本發(fā)明屬于新藥物發(fā)現(xiàn)與創(chuàng)新藥物合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種N-甲基環(huán)丙沙星醛縮氨基硫脲類衍生物，同時(shí)還涉及N-甲基環(huán)丙沙星醛縮氨基硫脲類衍生物的制備方法，以及其在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
新藥創(chuàng)新起源于先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)，而基于優(yōu)勢(shì)藥效團(tuán)骨架的拼合構(gòu)建先導(dǎo)物分子是最經(jīng)濟(jì)和有效的策略。由醛或酮與氨基硫脲類構(gòu)建的縮氨基硫脲類衍生物因其與大分子或金屬離子易產(chǎn)生配合物或螯合作用而表現(xiàn)出廣泛的藥理活性備受關(guān)注。然而，構(gòu)建縮氨基硫脲分子的醛或酮多為常見的苯類或雜環(huán)芳香類的醛和酮，而對(duì)喹啉醛，尤其是氟喹啉酮醛類形成的縮氨基硫脲類目前尚未見報(bào)道。另一方面，喹啉優(yōu)勢(shì)藥效團(tuán)骨架不僅是重要天然產(chǎn)物生物堿，如奎寧和喜樹堿類的重要結(jié)構(gòu)單元，也是抗菌氟喹諾酮類藥物的藥效團(tuán)骨架。同時(shí)，氟喹諾酮類藥物因有親水性的哌嗪基存在而增大其水溶性，提高生物利用度。尤其是氟喹諾酮類藥物的作用靶點(diǎn)—拓?fù)洚悩?gòu)酶也是抗腫瘤藥物的重要作用靶點(diǎn)，可將其抗菌活性轉(zhuǎn)化為抗腫瘤活性。為此，將氟喹諾酮C-3羧基轉(zhuǎn)化為甲?；纬上鄳?yīng)的氟喹諾酮C-3醛，然后與氨基硫脲或取代的氨基硫脲縮合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)喹啉與縮氨基硫脲藥效團(tuán)的拼合，以期達(dá)到不同藥效團(tuán)間的活性疊加，從中發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的氟喹諾酮候選化合物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為此，本發(fā)明的目的是提供一種N-甲基環(huán)丙沙星醛縮氨基硫脲類衍生物，其具有抗腫瘤的作用和功效，同時(shí)提供樂(lè)了上述N-甲基環(huán)丙沙星醛縮氨基硫脲類衍生物的制備方法。
為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種N-甲基環(huán)丙沙星醛縮氨基硫脲類衍生物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如通式(I)所示：
其中，取代基R為氫原子、1～5個(gè)碳原子的烴基或環(huán)丙基。
上述N-甲基環(huán)丙沙星醛縮氨基硫脲類衍生物，具體為以下結(jié)構(gòu)的化合物：
本發(fā)明N-甲基環(huán)丙沙星醛縮氨基硫脲類衍生物的制備方法，以式(II)所示的環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)為原料制備而成；
具體制備步驟如下：
1)將式(II)所示的環(huán)丙沙星與甲酸和水合甲醛發(fā)生甲基化反應(yīng)制得式(III)所示的N-甲基環(huán)丙沙星；式(III)所示的N-甲基環(huán)丙沙星再與水合肼進(jìn)行肼解反應(yīng)制得式(IV)所示的N-甲基環(huán)丙沙星酰肼；具體操作步驟可參考文獻(xiàn)；
