專利名稱：血管內皮生長因子受體部分多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種血管內皮生長因子受體部分多肽及其應用。
背景技術：
迄今發(fā)現(xiàn)血管內皮生長因子(VEGF)受體家族包括具有兩種信號轉導途徑的受 體酪氨酸激酶受體和非酪氨酸激酶受體，酪氨酸激酶受體包括Flt-I (fms-liketyrosine kinase)、KDR\Flk_l(kinase insert domain containing\fetal 1iverkinase)及 VEGFR-3, Flt-I 又稱 VEGF 受體 1 (VEGFR-I)，KDR\Flk_l 又稱 VEGF 受體 2 (VEGFR-2)，非酪 氨酸激酶受體包括肝素樣分子、神經纖毛蛋白-1受體(NRP-I)和神經纖毛蛋白-2受體 (NRP-2)，其中KDR是VEGF的高親和力受體，主要參與血管內皮細胞有絲分裂、增殖、遷移、 分化、微管形成等生命活動，是目前研究的熱點。KDR在腫瘤血管形成過程中起著關鍵作用， 高表達于腫瘤新生血管內皮細胞及惡性程度高的腫瘤細胞，而正常組織中呈低表達。KDR特 異性地表達于血管內皮細胞，其表達水平與血管內皮細胞更新速度呈正相關。生理情況下 正常組織血管內皮細胞更新速度緩慢，KDR表達很低，腫瘤組織中的血管內皮細胞處于活躍 的增殖狀態(tài)，增殖速度比正常組織血管內皮細胞快500倍，KDR表達很高。KDR的表達水平 可作為評估腫瘤生物學行為和預測腫瘤患者預后的指標。KDR的表達水平可以通過與KDR 特異結合的抗體進行檢測。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種血管內皮生長因子受體部分多肽。本發(fā)明所提供的血管內皮生長因子受體(KDR)部分多肽，其氨基酸序列為序列表 中的序列1。本發(fā)明的血管內皮生長因子受體部分多肽，可用來制備免疫原，該免疫原免疫動 物可獲得與KDR特異結合的多克隆抗體。對在動物體內產生免疫反應而言，大多數(shù)多肽的分子量都太小，將多肽與載體蛋 白如匙孔血藍蛋白或牛血清白蛋白等交聯(lián)之后，不僅能增加抗原的大小，也能增強免疫性。因此，本發(fā)明還提供了 一種復合蛋白。本發(fā)明所提供的復合蛋白是所述多肽與載體蛋白偶聯(lián)形成的復合蛋白。本發(fā)明的復合蛋白，其中，所述載體蛋白為匙孔血藍蛋白或牛血清白蛋白。在免疫動物時，為了增強免疫原性通常將復合蛋白與免疫佐劑混合。本發(fā)明所提供的免疫原，是所述復合蛋白和免疫佐劑的混合物。本發(fā)明的與血管內皮生長因子特異結合的多克隆抗體，是用免疫原免疫動物，采 取免疫后動物的血液，獲得的血清；所述免疫原是復合蛋白和免疫佐劑的混合物；所述復 合蛋白是多肽與載體蛋白偶聯(lián)形成的復合蛋白，所述多肽的氨基酸序列為序列表中的序列 1。本發(fā)明的與血管內皮生長因子特異結合的多克隆抗體，其中，所述載體蛋白為匙孔血藍蛋白或牛血清白蛋白。本發(fā)明的免疫原免疫動物獲得了較高效價的免疫血清，經ELISA檢驗效價高于 1 60000，并且免疫印跡法證明該免疫血清與雞血管內皮生長因子受體結合的特異性較 強，免疫血清能在細胞水平上檢測雞血管內皮生長因子受體的表達。


圖1為免疫印跡法檢測免疫血清的特異性。圖2為空白對照組激光共聚焦顯微鏡下顯示結果的圖片；A為相差圖片，B為相差與熒光疊加圖片，C為熒光圖片。圖3為對照血清組激光共聚焦顯微鏡下顯示結果的圖片；A為相差圖片，B為相差與熒光疊加圖片，C為熒光圖片。圖4為免疫血清組激光共聚焦顯微鏡下顯示結果的圖片；A為相差圖片，B為相差與熒光疊加圖片，C為熒光圖片。
具體實施例方式實施例1、與KDR特異結合的多克隆抗體(一 )合成免疫原人工合成免疫多肽，其氨基酸序列為CAQEASPTLPRVHGLVHD。人工合成對照多肽，其氨基酸序列為AFGQVIEADAFGIDKTATC。對人工合成的多肽進行檢測。結果表明，人工合成的免疫多肽為白色凍干粉末，分子量為1931. 13,HPLC(220nm, C18，線性梯度)檢測純度為98%。對照多肽為白色凍干粉末，分子量為1957. 19，HPLC(220nm, C18，線性梯度)檢測 純度為95%。( 二)與雞血管內皮生長因子受體特異結合的多克隆抗體免疫多肽與載體蛋白按照質量比1 1偶聯(lián)，形成多肽-載體復合蛋白，載體蛋白 可以為匙孔血藍蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)，本實施例為免疫多肽-KLH復合蛋白。