(yīng)

熒光定量PCR反應(yīng)的擴(kuò)增體系如下：

表4、熒光定量PCR反應(yīng)體系

熒光定量PCR反應(yīng)的擴(kuò)增程序如下：

表5、熒光定量PCR擴(kuò)增程序

3、軟件分析獲得結(jié)果

使用軟件SDS2.4對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

實(shí)施例2：標(biāo)準(zhǔn)圖譜的建立

按實(shí)施例1的使用方法，對(duì)葡萄糖腦苷脂酶基因檢測試劑盒內(nèi)的純合子標(biāo)準(zhǔn)品和雜合子標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，獲得如圖1、2、4、5所示的純合子標(biāo)準(zhǔn)品的檢測圖譜以及如圖3和圖6所述的雜合子標(biāo)準(zhǔn)品的檢測圖譜。

實(shí)施例3：一號(hào)樣品檢測

按實(shí)施例1的使用方法，對(duì)一號(hào)樣本進(jìn)行檢測，獲得如圖7和圖8所示的圖譜，可知一號(hào)樣本為純合野生型。

實(shí)施例4：二號(hào)樣品檢測

按實(shí)施例1的使用方法，對(duì)二號(hào)樣本的檢測結(jié)果如圖9和圖10所示，可知二號(hào)樣本為F213I單位點(diǎn)突變。

實(shí)施例5：三號(hào)樣品檢測

按實(shí)施例1的使用方法，對(duì)三號(hào)樣本的檢測結(jié)果如圖11和圖12所示，可知三號(hào)樣本為N188S單位點(diǎn)突變。

實(shí)施例6：四號(hào)樣品檢測

按實(shí)施例1的使用方法，對(duì)四號(hào)樣本的檢測結(jié)果如圖13和圖14所示，可知四號(hào)樣本為N188S和L444P雙位點(diǎn)突變。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東華美眾源生物科技有限公司

<120> 一種葡萄糖腦苷脂酶基因檢測試劑盒及其檢測方法

<130> 2016

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cacccacttg gctcaagacc aatgga 26

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acttggctca agaccagtgg agcggt 26

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agcgtcccgt ttcactcct 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccagtcctga tcccacatcc t 21

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<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

accagacctg ggccagatac tttgtgaa 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

accagacctg ggccagatac attgtgaa 28

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agcgtcccgt ttcactcct 19

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccagtcctga tcccacatcc t 21

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cccatcattg tagacatcac caaggacacg 30

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccatcattgt agacatcacc aagcacacg 29

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cccgaaggag gacccaat 18

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgaagtggcc aaggtggtag a 21

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<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccagtcagaa gaacgacctg gacgca 26

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgccagtcag aagaacgacc cggac 25

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cctgagggct cccagagagt 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tagcacgacc acaacagcag a 21

<210> 17

<211> 309

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cctttgtctc tagatacccc tgattcaccg agccctgcag ttggcccagc gtcccgtttc 60

actccttgcc agcccctgga catcacccac ttggctcaag accaatggag cggtgaatgg 120

gaaggggtca ctcaagggac agcccggaga catctaccac cagacctggg ccagatactt 180

tgtgaagtaa gggatcagca aggatgtggg atcaggactg gcctcccatt tagccatgct 240

gatctgtgtc ccaaccctca acctagttcc acttccagat ctgcctgtcc tcagctcacc 300

tttctacct 309

<210> 18

<211> 505

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggctggaccg actggaacct tgccctgaac cccgaaggag gacccaattg ggtgcgtaac 60

tttgtcgaca gtcccatcat tgtagacatc accaaggaca cgttttacaa acagcccatg 120

ttctaccacc ttggccactt caggtgagtg gagggcgggc acccccattc cataccaggc 180

ctatcatctc ctacatcgga gctccaggcc tagagagcca gggcagagcc tctgcaggag 240

ttatggggtg ggtccgtggg tgggtgactt cttagatgag ggtttcatgg gaggtacccc 300

gagggactct gaccatctgt tcccacattc agcaagttca ttcctgaggg ctcccagaga 360

gtggggctgg ttgccagtca gaagaacgac ctggacgcag tggcactgat gcatcccgat 420

ggctctgctg ttgtggtcgt gctaaaccgg tgagggcaat ggtgaggtct gggaagtggg 480

ctgaagacag cgttgggggc cttgg 505

<210> 19

<211> 309

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cctttgtctc tagatacccc tgattcaccg agccctgcag ttggcccagc gtcccgtttc 60

actccttgcc agcccctgga catcacccac ttggctcaag accagtggag cggtgaatgg 120

gaaggggtca ctcaagggac agcccggaga catctaccac cagacctggg ccagatacat 180

tgtgaagtaa gggatcagca aggatgtggg atcaggactg gcctcccatt tagccatgct 240

gatctgtgtc ccaaccctca acctagttcc acttccagat ctgcctgtcc tcagctcacc 300

tttctacct 309

<210> 20

<211> 505

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ggctggaccg actggaacct tgccctgaac cccgaaggag gacccaattg ggtgcgtaac 60

tttgtcgaca gtcccatcat tgtagacatc accaagcaca cgttttacaa acagcccatg 120

ttctaccacc ttggccactt caggtgagtg gagggcgggc acccccattc cataccaggc 180

ctatcatctc ctacatcgga gctccaggcc tagagagcca gggcagagcc tctgcaggag 240

ttatggggtg ggtccgtggg tgggtgactt cttagatgag ggtttcatgg gaggtacccc 300

gagggactct gaccatctgt tcccacattc agcaagttca ttcctgaggg ctcccagaga 360

gtggggctgg ttgccagtca gaagaacgac ccggacgcag tggcactgat gcatcccgat 420

ggctctgctg ttgtggtcgt gctaaaccgg tgagggcaat ggtgaggtct gggaagtggg 480

ctgaagacag cgttgggggc cttgg 505