2)將式(IV)所示的N-甲基環(huán)丙沙星酰肼與鐵氰化鉀在氯仿的氨水堿性介質(zhì)中常溫反應(yīng)8～10小時(shí)，分出有機(jī)層，并用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑，制得式(V)所示的中間體N-甲基環(huán)丙沙星醛粗品，直接用于下步反應(yīng)；
3)式(V)所示的N-甲基環(huán)丙沙星醛粗品與式(VI)所示的肼基二硫代甲酸甲酯發(fā)生縮合反應(yīng)，待反應(yīng)完全經(jīng)后處理可分別制得(VII)所示的N-甲基環(huán)丙沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯；
4)將式(VII)所示N-甲基環(huán)丙沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯與胺類化合物在正丁醇中進(jìn)行親核取代反應(yīng)，或式(V)所示N-甲基環(huán)丙沙星醛粗品與氨基硫脲在乙醇進(jìn)行縮合反應(yīng)，待反應(yīng)完全后經(jīng)處理制得目標(biāo)化合物如式(I)所示，其制備的詳細(xì)操作步驟見實(shí)施例部分；
取代基R為H原子、1～5個(gè)碳原子的鏈烴基或環(huán)丙基。
具體的，步驟2)中，式(IV)所示的N-甲基環(huán)丙沙星酰肼與鐵氰化鉀的摩爾比為1:3.0～5.0。
具體的，步驟4)中，式(VII)所示的N-甲基環(huán)丙沙星醛縮二硫代肼基甲酸甲酯與胺類化合物的摩爾比為1:3.0～10.0。所述胺類化合物優(yōu)選為脂肪伯胺或環(huán)丙胺。作為進(jìn)一步的改進(jìn)，式(VII)所示的N-甲基環(huán)丙沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯與胺類化合物在反應(yīng)過(guò)程中，所用溶劑可選擇甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、異丁醇、正丁醇中的至少一種，其中優(yōu)選正丁醇。
上述N-甲基環(huán)丙沙星醛縮氨基硫脲類衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
所述抗腫瘤藥物為治療肝癌、胰腺癌或白血病藥物。
和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明N-甲基環(huán)丙沙星醛縮氨基硫脲類衍生物基于藥效團(tuán)的拼合理性藥物分子設(shè)計(jì)原理，將氟喹諾酮、亞胺席夫堿及硫脲等三種不同藥效團(tuán)間的有效組合，進(jìn)而設(shè)計(jì)了N-甲基環(huán)丙沙星醛縮氨基硫脲類衍生物，實(shí)現(xiàn)了不同結(jié)構(gòu)藥效團(tuán)的互補(bǔ)和活性的疊加，從而達(dá)到了增效降毒的效果，可作為全新結(jié)構(gòu)的抗腫瘤藥物開發(fā)。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
下述實(shí)施例中，式(V)所示化合物經(jīng)下述步驟獲得：
1)將式(II)所示的環(huán)丙沙星與甲酸和水合甲醛發(fā)生甲基化反應(yīng)制得式(III)所示的N-甲基環(huán)丙沙星；式(III)所示的N-甲基環(huán)丙沙星再與水合肼進(jìn)行肼解反應(yīng)制得式(IV)所示的N-甲基環(huán)丙沙星酰肼；具體操作步驟可參考文獻(xiàn)。制備式(III)、式(IV)的詳細(xì)操作步驟可以參照文獻(xiàn)(楊勇.喹諾酮C-3[1，3，4]三唑硫醚及衍生物的合成和抗腫瘤活性研究。碩士論文，河南大學(xué)，2011年.)
