專利名稱：抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人常見腫瘤的治療技術(shù)，尤其涉及到一種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)和人表皮生長因子受體(humanepidermal growth factor receptor-2, HER2)特異性復(fù)合IgY及其偶聯(lián)物、制備方法和多聯(lián)試劑盒。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一。癌癥與心腦血管疾病和意外事故一起，構(gòu)成當(dāng)今世界所有國家三大死亡原因。目前全國癌癥 死亡已位居各類死因的第一位，每死亡5人，即有I人死于癌癥。我國農(nóng)村地區(qū)癌癥死亡率上升速度明顯高于城市，癌癥高發(fā)區(qū)也多分布在農(nóng)村和西部地區(qū)。癌癥已經(jīng)成為我國農(nóng)民因病致貧、因病返貧的重要原因。因此，世界衛(wèi)生組織(WHO)和各國政府衛(wèi)生部門都把攻克癌癥列為一項(xiàng)首要任務(wù)。目前世界各國對癌癥主要采用手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、激素治療、基因治療和免疫治療等方法進(jìn)行治療；其中手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療已成為主要手段。手術(shù)治療是癌癥治療中最古老的方法，但不能解決復(fù)發(fā)問題；放射治療、化學(xué)治療不但毒副作用相當(dāng)大，而且也同樣存在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散和復(fù)發(fā)的難題。眾所周知，大多數(shù)癌病患者都是死于癌癥的復(fù)發(fā)。因此，研發(fā)一種更加安全有效的治療癌癥的新方法，成為全人類的迫切需求，也是擺在全球醫(yī)藥科學(xué)界的重大課題。長期以來普遍認(rèn)為惡性腫瘤是由破壞細(xì)胞正常生長調(diào)節(jié)的多種基因突變引起的，但隨著對惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)端粒酶的被激活才是惡性腫瘤發(fā)生的先決條件?？茖W(xué)家Harley率先在1991年提出癌癥的“端粒-端粒酶假說”，指出正常細(xì)胞由于端粒的不斷縮短必定誘發(fā)細(xì)胞凋亡；而癌細(xì)胞復(fù)活了已經(jīng)休眠的端粒酶基因，因而獲得永生而無限增殖。90年代，陸續(xù)在人類80-90%的癌癥中發(fā)現(xiàn)了絕大部分正常細(xì)胞不具有的端粒酶。美國加利福尼亞舊金山大學(xué)的伊麗莎白-布萊克本(Elizabeth Blackburn)、美國巴爾的摩約翰-霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的卡羅爾-格雷德(Carol Greider)和美國哈佛醫(yī)學(xué)院的杰克-紹斯塔克(Jack Szostak)等三位美國科學(xué)家憑借“發(fā)現(xiàn)端粒和端粒酶是如何保護(hù)染色體的”這一成果，揭開了人類罹患癌癥等嚴(yán)重疾病的奧秘。他們破解了在大多數(shù)癌癥生長過程中起著關(guān)鍵作用的端粒酶的秘密，這為研發(fā)新型抗癌藥物開辟了新途徑，是基礎(chǔ)癌癥生物學(xué)的一大突破。他們的研究成果得到國際醫(yī)學(xué)界的高度評價(jià)和重視，獲得了2009年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。
大量研究證明，“端粒酶”在幾乎所有人類癌癥腫瘤中均具活性，而在絕大部分正常細(xì)胞中則不具活性；也就是說，端粒酶的激活是許多惡性腫瘤發(fā)生的先決條件。這一發(fā)現(xiàn)提示醫(yī)學(xué)科學(xué)家，只要能有效抑制端粒酶，就能對抗所有癌癥，且較少副作用。為了彌補(bǔ)目前普遍使用的化療和放療不僅作用于癌細(xì)胞也作用于正常細(xì)胞而副作用十分嚴(yán)重的缺陷；國際醫(yī)藥界根據(jù)“端粒酶”的理論，設(shè)計(jì)合成了一系列“端粒酶抑制齊Γ用于治療腫瘤。這種“端粒酶抑制劑”通常只作用于癌細(xì)胞而不會影響正常細(xì)胞，因此，副作用比化療和放療少得多。不過，雖然“端粒酶抑制劑”在嚴(yán)重副作用方面比普通化療藥有了很大改進(jìn)；但是，“端粒酶抑制劑”也存在使生殖細(xì)胞和造血干細(xì)胞的端粒酶活性也遭到抑制的副作用。另外，“端粒酶抑制劑”在抑制端粒酶活性的同時(shí)，會激活非端粒酶依賴途徑，從而使“端粒酶抑制劑”本身失去活性；因此，“端粒酶抑制劑”同其他抗腫瘤藥物一樣也有耐藥性的問題。這些都直接影響了這種新藥的應(yīng)用前景。鑒于目前的客觀現(xiàn)狀，完全有必要研發(fā)一種更好的方法，突破現(xiàn)有的化療方法存 在的副作用和耐藥性兩大瓶頸；并解決癌癥預(yù)防和阻止復(fù)發(fā)的兩大難題。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有癌癥治療技術(shù)中存在的副作用和耐藥性嚴(yán)重以及無法阻止復(fù)發(fā)，也不能預(yù)防癌癥的問題，本發(fā)明要提供一種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和人表皮生長因子受體(HER2)特異性復(fù)合IgY，一種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性IgY，一種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、人表皮生長因子受體及人腫瘤抗原特異性復(fù)合IgY，一種抗端粒酶RNA (hTR)特異性IgY，一種抗人表皮生長因子受體(HER2)特異性IgY，抗人腫瘤復(fù)合全抗原特異性IgY和多種抗人腫瘤抗原特異性IgY，以及這些特異性IgY偶聯(lián)物和制備方法以及相關(guān)的IgY多聯(lián)試劑盒。本發(fā)明提供了一種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY的制備方法，包括以下步驟(Al)基因重組端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、人表皮生長因子受體蛋白和/或端粒酶RNA并純化；和/或培養(yǎng)人體組織腫瘤傳代細(xì)胞并制備人體組織癌細(xì)胞蛋白；(A2)選取所述端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、人表皮生長因子受體蛋白、端粒酶RNA和/或人體組織癌細(xì)胞蛋白中的至少一種，作為抗原成分，并將所述抗原成分按(1-10) : (10-1)比例加入福氏佐劑，再高速勻化處理形成油包水乳液，制得抗原；(A3)采用淘汰法篩選具有高免疫應(yīng)答能力的選擇產(chǎn)蛋禽類，用以上抗原液免疫所選擇的高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋禽類，再揀取被選出之產(chǎn)蛋禽類所產(chǎn)的免疫蛋；(A4)對所述免疫蛋進(jìn)行消毒，取蛋黃，制備特異性IgY粗提物；(A5)將所述IgY粗提物通過離子交換柱和凝膠交換柱進(jìn)行純化，得特異性IgY純
品O在本發(fā)明所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY的制備方法中，所述步驟(Al)中所述的人體組織癌細(xì)胞為人胃癌細(xì)胞、人口腔癌細(xì)胞、人食道癌細(xì)胞、人鼻咽癌細(xì)胞、人肺癌細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞、人大腸癌細(xì)胞、人直腸癌細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞以及淋巴癌細(xì)胞中的單一人體組織癌細(xì)胞或多種復(fù)合的人體組織癌細(xì)胞。在本發(fā)明所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY的制備方法中，所述步驟(A2)中選取端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶作為抗原成分，所述步驟(A5)中制備的特異性IgY為抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶特異性IgY。在本發(fā)明所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY的制備方法中，所述制備步驟(A2)中選取人表皮生長因子受體作為抗原成分，所述步驟(A5)中制備的特異性IgY為抗人表皮生長因子受體特異性IgY。在本發(fā)明所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY的制備方法中，所述制備步驟(A2)中選取端粒酶RNA作為抗原成分，所述步驟(A5)中制備的特異性IgY為抗端粒酶RNA特異性IgY。在本發(fā)明所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY 的制備方法中，所述制備步驟(A2)中選取端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體按(1-10) (10-1)混合均勻作為抗原成分，所述步驟(A5)中制備的特異性IgY為抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY。在本發(fā)明所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY的制備方法中，所述步驟(A2)中選取端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、人表皮生長因子受體、以及所述人體組織癌細(xì)胞蛋白混合均勻作為抗原成分，所述步驟(A5)中制備的特異性IgY為抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、人表皮生長因子受體及人腫瘤抗原特異性復(fù)合IgY。在本發(fā)明所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY的制備方法中，所述人體組織癌細(xì)胞蛋白為單一人體組織癌細(xì)胞，則所述步驟(A2)中選取端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、人表皮生長因子受體、以及所述單一人體組織癌細(xì)胞蛋白按(10-1) (10-1) (1-10)的比例混合均勻作為抗原成分；或所述人體組織癌細(xì)胞蛋白為按均一比例混合而成的復(fù)合人體組織癌細(xì)胞，則所述步驟(A2)中選取端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體按(1-10) (10-1)混合后，與所述復(fù)合人體組織癌細(xì)胞蛋白按(1-10) (10-1)的比例混合均勻作為抗原成分。在本發(fā)明所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY的制備方法中，所述步驟(A2)中選取任意一種人體組織癌細(xì)胞蛋白作為抗原成分，所述步驟(A5)中制備的特異性IgY為多種抗人腫瘤抗原特異性IgY。在本發(fā)明所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY的制備方法中，所述步驟(A2)中選取人體組織癌細(xì)胞蛋白中的至少二種混合均勻作為抗原成分，所述步驟(A5)中制備的特異性IgY為抗人腫瘤復(fù)合全抗原特異性IgY。本發(fā)明還提供了一種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY，采用如上所述的方法制得。本發(fā)明還提供了一種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY偶聯(lián)物，將如上所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY與細(xì)胞穿透載體或化療藥偶聯(lián)制得。本發(fā)明還提供了一種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY組合制劑，采用如上所述的方法制得的特異性IgY加入各種輔料制成的組合制劑，包括噴霧劑(口噴劑、鼻噴劑等)、霧化劑、膠囊(軟膠囊、硬膠囊)、口含片、咀嚼片、口服片、栓劑、泡騰片、乳膏或針劑。本發(fā)明還提供了一種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY偶聯(lián)物組合制劑，其特征在于，采用如上所述抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY與細(xì)胞穿透載體或化療藥偶聯(lián)制得的特異性復(fù)合IgY偶聯(lián)物加入各種輔料制成的組合制劑，包括噴霧劑(口噴劑、鼻噴劑等)、霧化劑、膠囊(軟膠囊、硬膠囊)、口含片、咀嚼片、口服片、栓劑、泡騰片、乳膏或針劑。本發(fā)明還提供了一種特異性復(fù)合IgY多聯(lián)試劑盒，包括如上所制得的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶特異性IgY和如上所制得的抗人表皮生長因子受體特異性IgY以及由如上所制得的抗人腫瘤復(fù)合全抗原特異性IgY共三種抗體組合制成的一種三聯(lián)檢測試劑盒，以及由如上所制得的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶特異性IgY和由如上所制得的抗人表皮生長因子受體特異性IgY以及由如上所制得的多種抗人腫瘤抗原特異性IgY中任意一種IgY共三種抗體組合制成的至少2種三聯(lián)檢測試劑盒。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。一、制備過程具體描述下面對本發(fā)明提供的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和人表皮生長因子受體(HER2)特異性復(fù)合IgY的制備方法進(jìn)行具體描述，包括以下步驟(SI)向美國sigma公司購買端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)，產(chǎn)品編號CB8946041)，向北京義翹神州生物技術(shù)有限公司購買人表皮生長因子受體HER-2/neu編碼產(chǎn)物pl85ertB2蛋白(產(chǎn)品編碼10004-H02H)，向美國sigma公司購買端粒酶RNA (hTR)，產(chǎn)品編號T9285 ;分別作為腫瘤代表抗原。(S2)基因重組端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和人表皮生長因子受體HER-2/neu編碼產(chǎn)物pl85eAB2蛋白以及端粒酶RNA (hTR)并純化；(I) hTERT基因片段的克隆和表達(dá)首先用RT-PCR方法克隆hTERTcDNA的一個(gè)片段，然后將其連接到GST融合表達(dá)載體PGEX-5X-3 ;測序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達(dá)載體PPIC9K連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取陽性克隆，提質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，電轉(zhuǎn)化畢氏酵母菌(Pichia past0ris)KM71和GS115。在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉(zhuǎn)化株。挑取單個(gè)菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過夜。稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)菌濃度達(dá)到0D600的吸光值約為O. 8時(shí)，將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。于培養(yǎng)的不同時(shí)間采樣，用ELISA法測定上清中HA的表達(dá)量。選表達(dá)量最高的時(shí)間收獲。離心去除細(xì)胞沉淀。上清中即含大量表達(dá)產(chǎn)物。經(jīng)50%硫酸銨沉淀,截留分子量IOkd的透析袋用蒸鍛水透析24小時(shí)，以及SephacrylS-200和S印hacrylS-100柱層析后，即獲得純化的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT融合蛋白抗原成份。(2)pl85erbB2蛋白的克隆和表達(dá)
首先將P185ertB2蛋白連接到GST融合表達(dá)載體pGEX_5X_3 ;測序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達(dá)載體PPIC9K連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取陽性克隆，提質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，電轉(zhuǎn)化畢氏酵母菌(Pichia past0ris)KM71和GS115。在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉(zhuǎn)化株。挑取單個(gè)菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過夜。稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)菌濃度達(dá)到0D600的吸光值約為O. 8時(shí),將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。于培養(yǎng)的不同時(shí)間米樣，用ELISA法測定上清中HA的表達(dá)量。選表達(dá)量最高的時(shí)間收獲。離心去除細(xì)胞沉淀。上清中即含大量表達(dá)產(chǎn)物。經(jīng)50%硫酸銨沉淀，截留分子量IOkd的透析袋用蒸鎦水透析24小時(shí)，以及Sephacryl S-200和SephacrylS-IOO柱層析后，即獲得純化的pl85 bB2蛋白抗原成份。(3)端粒酶RNA (hTR)蛋白的克隆和表達(dá)首先用RT-PCR方法克隆端粒酶RNA (hTR) cDNA的一個(gè)片段，然后將其連接到GST融合表達(dá)載體PGEX-5X-3 ;測序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和 Not I雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達(dá)載體PPIC9K連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取陽性克隆，提質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，電轉(zhuǎn)化畢氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉(zhuǎn)化株。