對照多肽與KLH按照質量比1 1偶聯(lián)，形成對照多肽-KLH復合蛋白。免疫多肽-KLH復合蛋白與費氏完全佐劑(Sigma)混合，制成免疫原。對照多肽-KLH復合蛋白與費氏完全佐劑(Sigma)混合，制成對照免疫原。用上述制備的免疫原和對照免疫原分別免疫SPF新西蘭大耳兔。20周齡以內，2. 5-3Kg的SPF新西蘭大耳兔，隨機分成兩組，免疫多肽組和對照多 肽組，每組2只。免疫多肽組注射免疫原，對照多肽組注射對照免疫原。免疫的具體過程如下第1周，每天多點背部皮下注射免疫SPF新西蘭大耳兔一次，每只SPF新西蘭大耳 兔注射免疫多肽-KLH復合蛋白或對照多肽-KLH復合蛋白的總量為0. Img ；第2周，對SPF新西蘭大耳兔不做任何處理；第3周-第7周，每天多點背部皮下注射免疫SPF新西蘭大耳兔一次，每只SPF新 西蘭大耳兔注射免疫多肽-KLH復合蛋白或對照多肽-KLH復合蛋白的總量為0. Img ；
第7周免疫結束，處死SPF新西蘭大耳兔，從耳部及心臟采取150ml血液，用促凝 劑促凝，3000轉離心20分鐘。免疫多肽組獲得免疫血清01和02。對照多肽組獲得對照血清01和02。ELISA檢測免疫血清和對照血清的效價，具體方法如下1)上述雞血管內皮生長因子受體蛋白用PBS配成lOOyg/ml的溶液，按100 μ 1/ 每孔加入96孔酶標板，4°C過夜吸附；2)次日將過夜包被的酶標板中未吸附的蛋白溶液倒掉，以PBS洗3次。加入3% (質量百分比)BSA (用PBS配制不含Tween20,)封閉，100 μ 1/每孔，37°C，1. 5小時；3)用PBS徹底洗2)中的沉淀4次后加入免疫血清或對照血清(用PBS按體積比 為 1 100、1 500、1 2500、1 12500 或 1 62500 稀釋)，100 μ 1/每孔，37°C，1. 5 小 時；4)用PBS洗3)中的沉淀4次，加二抗(羊抗兔IgG用PBS按體積比為1 10000 稀釋)，100 μ 1/每孔，37°C，lhr ；5)用PBS洗4)中的沉淀4次，加AP顯色液P-NPP (2mg/ml)，80 μ 1/每孔，避光反 應，加等體積0. 2Μ NaOH終止反應。6)取100 μ 1 5)中終止反應后的溶液100 μ 1，用酶標儀測定405nm下的OD值。實驗重復三次，結果以三次的平均值表示。
血清效價檢測結果如表1和圖1所示；表1.血清效價檢測結果
權利要求
1.一種多肽，其氨基酸序列為序列表中的序列1。
2.一種復合蛋白，是多肽與載體蛋白偶聯(lián)形成的復合蛋白，所述多肽的氨基酸序列為 序列表中的序列1。
3.根據(jù)權利要求2所述的復合蛋白，其特征在于所述載體蛋白為匙孔血藍蛋白或牛 血清白蛋白。
4.一種免疫原，是復合蛋白和免疫佐劑的混合物；所述復合蛋白是多肽與載體蛋白偶 聯(lián)形成的復合蛋白，所述多肽的氨基酸序列為序列表中的序列1。
5.根據(jù)權利要求4所述的免疫原，其特征在于所述載體蛋白為匙孔血藍蛋白或牛血 清白蛋白。
6.權利要求4或5所述的免疫原在制備多克隆抗體中的應用。
7.與血管內皮生長因子特異結合的多克隆抗體，是用免疫原免疫動物，采取免疫后動 物的血液，獲得的血清；所述免疫原是復合蛋白和免疫佐劑的混合物；所述復合蛋白是多 肽與載體蛋白偶聯(lián)形成的復合蛋白，所述多肽的氨基酸序列為序列表中的序列1。
8.根據(jù)權利要求7所述的多克隆抗體，其特征在于所述載體蛋白為匙孔血藍蛋白或 牛血清白蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種血管內皮生長因子受體部分多肽及其應用。血管內皮生長因子受體部分多肽，其氨基酸序列為序列表中的序列1。所述多肽與載體蛋白偶聯(lián)可形成復合蛋白。所述載體蛋白為匙孔血藍蛋白或牛血清白蛋白。復合蛋白和免疫佐劑混合的混合物可作為免疫原。本發(fā)明的免疫原免疫動物獲得了較高效價的免疫血清，經ELISA檢驗效價高于1∶60000，并且免疫印跡法證明該免疫血清與雞血管內皮生長因子受體結合的特異性較強，免疫血清能在細胞水平上檢測雞血管內皮生長因子受體的表達。
文檔編號C07K16/28GK102115492SQ201010033809
公開日2011年7月6日 申請日期2010年1月5日 優(yōu)先權日2010年1月5日
發(fā)明者侯玲玲, 關偉軍, 馮寶剛, 李方華, 浦亞斌, 王會, 白春雨, 馬月輝 申請人:中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所