2)將式(IV)所示的N-甲基環(huán)丙沙星酰肼與鐵氰化鉀在氯仿的氨水堿性介質(zhì)中常溫反應(yīng)8～10小時(shí)，分出有機(jī)層，并用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑，制得式(V)所示的中間體N-甲基環(huán)丙沙星醛粗品，直接用于下步反應(yīng)。具體操作步驟為：將N-甲基環(huán)丙沙星酰肼(10.0g，29.0mmol)懸浮于氯仿(200毫升)與濃氨水(22-25％，20毫升)的混合液中，常溫慢慢滴加鐵氰化鉀(38.0g，115.0mmol)的水(120毫升)溶液，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)8～10小時(shí)至原料消失(TLC檢測(cè)，V氯仿：V甲醇＝5:1)。分出有機(jī)層，并用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑，得式(V)所示的N-甲基環(huán)丙沙星醛粗品備用。
下述實(shí)施例中，式(VII)所示化合物經(jīng)下述步驟獲得：
1)水合肼與二硫化碳在堿性介質(zhì)中縮合后與硫酸二甲酯反應(yīng)制得式(VI)所示的肼基二硫代甲酸甲酯中間體；具體操作步驟可參考文獻(xiàn)(胡惟孝，等，縮氨基硫脲化合物的合成及其抗癌活性的研究，高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2001，22(12)：2014-2017)的制備方法；
2)式(V)所示的N-甲基環(huán)丙沙星醛粗品與式(VI)所示肼基二硫代甲酸甲酯發(fā)生縮合反應(yīng)，待反應(yīng)完全經(jīng)后處理可分別制得(VII)所示的N-甲基環(huán)丙沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯；具體為：將式(V)所示N-甲基環(huán)丙沙星醛粗品(10.0g)溶于無(wú)水乙醇(150毫升)中，加入肼基二硫代甲酸甲酯(3.9g，32.0mmol)，回流反應(yīng)10小時(shí)，放置冷卻至室溫。過(guò)濾并收集產(chǎn)生的固體，干燥。粗品用甲醇-氯仿(V/V＝3：1)重結(jié)晶，制得淡黃色結(jié)晶式(VII)所示縮肼基二硫代甲酸甲酯，收率65.2％，mp 242～244℃。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：11.46(s,1H,CH＝N),8.74(1H，s，2-H)，7.94(s,1H,NH),7.86(1H，d，5-H)，7.44(d，1H，8-H)，3.67(m,1H，1-N-CH)，3.23(t,4H，piperazine-H)，2.52(t,4H，piperazine-H)，2.24(s,3H，N-CH3)，1.84(s,3H,SCH3)，1.24～1.14(m,4H,CH2CH2)；MS(m/z)：Calcd.for C20H24FN5OS2：433.57[M]+；Found：434[M+H]+。
實(shí)施例1
1-環(huán)丙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-喹啉-4(1H)-酮-3-醛縮氨基硫脲(I-1)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
即式I中的R為H原子。
該化合物的制備方法為：取式(V)所示N-甲基環(huán)丙沙星C-3醛粗品(1.0g)溶于無(wú)水乙醇(20毫升)，加入氨基硫脲(0.5g，5.5mmol)，回流反應(yīng)12小時(shí)，趁熱過(guò)濾，乙醇洗滌2次，蒸餾水洗滌2次，干燥，用DMF-乙醇(V:V＝1:3)混合溶劑重結(jié)晶，制得淡黃色結(jié)晶物式(I-1)產(chǎn)品0.66g，m.p.256～258℃。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ:11.39(s,1H,CH＝N),8.60(s,1H，2-H)，8.46(s,1H,NH),8.32(s,1H,NH2),8.27(s,1H,NH2),7.75(d,1H，5-H)，7.46(d,1H，8-H)，3.70(m,1H，1-N-CH)，3.24(t,4H，piperazine-H)，2.53(t,4H，piperazine-H)，2.26(s,3H，N-CH3)，1.26～1.15(m,4H,CH2CH2)；MS(m/z)：Calcd.for C19H23FN6OS：402.50[M]+；Found：403[M+H]+。
實(shí)施例2
1-環(huán)丙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-喹啉-4(1H)-酮-3-醛縮4-甲氨基硫脲(I-2)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
即式I中的R為甲基。