挑取單個(gè)菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過夜。稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)菌濃度達(dá)到0D600的吸光值約為O. 8時(shí)，將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。于培養(yǎng)的不同時(shí)間采樣，用ELISA法測定上清中HA的表達(dá)量。選表達(dá)量最高的時(shí)間收獲。離心去除細(xì)胞沉淀。上清中即含大量表達(dá)產(chǎn)物。經(jīng)50%硫酸銨沉淀，截留分子量IOkd的透析袋用蒸鍛水透析24小時(shí)，以及Sephacryl S-200和SephacrylS-100柱層析后，即獲得純化的端粒酶RNA(hTR)融合蛋白抗原成份。(S3)向ATCC(美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心)購買以下12種腫瘤傳代培養(yǎng)細(xì)胞(I)人胃癌細(xì)胞MGC-803，⑵人口腔癌細(xì)胞CY20294，(3)人食道癌細(xì)胞Eca-109, (4)人鼻咽癌細(xì)胞bs_1065R，(5)人肺癌細(xì)胞A-549CCL-185，(6)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29HTB-38 , (7)人大腸癌細(xì)胞HCT-8，(8)人直腸癌細(xì)胞HCT-116，(9)人宮頸癌細(xì)胞HeLaCCL-2，(10)皮膚癌細(xì)胞A431，(11)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435S，(12)淋巴癌細(xì)胞U-937。(S4)培養(yǎng)腫瘤傳代細(xì)胞并制備癌細(xì)胞蛋白(I)細(xì)胞培養(yǎng)分別將以上12種腫瘤傳代細(xì)胞培養(yǎng)于含10% (體積分?jǐn)?shù))小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5% (體積分?jǐn)?shù))CO2,培養(yǎng)溫度為37°C。(2)胞漿蛋白的提取收集6X108 8X108細(xì)胞，以O(shè). lmol. L-1PBS洗兩遍，以三去污緩沖液裂解法于冰浴中30min裂解細(xì)胞、釋放胞漿蛋白，15000Xg、于4°C離心30min，取上清，測蛋白濃度。(3)按常規(guī)方法將所制備的12種癌細(xì)胞蛋白分別進(jìn)行純化。(S5)分別制作8類抗原(I)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT抗原將端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT按(1-10) (10_1)比例加入福氏佐劑，再高速勻化處理形成油包水乳液，即制得端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT抗原；
(2)HER-2/neu 編碼產(chǎn)物 pl85eAB2 蛋白抗原將HER-2/neu編碼產(chǎn)物pl85eAB2蛋白按(1-10) (10_1)比例加入福氏佐劑，再高速勻化處理形成油包水乳液，即制得HER-2/neu編碼產(chǎn)物pl85ertB2蛋白抗原；(3)端粒酶 RNA (hTR)抗原將端粒酶RNA(hTR)按(1-10) (10_1)比例加入福氏佐劑，再高速勻化處理形成油包水乳液，即制得端粒酶RNA (hTR)抗原；(4)中瘤標(biāo)志物復(fù)合抗原將端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT和HER-2/neu編碼產(chǎn)物pl85ertB2蛋白按(1-10) (10-1)比例混合均勻，得到抗原混合液；再將這種抗原混合液按(1-10) : (10-1)比例加入福氏佐 齊U，再高速勻化處理形成油包水乳液，即制得端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT和HER-2/neu編碼產(chǎn)物pl85erbB2蛋白腫瘤標(biāo)志物復(fù)合抗原；(5) 12種人腫瘤復(fù)合抗原將端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT和HER-2/neu編碼產(chǎn)物pl85ertB2蛋白按(1-10) (10-1)比例混合均勻，得到腫瘤標(biāo)志物抗原混合液；再將這種腫瘤標(biāo)志物抗原混合液按(10-1) (1-10)比例(或其他任意比例，如優(yōu)選3 I)分別與上述12種人體組織癌細(xì)胞蛋白中的其中一種混和，充分?jǐn)嚢杈鶆?，得?2種人腫瘤抗原成份；再將這12種人腫瘤抗原成份中的任意一種按(1-10) (10-1)比例加入福氏佐劑，高速勻化處理形成油包水乳液，即制得12種人腫瘤復(fù)合抗原；實(shí)際應(yīng)用中，也可僅將端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT或者僅將HER-2分別與上述12種人體組織癌細(xì)胞蛋白中的其中一種混和，充分?jǐn)嚢杈鶆?，得?2種人腫瘤抗原成份；再將這12種人腫瘤抗原成份中的任意一種按(1-10) (10-1)比例加入福氏佐劑，高速勻化處理形成油包水乳液，即制得12種人腫瘤復(fù)合抗原；(6) 12種人腫瘤抗原將上述12種人體組織癌細(xì)胞蛋白中的其中一種按(1-10) (10-1)比例加入福氏佐劑，高速勻化處理形成油包水乳液，即制得12種人腫瘤抗原；(7)人腫瘤復(fù)合全抗原先將上述12種人體組織癌細(xì)胞蛋白按均一比例(每種均占總量的1/12)混和，充分?jǐn)嚢杈鶆颍玫饺四[瘤復(fù)合全抗原成份；再將端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT和HER-2/neu編碼產(chǎn)物pl85OTbB2蛋白按(1-10) (10-1)比例混合均勻，得到腫瘤標(biāo)志物抗原混合液；最后將12種人體組織癌細(xì)胞蛋白均勻混合得到的人腫瘤復(fù)合全抗原成份按(1-10) (10-1)比例與腫瘤標(biāo)志物抗原混合液混合得到人腫瘤蛋白復(fù)合全抗原成份，再將這種人腫瘤蛋白復(fù)合全抗原成份按(1-10) (10-1)比例加入福氏佐劑，高速勻化處理形成油包水乳液，即制得人腫瘤復(fù)合全抗原；(8)人腫瘤全抗原先將上述12種人體組織癌細(xì)胞蛋白按均一比例(每種均占總量的1/12)混和，充分?jǐn)嚢杈鶆颍玫饺四[瘤全抗原成份；得到的人腫瘤全抗原成份按(1-10) : (10-1)比例加入福氏佐劑，高速勻化處理形成油包水乳液，即制得人腫瘤全抗原。(S6)采用淘汰法篩選具有高免疫應(yīng)答能力的選擇產(chǎn)蛋禽類(雞、鴨、鵝、火雞、鴕鳥等)，分別用以上8類抗原免疫所選擇的高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋禽類，每只禽類在皮下注射所制備的8類抗原中之一種抗原O. 5-lml ;在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、方法注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天開始揀取高免疫蛋，對所檢取的免疫蛋進(jìn)行編碼標(biāo)記。(S7)對所述8類免疫蛋分別用O. I %新潔而滅溶液或O. I % KMn04溶液或其它同類消毒液將免疫蛋浸泡消毒，無菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4-8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用I. ON NaOH液或者I. ON HCL液調(diào)節(jié)PH至5. 5-6. 0，4-6°C下靜置過夜，稀釋液6，000-12, 000r/min高速離心20分鐘，取上清液用17萬分子量至20萬分子量截留超濾濃縮10-20倍。然后，采用美國Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒過濾系統(tǒng)的細(xì)菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細(xì)菌病毒，確保所制備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌。第一道細(xì)菌濾除裝置是用0. 22 μ m膜除菌過濾器除去沙門菌(Salmonella)等細(xì)菌；第二道支原體濾除裝置是用0. Iym膜除支原體過濾器除去支原體；第三道病毒濾除裝置是用Ultipor VFTM DV50除病毒過濾器除去包括禽流感病毒、腸病毒在內(nèi)的多種病毒。 最后，將所得濃縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得8類特異性IgY粗提物。(S8)將所述8類特異性IgY粗提物分別過離子交換柱和凝膠交換柱進(jìn)行純化，即得相應(yīng)的8類特異性IgY特異性純IgY ;分別是I.抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性IgY ；2.抗端粒酶RNA (hTR)特異性IgY ；3.抗 HER2 特異性 IgY ；4.抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY ；5.抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及12種人腫瘤細(xì)胞特異性復(fù)合IgY，分別是(I)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及胃癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY ；(2)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及口腔癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY ；(3)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及食道癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY ；(4)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及鼻咽癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY ；(5)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及肺癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY ；(6)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及結(jié)腸癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY ；(7)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及大腸癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY ；(8)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及直腸癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY ；(9)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及子宮頸癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY ；(10)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及皮膚癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY ；(11)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及乳腺癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY ；(12)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及淋巴癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY。以上12種特異性復(fù)合IgY也可以是抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和12種人腫瘤細(xì)胞特異性復(fù)合IgY，也可以是抗HER2和12種人腫瘤細(xì)胞特異性復(fù)合IgY。6. 12種抗人腫瘤細(xì)胞特異性IgY，分別是(I)抗胃癌細(xì)胞特異性IgY ；
(2)抗口腔癌細(xì)胞特異性IgY ；(3)抗食道癌細(xì)胞特異性IgY ；(4)抗鼻咽癌細(xì)胞特異性IgY ；(5)抗肺癌細(xì)胞特異性IgY ；(6)抗結(jié)腸癌細(xì)胞特異性IgY ；(7)抗大腸癌細(xì)胞特異性IgY ；(8)抗直腸癌細(xì)胞特異性IgY ；(9)抗子宮頸癌細(xì)胞特異性IgY ；
(10)抗皮膚癌細(xì)胞特異性IgY ；(11)抗乳腺癌細(xì)胞特異性IgY ；(12)抗淋巴癌細(xì)胞特異性IgY。7.抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及人腫瘤全抗原特異性復(fù)合IgY ；8.抗人腫瘤全抗原特異性復(fù)合IgY ；(S9)分別將上述第5類抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及12種人腫瘤細(xì)胞特異性復(fù)合純IgY (以下簡稱抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合純IgY)之其中一種與多聚精氨酸蛋白(細(xì)胞穿透載體)偶聯(lián)，得到12種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合純IgY與多聚精氨酸蛋白偶聯(lián)物。具體步驟如下(I)將20-200mg多聚精氨酸蛋白、5-100mgN-羥基丁二酰亞胺和20_200mg碳化二亞胺加到1-10毫升超純水中，在冰浴中攪拌10-50分鐘；(2)上述溶液中邊攪拌邊逐漸加入含IO-IOOmg第6類12種中任意一種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合純IgY的超純水1_10毫升，加畢在4_30°C攪拌反應(yīng)3-20小時(shí)，合成多聚精氨酸蛋白-IgY偶聯(lián)物；(3)多聚精氨酸蛋白-IgY偶聯(lián)物放入透析袋中，用O. 01MpH7. 2的磷酸鹽緩沖液在4°C透析1-3天；(4)透析后的多聚精氨酸蛋白-IgY偶聯(lián)物進(jìn)行紫外掃描，分析鑒定偶聯(lián)產(chǎn)物及濃度測定，得到抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合純IgY與多聚精氨酸蛋白偶聯(lián)物成品。本發(fā)明以其中一種細(xì)胞穿透載體(多聚精氨酸蛋白)為例說明，實(shí)際應(yīng)用包括各種細(xì)胞穿透載體，可得到偶聯(lián)不同細(xì)胞穿透載體且針對12種不同腫瘤的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合純IgY偶聯(lián)物成品。分別是(I)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及胃癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與細(xì)胞穿透載體偶聯(lián)物；(2)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及口腔癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與細(xì)胞穿透載體偶聯(lián)物；(3)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及食道癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與細(xì)胞穿透載體偶聯(lián)物；(4)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及鼻咽癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與細(xì)胞穿透載體偶聯(lián)物；(5)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及肺癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與細(xì)胞穿透載體偶聯(lián)物；(6)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及結(jié)腸癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與細(xì)胞穿透載體偶聯(lián)物；(7)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及大腸癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與細(xì)胞穿透載體偶聯(lián)物；(8)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及直腸癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與細(xì)胞穿透載體偶聯(lián)物； (9)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及子宮頸癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與細(xì)胞穿透載體偶聯(lián)物；(10)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及皮膚癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY和細(xì)胞穿透載體偶聯(lián)物；(11)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及乳腺癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY和細(xì)胞穿透載體偶聯(lián)物；(12)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及淋巴癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY和細(xì)胞穿透載體偶聯(lián)物。