該化合物的制備方法為：取(VII)所示N-甲基環(huán)丙沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯(1.0 g，2.3mmol)溶于無(wú)水正丁醇(20毫升)中，加入甲胺(0.71 g,23.0 mmol)后混合反應(yīng)物回流反應(yīng)12小時(shí)，趁熱過(guò)濾，固體依次用乙醇洗滌2次，蒸餾水洗滌2次，干燥，用DMF-乙醇(V:V＝1:5)混合溶劑重結(jié)晶，制得黃色結(jié)晶物式(I-2)產(chǎn)品0.50g，m.p.243～245℃。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.39(s,1H,CH＝N),8.60(s,1H，2-H)，8.47～8.32(m,2H,2×NH),7.76(d,1H,5-H),7.42(d,1H，8-H)，3.69(m,1H，1-N-CH)，3.67(d,3H，NHCH3),3.24(t,4H，piperazine-H)，2.54(t,4H，piperazine-H)，2.26(3H，s，N-CH3)，1.26～1.15(m,4H,CH2CH2)；MS(m/z)：Calcd.for C20H25FN6OS：416.52[M]+；Found：417[M+H]+。
實(shí)施例3
1-環(huán)丙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-喹啉-4(1H)-酮-3-醛縮4-乙氨基硫脲(I-3)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
即式I中的R為乙基。
該化合物的制備方法為：取(VII)所示N-甲基環(huán)丙沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯(1.0 g，2.3 mmol)溶于無(wú)水正丁醇(20毫升)中，加入乙胺(1.04 g,23.0 mmol)后混合反應(yīng)物回流反應(yīng)12小時(shí)，趁熱過(guò)濾，固體依次用乙醇洗滌2次，蒸餾水洗滌2次，干燥，用DMF-乙醇(V:V＝1:5)混合溶劑重結(jié)晶，制得黃色結(jié)晶物式(I-3)產(chǎn)品0.55g，m.p.238～240℃。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.32(s,1H,CH＝N),8.57(s,1H，2-H)，8.48～8.32(m,2H,2×NH),7.76(d,1H,5-H),7.46(d,1H，8-H)，3.68(m,1H，1-N-CH)，3.64(m,3H，NHCH2),3.25(t,4H，piperazine-H)，2.54(t,4H，piperazine-H)，2.26(3H，s，N-CH3)，1.28～1.14(m,7H,CH3 and CH2CH2)；MS(m/z)：Calcd.for C21H27FN6OS：430.55[M]+；Found：431[M+H]+。
實(shí)施例4
1-環(huán)丙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-喹啉-4(1H)-酮-3-醛縮4-異丙氨基硫脲(I-4)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
即式I中的R為異丙基。
該化合物的制備方法為：取(VII)所示N-甲基環(huán)丙沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯(1.0g，2.3mmol)溶于無(wú)水正丁醇(20毫升)中，加入異丙胺(1.18g,20.0mmol)后混合反應(yīng)物回流反應(yīng)10小時(shí)，趁熱過(guò)濾，固體依次用乙醇洗滌2次，蒸餾水洗滌2次，干燥，用DMF-乙醇(V:V＝1:5)混合溶劑重結(jié)晶，制得黃色結(jié)晶物式(I-4)產(chǎn)品0.62g，m.p.253～255℃。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.32(s,1H,CH＝N),8.55(s,1H，2-H)，8.33～8.04(m,2H,2×NH),7.77(d,1H,5-H),7.47(d,1H，8-H)，4.51(m,1H,CH),3.68(m,1H，1-N-CH)，3.24(t,4H，piperazine-H)，2.55(t,4H，piperazine-H)，2.27(3H，s，N-CH3)，1.26～1.18(m,10H,2×CH3and CH2CH2)；MS(m/z)：Calcd.for C22H29FN6OS：444.58[M]+；Found：445[M+H]+。
實(shí)施例5
1-環(huán)丙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-喹啉-4(1H)-酮-3-醛縮4-環(huán)丙氨基硫脲(I-5)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
即式I中的R為環(huán)丙基。
該化合物的制備方法為：取(VII)所示N-甲基環(huán)丙沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯(1.0g，2.3mmol)溶于無(wú)水正丁醇(20毫升)中，加入環(huán)丙胺(1.14g,20.0mmol)后混合反應(yīng)物回流反應(yīng)10小時(shí)，趁熱過(guò)濾，固體依次用乙醇洗滌2次，蒸餾水洗滌2次，干燥，用DMF-乙醇(V:V＝1:5)混合溶劑重結(jié)晶，制得黃色結(jié)晶物式(I-5)產(chǎn)品0.38g，m.p.230～232℃。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.44(s,1H,CH＝N),8.61(s,1H，2-H)，8.34～8.26(m,2H,2×NH),7.75(d,1H，5-H)，7.46(d,1H，8-H)，3.67～3.04(m,6H，2×CH and piperazine-H)，2.55(t,4H,piperazine-H),2.26(s,3H,CH3),1.28～0.67(m,8H,2×CH2CH2)；MS(m/z)：Calcd.for C22H27FN6OS：442.56[M]+；Found：443[M+H]+。
實(shí)施例6
1-環(huán)丙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-喹啉-4(1H)-酮-3-醛縮4-叔丁氨基硫脲(I-6)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
即式I中的R為叔丁基。
該化合物的制備方法為：取(VII)所示N-甲基環(huán)丙沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯(1.0g，2.3mmol)溶于無(wú)水正丁醇(20毫升)中，加入叔丁胺(1.10g,15.0mmol)后混合反應(yīng)物回流反應(yīng)10小時(shí)，趁熱過(guò)濾，固體依次用乙醇洗滌2次，蒸餾水洗滌2次，干燥，用DMF-乙醇(V:V＝1:5)混合溶劑重結(jié)晶，制得黃色結(jié)晶物式(I-6)產(chǎn)品0.68g，m.p>250℃。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.28(s,1H,CH＝N),8.44(s,1H，2-H)，7.76～7.46(m,4H,NH,5-H and 8-H),3.68(m,1H，1-N-CH)，3.26(t,4H，piperazine-H)，2.56(t,4H,piperazine-H),1.55(s,9H,3×CH3),1.27～1.15(m,4H,CH2CH2)；MS(m/z)：Calcd.for C23H31FN6OS：458.61[M]+；Found：459[M+H]+。
實(shí)施例7
1-環(huán)丙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-喹啉-4(1H)-酮-3-醛縮4-正丁基氨基硫脲(I-7)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
即式I中的R為正丁基。
該化合物的制備方法為：取(VII)所示N-甲基環(huán)丙沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯(1.0g，2.3mmol)溶于無(wú)水正丁醇(20毫升)中，加入正丁胺(1.10g,15.0mmol)后混合反應(yīng)物回流反應(yīng)10小時(shí)，趁熱過(guò)濾，固體依次用乙醇洗滌2次，蒸餾水洗滌2次，干燥，用DMF-乙醇(V:V＝1:5)混合溶劑重結(jié)晶，制得黃色結(jié)晶物式(I-7)產(chǎn)品0.55g，m.p.244～246℃。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.34(s,1H,CH＝N),8.63(s,1H，2-H)，8.36～8.28(m,2H,2×NH),7.77(d,1H,5-H),7.46(d,1H，8-H)，3.68(m,1H，1-N-CH)，3.63(m,3H，NHCH2),3.25(t,4H，piperazine-H)，2.55(t,4H，piperazine-H)，2.26(3H，s，N-CH3)，1.27～0.68(m,11H,CH2CH2and CH2CH2CH3)；MS(m/z)：Calcd.for C23H31FN6OS：458.61[M]+；Found：459[M+H]+。
實(shí)施例8
1-環(huán)丙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-喹啉-4(1H)-酮-3-醛縮4-正戊基氨基硫脲(I-8)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
即式I中的R為正戊基。