(SlO)分別將所述第5類12種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和HER2特異性復(fù)合純IgY與化療藥偶聯(lián)，這種化療藥可以是希羅達(dá)(卡培他濱，英文名Xeloda)，但不限于希羅達(dá)(卡培他濱，英文名Xeloda);偶聯(lián)后得到抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和HER2特異性復(fù)合純IgY與卡培他濱(Xeloda)偶聯(lián)物。具體步驟如下(I)將 20-200mg 卡培他濱(Xeloda)、5_100mgN-輕基丁二酰亞胺和 20-200mg 碳化二亞胺加到1-10毫升超純水中，在冰浴中攪拌10-50分鐘；(2)上述溶液中邊攪拌邊逐漸加入含IO-IOOmglO種中任意一種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和HER2特異性復(fù)合純IgY的超純水1-10毫升，加畢在4-30°C攪拌反應(yīng)3_20小時(shí)，合成卡培他濱(Xeloda)-IgY偶聯(lián)物；(3)卡培他濱(Xeloda)-IgY偶聯(lián)物放入透析袋中，用O. 01MpH7. 2的磷酸鹽緩沖液在4°C透析1-3天；(4)透析后的卡培他濱(Xeloda)-IgY偶聯(lián)物進(jìn)行紫外掃描，分析鑒定偶聯(lián)產(chǎn)物及濃度測定，得到抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和HER2特異性復(fù)合純IgY與卡培他濱(Xeloda)偶聯(lián)物成品。本發(fā)明以其中一種希羅達(dá)(卡培他濱，英文名Xeloda)為例說明，實(shí)際應(yīng)用包括各種化療藥，可得到偶聯(lián)不同化療藥且針對第5類12種不同腫瘤的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合純IgY偶聯(lián)物成品。分別是(I)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及胃癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與化療藥偶聯(lián)物；(2)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及口腔癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與化療藥偶聯(lián)物；(3)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及食道癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與化療藥偶聯(lián)物；(4)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及鼻咽癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與化療藥偶聯(lián)物；(5)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及肺癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與化療藥偶聯(lián)物；(6)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及結(jié)腸癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與化療藥偶聯(lián)物；
(7)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及大腸癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與化療藥偶聯(lián)物；(8)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及直腸癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與細(xì)胞穿透載體偶聯(lián)物；(9)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及子宮頸癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與化療藥偶聯(lián)物；(10)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2及皮膚癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與化療藥偶聯(lián)物；(11)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及乳腺癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與化療藥偶聯(lián)物；(12)抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及淋巴癌細(xì)胞特異性復(fù)合IgY與化療藥偶聯(lián)物。以上所述針對不同腫瘤細(xì)胞的12種特異性復(fù)合純IgY及其偶聯(lián)物都可以進(jìn)行脂質(zhì)體化處理，制得各種不同的脂質(zhì)體抗腫瘤特異性復(fù)合IgY和偶聯(lián)物?？梢赃M(jìn)一步提高表皮滲透性、延效性和靶向性，增加療效指數(shù)。具體實(shí)施方法如下把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再將相應(yīng)的特異性復(fù)合純IgY及其偶聯(lián)物加入4mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)配成IgY溶液；然后將含卵磷脂和膽固醇的混懸液與IgY溶液混合，超聲處理2min (每處理O. 5min,間歇.O. 5min),立即在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至呈凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而超速離心(35000r/min，30min)分離除去未包入的IgY，沉淀用水洗二次，離心，得沉淀，用lOmmol/L PBS稀釋，即制得各種脂質(zhì)體抗腫瘤特異性復(fù)合IgY和偶聯(lián)物。本發(fā)明以常見的12種腫瘤為例說明相應(yīng)的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY與抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性復(fù)合IgY以及抗端粒酶RNA (hTR)特異性復(fù)合純IgY和抗人表皮生長因子受體(HER2)特異性復(fù)合IgY的制備方法，以及這些特異性復(fù)合IgY偶聯(lián)物的制備方法。實(shí)際應(yīng)用中不限于這12種腫瘤，所述方法也適用于其他腫瘤。本發(fā)明還提供多種抗腫瘤特異性復(fù)合IgY組合制劑，其中包括前述方法制備的12種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY與不同細(xì)胞穿透載體偶聯(lián)的偶聯(lián)物或與不同化療藥的偶聯(lián)物，還包括偶聯(lián)不同細(xì)胞穿透載體或不同化療藥且針對12種不同腫瘤的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性復(fù)合純IgY偶聯(lián)物，也包括偶聯(lián)不同細(xì)胞穿透載體或與不同化療藥且針對12種不同腫瘤的抗端粒酶RNA(hTR)特異性復(fù)合純IgY偶聯(lián)物，并且包括偶聯(lián)不同細(xì)胞穿透載體或與不同化療藥且針對12種不同腫瘤的的抗人表皮生長因子受體(HER2)特異性復(fù)合純IgY偶聯(lián)物；還包括以這些不同抗腫瘤特異性IgY與細(xì)胞穿透載體或化療藥偶聯(lián)物添加各種輔料制成的噴霧劑(口噴劑、鼻噴劑等)、霧化劑、膠囊(軟膠囊、硬膠囊)、口含片、咀嚼片、口服片、栓劑、泡騰片、乳膏或針劑。二、原理分析