該化合物的制備方法為：取(VII)所示N-甲基環(huán)丙沙星醛縮肼基二硫代甲酸甲酯(1.0g，2.3mmol)溶于無(wú)水正丁醇(20毫升)中，加入正戊胺(0.87g,10.0mmol)后混合反應(yīng)物回流反應(yīng)10小時(shí)，趁熱過(guò)濾，固體依次用乙醇洗滌2次，蒸餾水洗滌2次，干燥，用DMF-乙醇(V:V＝1:5)混合溶劑重結(jié)晶，制得黃色結(jié)晶物式(I-8)產(chǎn)品0.60g，m.p.231～233℃。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.34(s,1H,CH＝N),8.62(s,1H，2-H)，8.35～8.28(m,2H,2×NH),7.77(d,1H,5-H),7.46(d,1H，8-H)，3.68(m,1H，1-N-CH)，3.62(m,3H，NHCH2),3.25(t,4H，piperazine-H)，2.55(t,4H，piperazine-H)，2.26(3H，s，N-CH3)，1.27～0.66(m,11H,CH2CH2and CH2CH2CH2CH3)；MS(m/z)：Calcd.for C24H33FN6OS：472.63[M]+；Found：473[M+H]+。
試驗(yàn)例
一、實(shí)施例1-8提供的N-甲基環(huán)丙沙星醛縮氨基硫脲類衍生物的體外抗腫瘤活性測(cè)定
1、供試樣品
以實(shí)施例1-8提供的N-甲基環(huán)丙沙星醛縮氨基硫脲類衍生物，及經(jīng)典抗腫瘤TOPO抑制劑10-羥基喜樹堿(HC，羥喜樹堿)和環(huán)丙沙星(CF)為供試樣品，共10種，其中HC和CF為對(duì)照組，實(shí)施例1-8樣品為實(shí)驗(yàn)組；
實(shí)驗(yàn)癌細(xì)胞株分別為人肝癌Hep-3B細(xì)胞、人胰腺癌Panc-1細(xì)胞和人白血病HL60細(xì)胞株均購(gòu)買自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。正常細(xì)胞采用VERO非洲綠猴腎細(xì)胞，購(gòu)買于上海通派生物科技有限公司。
2、測(cè)定方法
測(cè)定方法的具體步驟為：
(1)首先將上述10種供試樣品分別用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配制成1.0×10-2mol·L-1濃度的儲(chǔ)備液，之后用質(zhì)量百分比濃度為10％的小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將儲(chǔ)備液稀釋成具有5個(gè)濃度梯度(0.1、1.0、5.0、10.0、50.0μmol·L-1)的工作液；
(2)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌Hep-3B細(xì)胞、人胰腺癌Panc-1細(xì)胞和人白血病HL60細(xì)胞及VERO細(xì)胞株，以每孔6000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，隨后分別加入上述10種樣品的具有5個(gè)濃度梯度的工作液。培養(yǎng)48小時(shí)后每孔加入5g·L–1MTT(噻唑藍(lán))溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后加入100μL質(zhì)量百分比濃度為10％的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液再培養(yǎng)24小時(shí)，然后用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各自的吸光度(OD)值；
(3)按下述所示公式計(jì)算不同濃度的供試樣品對(duì)癌細(xì)胞的抑制率，
癌細(xì)胞抑制率＝[(1－實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值]×100％，
然后以供試樣品的各濃度的對(duì)數(shù)值對(duì)各濃度對(duì)應(yīng)的癌細(xì)胞抑制率作線性回歸，得到劑量-效應(yīng)方程，從所得劑量-效應(yīng)方程計(jì)算出各供試樣品對(duì)實(shí)驗(yàn)癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)；每個(gè)數(shù)據(jù)平行測(cè)定三次，求其平均值，結(jié)果如表1所示。
表1各供試樣品的抗腫瘤活性(IC50)
從表1的初步體外抗腫瘤活性篩選結(jié)果可以看出，實(shí)施例1-8提供的化合物對(duì)3種實(shí)驗(yàn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制活性顯著強(qiáng)于母體化合物環(huán)丙沙星(CF)的活性，尤其是較小取代基或環(huán)丙基取代的化合物對(duì)人胰腺癌Panc-1細(xì)胞的活性相當(dāng)于對(duì)照羥喜樹堿的活性，其IC50值已達(dá)到微摩爾濃度。更有意義的是，實(shí)施例1-8提供的化合物對(duì)VERO細(xì)胞表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性，表明對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的選擇性，提示該類化合物具有成藥性開發(fā)的潛力和價(jià)值。因此，按照藥物開發(fā)的一般途徑是先進(jìn)行常規(guī)的抗腫瘤體外篩選，然后進(jìn)行針對(duì)性的研究，所以本發(fā)明的化合物具有強(qiáng)的抗腫瘤活性和較低的毒性，可通過(guò)與人體可接受的酸成鹽或與藥用載體混合制備抗腫瘤藥物。