端粒酶的激活是大部分惡性腫瘤發(fā)生的先決條件，端粒酶也是一個(gè)較理想的抗腫瘤靶標(biāo)；而pl85OTbB2作為腫瘤抗原同樣是國際醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的腫瘤治療靶點(diǎn)，pl85OTbB2過度表達(dá)顯示腫瘤預(yù)后差，如復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥、存活期短等。本發(fā)明的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY與抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性復(fù)合IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特異性復(fù)合純IgY和抗人表皮生長因子受體(HER2)特異性復(fù)合IgY可以特異性地針對腫瘤細(xì)胞內(nèi)外的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和生長因子受體以及端粒酶RNA(hTR)等抗原發(fā)生抑制作用。一方面能抑制腫瘤部位總體的端粒酶活性水平，阻滯腫瘤生長和擴(kuò)散；一方面又可抑制pl85eAB2的過量表達(dá)，預(yù)防和治療pl85eAB2高表達(dá)的轉(zhuǎn)移性腫瘤。但是，要實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，必須突破兩大難關(guān)第一、如何不傷害正常細(xì)胞；第二、大分子的IgY如何進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)生作用。本發(fā)明特殊之處在于所制成的12種抗腫瘤復(fù)合IgY中都分別包含了針對一種常見腫瘤細(xì)胞蛋白的抗體，形成一種特殊的生物導(dǎo)向劑。每一種不同的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY或抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性復(fù)合IgY以及抗端粒酶RNA (hTR)特異性復(fù)合純IgY和抗人表皮生長因子受體(HER2)特異性復(fù)合IgY，都會自動選擇性地識別其所對應(yīng)的腫瘤細(xì)胞，象導(dǎo)彈一樣特異性地追蹤，與所對應(yīng)的腫瘤細(xì)胞結(jié)合；從而抑制腫瘤的生長，而不會影響到人的正常細(xì)胞。深入研究揭示，在正常人類生殖細(xì)胞以及造血干細(xì)胞、外周血白細(xì)胞與淋巴細(xì)胞、腸粘膜基底干細(xì)胞、胚胎體細(xì)胞、毛發(fā)、皮膚、子宮內(nèi)膜等具有再生能力的細(xì)胞中，均可檢測到不同水平的端粒酶活性，簡單地抑制端粒酶有可能對生殖、造血及免疫系統(tǒng)產(chǎn)生負(fù)面影響；這也是目前全球許多醫(yī)學(xué)科學(xué)家在積極研究開發(fā)各種“端粒酶抑制劑”所遇到的難題。本發(fā)明的一系列抗腫瘤特異性復(fù)合IgY所具有的“生物導(dǎo)向功能”有效地克服了一般“端粒酶抑制劑”潛在的副作用，僅會有的放矢地抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)的端粒酶活性，對具有再生能力的正常細(xì)胞則秋毫無犯；這也是本發(fā)明創(chuàng)新之處。本發(fā)明把抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY與抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性復(fù)合IgY以及抗端粒酶RNA (hTR)特異性復(fù)合純IgY和抗人表皮生長因子受體(HER2)特異性復(fù)合IgY分別與“細(xì)胞穿透載體”(具有良好穿透真核細(xì)胞膜功能的融合蛋白)偶聯(lián)形成偶聯(lián)物。一方面利用IgY抗體特異性識別并結(jié)合相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞株，一方面借助偶聯(lián)的“細(xì)胞穿透載體”特有的細(xì)胞穿透能力；從而，使本發(fā)明的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY與抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性復(fù)合IgY以及抗端粒酶RNA (hTR)特異性復(fù)合純IgY和抗人表皮生長因子受體(HER2)特異性復(fù)合IgY能有效穿透目標(biāo)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜而進(jìn)入胞體內(nèi)，充分發(fā)揮IgY強(qiáng)有力的抑制端粒酶活性和pl85erbB2的作用，提高實(shí)際療效。
本發(fā)明同時(shí)把12種抗腫瘤復(fù)合IgY與療效確切的化療藥偶聯(lián)成IgY和化療藥偶聯(lián)物，制成具有特異性導(dǎo)向的治療腫瘤藥物。由于這種針對腫瘤細(xì)胞的IgY抗體生物導(dǎo)向劑對細(xì)胞有選擇性識別作用，這一特征為化療藥提供了重要導(dǎo)向作用。在正常組織細(xì)胞與采用病人腫瘤組織培養(yǎng)的細(xì)胞所進(jìn)行的IgY熒光免疫測定對照試驗(yàn)表明，這種特異性導(dǎo)向的腫瘤藥物只與與癌細(xì)胞反應(yīng).與其他細(xì)胞無交叉免疫；證明這種IgY能夠識別癌細(xì)胞。以放射同位素169Yb標(biāo)記以上12種復(fù)合IgY抗體進(jìn)行動物體內(nèi)追蹤測定,結(jié)果也表明IgY主要向腫瘤組織集中，其他器官含量甚微。本發(fā)明制備的12種抗腫瘤復(fù)合IgY與療效確切的化療藥偶聯(lián)成IgY和化療藥偶聯(lián)物在實(shí)際使用中，所進(jìn)行的“癌細(xì)胞反應(yīng)超微結(jié)構(gòu)觀察”，都發(fā)現(xiàn)只有癌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被融解破壞、核膜消失、細(xì)胞核被破壞，細(xì)胞崩潰；而正常細(xì)胞則幾乎不受影響。因此，將這種具有特異性導(dǎo)向的IgY偶聯(lián)化療藥用于各種腫瘤治療，不但可大幅度減低普通化療藥的副作用，還可提升治愈率。由于IgY是一種從禽類所生蛋的卵黃中提取的天然物質(zhì)，大量毒理試驗(yàn)和致突變試驗(yàn)已證明它無任何毒副作用，也沒有任何致癌性；既使長期服用或使用也不會產(chǎn)生任何不良反應(yīng)，也不會出現(xiàn)耐藥性，而嚴(yán)重的毒副作用和癌細(xì)胞對化療藥耐藥是腫瘤治療的兩 大難題。本發(fā)明的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY與抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性復(fù)合IgY以及抗端粒酶RNA (hTR)特異性復(fù)合純IgY和抗人表皮生長因子受體(HER2)特異性復(fù)合IgY等特異性復(fù)合IgY與“細(xì)胞穿透載體”偶聯(lián)物及其各種制劑，不但可用于治療癌癥，還可用于癌癥高危人群預(yù)防癌癥；對于經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)端粒酶活性偏高或者人表皮生長因子受體(HER2)高表達(dá)的人群，可在醫(yī)生指導(dǎo)下使用相對應(yīng)的某一種IgY與“細(xì)胞穿透載體”偶聯(lián)物制劑，直至經(jīng)復(fù)查端粒酶活性或者人表皮生長因子受體(HER2)表達(dá)恢復(fù)正常為止。另外，本發(fā)明的脂質(zhì)體抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY與抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性復(fù)合IgY以及抗端粒酶RNA (hTR)特異性復(fù)合純IgY和抗人表皮生長因子受體(HER2)特異性復(fù)合IgY等特異性復(fù)合IgY與“細(xì)胞穿透載體”偶聯(lián)物及其各種制劑，也可供腫瘤患者在手術(shù)后或化療后長期使用或服用，有效防止腫瘤復(fù)發(fā)，延長存活時(shí)間。這是目前的治癌藥物所做不到的。在實(shí)際應(yīng)用上，可以采用以本發(fā)明的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和HER2特異性復(fù)合IgY與抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性復(fù)合IgY以及抗端粒酶RNA (hTR)特異性復(fù)合純IgY和抗人表皮生長因子受體(HER2)特異性復(fù)合IgY與各種“細(xì)胞穿透載體”偶聯(lián)物或化療藥偶聯(lián)物制成的膠囊、口含片、咀嚼片、口服片通過口服方法預(yù)防和治療消化系統(tǒng)(包括食道和胃以及結(jié)腸、小腸、大腸和直腸等)的腫瘤，如果把抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體化，還可有效防止胃腸道各種消化酶破壞其生物活性，進(jìn)一步提高療效；用以本發(fā)明的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY與抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性復(fù)合IgY以及抗端粒酶RNA (hTR)特異性復(fù)合純IgY和抗人表皮生長因子受體(HER2)特異性復(fù)合IgY與各種“細(xì)胞穿透載體”偶聯(lián)物或化療藥偶聯(lián)物制成的口噴齊U、口含片、咀嚼片預(yù)防和治療口腔部位的癌癥(包括舌癌)；用以本發(fā)明的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY與抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性復(fù)合IgY以及抗端粒酶RNA (hTR)特異性復(fù)合純IgY和抗人表皮生長因子受體(HER2)特異性復(fù)合IgY與各種“細(xì)胞穿透載體”偶聯(lián)物或化療藥偶聯(lián)物制成的鼻噴劑、口噴劑預(yù)防和治療鼻咽部位的癌癥；用以本發(fā)明的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY與抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性復(fù)合IgY以及抗端粒酶RNA (hTR)特異性復(fù)合純IgY和抗人表皮生長因子受體(HER2)特異性復(fù)合IgY與各種“細(xì)胞穿透載體”偶聯(lián)物或化療藥偶聯(lián)物制成的軟膠囊、栓劑、泡騰片、乳膏、陰道灌洗液預(yù)防和治療子宮頸癌等；用以本發(fā)明的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY與抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性復(fù)合IgY以及抗端粒酶RNA (hTR)特異性復(fù)合純IgY和抗人表皮生長因子受體(HER2)特異性復(fù)合IgY與各種“細(xì)胞穿透載體”偶聯(lián)物或化療藥偶聯(lián)物制成的噴霧劑、霧化劑預(yù)防和治療肺癌等呼吸道癌癥；用以本發(fā)明的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY與抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性復(fù)合IgY以及抗端粒酶RNA (hTR)特異性復(fù)合純IgY和抗人表皮生長因子受體(HER2)特異性復(fù)合IgY與各種細(xì)胞穿透載體”偶聯(lián)物或化療藥偶聯(lián)物制成的噴霧劑、乳膏、潤膚膏預(yù)防和治療皮膚基底細(xì)胞癌、非轉(zhuǎn)移性皮膚鱗癌及皮膚黑素瘤；用以本發(fā)明的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY與抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性復(fù)合IgY以及抗端粒酶RNA (hTR)特異性復(fù)合純IgY和抗人表皮生長因子受體(HER2)特異性復(fù)合IgY與各種細(xì)胞穿透載體”偶聯(lián)物或化療藥偶聯(lián)物制成的注射劑治療乳腺癌和淋巴 寺。本發(fā)明還提供采用抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性IgY和抗HER2特異性IgY以及抗人腫瘤全抗原特異性復(fù)合IgY制成的多聯(lián)檢測試劑盒，同時(shí)也提供采用由抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性IgY和抗HER2特異性IgY以及12種抗人腫瘤細(xì)胞特異性IgY共三種特異性IgY制成的12種不同的腫瘤多聯(lián)檢測試劑盒。這兩類多聯(lián)檢測試劑盒都可用于腫瘤預(yù)測和預(yù)后判斷以及腫瘤治療的療效監(jiān)測。任何一種臨床標(biāo)本，除病理性組織外，脫落細(xì)胞和細(xì)胞針吸出物、滲出液、胸腹水、胰、膽管、乳房吸出物、口腔、結(jié)腸、肺、宮頸沖洗物或刷取物等都可作為檢測樣本?？苟肆Ｃ改孓D(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性IgY和抗HER2特異性IgY以及人腫瘤全抗原特異性復(fù)合IgY制成的多聯(lián)檢測試劑盒可用于腫瘤預(yù)測和體檢篩查；采用抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性IgY和抗HER2特異性IgY以及12種抗人腫瘤細(xì)胞特異性IgY制成的12種腫瘤多聯(lián)檢測試劑盒不但可檢測出端粒酶活性和HER2的過量表達(dá),還可初步判斷腫瘤發(fā)生的大致部位。大量試驗(yàn)證明以端粒酶為標(biāo)志物檢測癌癥，其敏感性顯著高于細(xì)胞學(xué)檢查；與其他腫瘤標(biāo)記物相比，用端粒酶活性檢測進(jìn)行惡性腫瘤診斷有以下優(yōu)點(diǎn)(I)端粒酶是通過維持端粒長度使細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞，因此，端粒酶活性與惡性腫瘤的關(guān)系比其他腫瘤標(biāo)志物更直接；(2)端粒酶活性廣泛存在于惡性腫瘤細(xì)胞，而通常良性腫瘤和正常體細(xì)胞中無活性，因此用端粒酶活性診斷惡性腫瘤具有高度特異性；(3)端粒酶活性檢測的靈敏度高，檢測所需標(biāo)本少，只要測定體系中含有3個(gè)惡性腫瘤細(xì)胞，即可用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增方法檢測端粒酶的活性。顯示高水平的端粒酶活性與預(yù)后不良相關(guān)；因此，本發(fā)明為癌癥的早期診斷和預(yù)后判斷、隨訪以及療效監(jiān)測提供了一種嶄新的方法。但是，實(shí)際使用中，也暴露了一些問題，主要是僅僅依靠“端粒酶活性”來診斷，容易出現(xiàn)假陽性；因而，影響了檢測的準(zhǔn)確性和可信度。本發(fā)明的從多方面入手彌補(bǔ)了這一缺陷。由于IgY不會活化哺乳動物的補(bǔ)體系統(tǒng)，不與血清中存在的類風(fēng)濕因子(RF)和哺乳動物的Fe受體起反應(yīng)，不與蛋白質(zhì)A和G起反應(yīng)；因此，采用本發(fā)明制備的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY制成的腫瘤檢測試劑盒，特異性較強(qiáng)，可避免免疫測定中的常出現(xiàn)的干擾，減少免疫檢測假陽性反應(yīng)的發(fā)生。正因?yàn)镮gY具有這些特點(diǎn)，所以，本發(fā)明的這種腫瘤檢測試劑盒明顯優(yōu)于目前廣泛使用的采用單抗或哺乳動物IgG制成各種腫瘤檢測試劑盒，是一種“實(shí)時(shí)定量高靈敏度”的試劑盒。特別是，本發(fā)明的用抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY制成的多種腫瘤多聯(lián)檢測試劑盒除了含有國際醫(yī)學(xué)畀公認(rèn)的腫瘤標(biāo)志物-端粒酶和原癌基因人類表皮生長因子受體2(humanepidermal growth factor receptor-2, HER2)外，還包含了 12種常見人腫瘤細(xì)胞蛋白的抗體，它除了可檢測出端粒酶陽性和HER2高表達(dá)外，還對相對應(yīng)的腫瘤蛋白進(jìn)行顯示。在用于腫瘤早期診斷時(shí)，除了可預(yù)測腫瘤的發(fā)生或提示腫瘤預(yù)后，還可診斷腫瘤發(fā)生的具體部位。這就為醫(yī)生進(jìn)一步檢查的準(zhǔn)確取樣和制訂更有針對性的預(yù)防和治療方案提供了可靠的依據(jù)；這是目前廣泛使用的腫瘤檢測試劑盒尚做不到的。國際醫(yī)藥界治療癌癥的眾多案例證明，只有早期診斷和早期治療才能更多地挽救癌癥患者的生命，也才有可能大幅度提聞癌癥治愈率。評判基準(zhǔn)是只有當(dāng)_■種或二種指標(biāo)都顯示陽性才可初判為腫瘤預(yù)后不良或已成癌癥或隱形癌癥或疑似癌癥。這就可大幅度 提高檢測的特異性和準(zhǔn)確性，排除假陽性，特別是可以避免由于僅僅依靠“端粒酶活性”單項(xiàng)檢測而可能出現(xiàn)的誤判；從而，為較準(zhǔn)確的預(yù)警癌癥并及早干預(yù)和早期治療創(chuàng)造了條件。這是本發(fā)明與眾不同的特點(diǎn)和獨(dú)創(chuàng)性，也是本發(fā)明所具備的先進(jìn)性和實(shí)用性。采用這種三聯(lián)結(jié)合的多聯(lián)檢測試劑盒檢測癌癥時(shí)，腫瘤預(yù)測和體檢篩查一般采用抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2以及人腫瘤全抗原特異性復(fù)合IgY制成的多聯(lián)檢測試劑盒;進(jìn)一步復(fù)查和預(yù)后判斷以及腫瘤治療的療效監(jiān)測則應(yīng)采用抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性IgY和抗HER2特異性IgY以及12種抗人腫瘤細(xì)胞特異性IgY制成的12種腫瘤多聯(lián)檢測試劑盒中一種多聯(lián)檢測試劑盒，應(yīng)用這種系列化的多聯(lián)檢測試劑盒除了可判斷受檢者身體哪部位患癌癥的機(jī)率較大，為醫(yī)生進(jìn)一步檢查和更準(zhǔn)確地診斷提供有力的依據(jù)外，還可檢測腫瘤是否轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)傾向以及耐藥情況等，同時(shí)顯示預(yù)后和治療效果。三、試驗(yàn)結(jié)果檢測實(shí)驗(yàn)例I抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY和抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性復(fù)合IgY以及抗人表皮生長因子受體(HER2)特異性復(fù)合IgY、抗人腫瘤全抗原特異性復(fù)合IgY純品中的IgY含量檢測應(yīng)用SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉一聚丙烯凝膠)電泳測定法，對按以上方法所制取的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY和抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性復(fù)合IgY以及抗端粒酶RNA (hTR)特異性復(fù)合純IgY和抗人表皮生長因子受體(HER2)特異性復(fù)合IgY、抗人腫瘤全抗原特異性復(fù)合IgY粗品進(jìn)行檢測，結(jié)果含IgY 45 52%。將這五種IgY粗品經(jīng)二次過柱純化后，得到純IgY。經(jīng)SDS-PAGE分析，純度達(dá)到PAGE純，如下表所示
IgY純品IgY含量
抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和HER2特異性復(fù)合IgY純品99. 99%
抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)特異性IgY純品99. 99%
權(quán)利要求
1.一種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (Al)基因重組端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、人表皮生長因子受體蛋白和/或端粒酶RNA并純化； 和/或培養(yǎng)人體組織腫瘤傳代細(xì)胞并制備人體組織癌細(xì)胞蛋白； (A2)選取所述端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、人表皮生長因子受體蛋白、端粒酶RNA和/或人體組織癌細(xì)胞蛋白中的至少一種，作為抗原成分，并將所述抗原成分按(1-10):(10-1)比例加入福氏佐劑，再高速勻化處理形成油包水乳液，制得抗原； (A3)采用淘汰法篩選具有高免疫應(yīng)答能力的選擇產(chǎn)蛋禽類，用以上抗原液免疫所選擇的高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋禽類，再揀取被選出之產(chǎn)蛋禽類所產(chǎn)的免疫蛋； (A4)對所述免疫蛋進(jìn)行消毒，取蛋黃，制備特異性IgY粗提物； (A5)將所述IgY粗提物通過離子交換柱和凝膠交換柱進(jìn)行純化，得特異性IgY純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于，所述步驟(Al)中所述的人體組織癌細(xì)胞為人胃癌細(xì)胞、人口腔癌細(xì)胞、人食道癌細(xì)胞、人鼻咽癌細(xì)胞、人肺癌細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞、人大腸癌細(xì)胞、人直腸癌細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞以及淋巴癌細(xì)胞中的單一人體組織癌細(xì)胞或多種復(fù)合的人體組織癌細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于，所述步驟(A2)中選取端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶作為抗原成分，所述步驟(A5)中制備的特異性IgY為抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶特異性IgY。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于，所述制備步驟(A2)中選取人表皮生長因子受體作為抗原成分，所述步驟(A5)中制備的特異性IgY為抗人表皮生長因子受體特異性IgY。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于，所述制備步驟(A2)中選取端粒酶RNA作為抗原成分，所述步驟(A5)中制備的特異性IgY為抗端粒酶RNA特異性IgY。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于，所述制備步驟(A2)中選取端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體按(1-10) : (10-1)混合均勻作為抗原成分，所述步驟(A5)中制備的特異性IgY為抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于，所述步驟(A2)中選取端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、人表皮生長因子受體、以及所述人體組織癌細(xì)胞蛋白混合均勻作為抗原成分，所述步驟(A5)中制備的特異性IgY為抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、人表皮生長因子受體及人腫瘤抗原特異性復(fù)合IgY。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于 所述人體組織癌細(xì)胞蛋白為單一人體組織癌細(xì)胞，則所述步驟(A2)中選取端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、人表皮生長因子受體、以及所述單一人體組織癌細(xì)胞蛋白按(10-1) : (10-1) : (1-10)的比例混合均勻作為抗原成分；或 所述人體組織癌細(xì)胞蛋白為按均一比例混合而成的復(fù)合人體組織癌細(xì)胞，則所述步驟(A2)中選取端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體按(1-10) : (10-1)混合后，與所述復(fù)合人體組織癌細(xì)胞蛋白按(1-10):(10-1)的比例混合均勻作為抗原成分。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于，所述步驟(A2)中選取任意一種人體組織癌細(xì)胞蛋白作為抗原成分，所述步驟(A5)中制備的特異性IgY為多種抗人腫瘤抗原特異性IgY。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于，所述步驟(A2)中選取人體組織癌細(xì)胞蛋白中的至少二種混合均勻作為抗原成分，所述步驟(A5)中制備的特異性IgY為抗人腫瘤復(fù)合全抗原特異性IgY。
11.一種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY，其特征在于，采用權(quán)利要求ι- ο中任意一項(xiàng)所述的方法制得。
12.一種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY偶聯(lián)物，其特征在于，將權(quán)利要求11所述的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY與細(xì)胞穿透載體或化療藥偶聯(lián)制得。
13.—種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY組合制劑，其特征在于，采用權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的方法制得的特異性IgY加入各種輔料制成的組合制劑，包括噴霧劑(口噴劑、鼻噴劑等)、霧化劑、膠囊(軟膠囊、硬膠囊)、口含片、咀嚼片、口服片、栓劑、泡騰片、乳膏或針劑。
14.一種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY偶聯(lián)物組合制劑，其特征在于，采用權(quán)利要求11所述抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY與細(xì)胞穿透載體或化療藥偶聯(lián)制得的特異性復(fù)合IgY偶聯(lián)物加入各種輔料制成的組合制劑，包括噴霧劑(口噴劑、鼻噴劑等)、霧化劑、膠囊(軟膠囊、硬膠囊)、口含片、咀嚼片、口服片、栓劑、泡騰片、乳膏或針劑。
15.一種特異性復(fù)合IgY多聯(lián)試劑盒，其特征在于，包括由權(quán)利要求3所制得的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶特異性IgY和由權(quán)利要求4所制得的抗人表皮生長因子受體特異性IgY以及由權(quán)利要求10所制得的抗人腫瘤復(fù)合全抗原特異性IgY共三種抗體組合制成的一種三聯(lián)檢測試劑盒，或由權(quán)利要求3所制得的抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶特異性IgY和由權(quán)利要求4所制得的抗人表皮生長因子受體特異性IgY以及由權(quán)利要求9所制得的多種抗人腫瘤抗原特異性IgY中任意一種IgY共三種抗體組合制成的至少2種三聯(lián)檢測試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人表皮生長因子受體特異性復(fù)合IgY與偶聯(lián)物及其制備方法以及多聯(lián)試劑盒，針對現(xiàn)有癌癥治療技術(shù)中存在的副作用很大和無法阻止復(fù)發(fā)的問題，本發(fā)明的復(fù)合IgY及其偶聯(lián)物具有生物導(dǎo)向性，可特異性地識別并穿透細(xì)胞膜進(jìn)入腫瘤細(xì)胞發(fā)生作用，一方面能直接抑制腫瘤部位端粒酶活性水平，阻滯腫瘤生長和擴(kuò)散；一方面又可抑制p185erbB2的過量表達(dá)，預(yù)防和治療p185erbB2高表達(dá)的轉(zhuǎn)移性腫瘤。所制成的復(fù)合IgY制劑除了對大部分癌癥有治療作用外，還可用于癌癥高危人群的預(yù)防。本發(fā)明的多聯(lián)檢驗(yàn)試劑盒不但提高了檢測的特異性和準(zhǔn)確性，還可診斷腫瘤發(fā)生的具體部位，為較準(zhǔn)確的預(yù)警癌癥并提早干預(yù)和治療創(chuàng)造了條件。
文檔編號C07K16/02GK102816239SQ201110153580
公開日2012年12月12日 申請日期2011年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月9日
發(fā)明者包晟, 楊榮鑒, 王長安, 汪玲, 包海威 申請人:深圳雅臣生物科技有限公司