本發(fā)明屬于高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及聚合物納米凝膠的制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

納米凝膠是亞微米尺寸的三維交聯(lián)的聚合物網(wǎng)絡(luò)，并且由具有納米尺寸空間的水凝膠顆粒實(shí)體組成，因此其同時(shí)具有上述水凝膠和納米顆粒的特征。聚合物納米凝膠由親水性聚合物或環(huán)境敏感性聚合物組成,通過(guò)對(duì)環(huán)境的響應(yīng),發(fā)生相應(yīng)的膨脹或收縮。刺激響應(yīng)性聚合物納米凝膠是能對(duì)外界不同刺激產(chǎn)生響應(yīng)的納米凝膠，因此又稱作智能納米凝膠。外界刺激通常包括：環(huán)境溫度，分散介質(zhì)pH，光照，磁場(chǎng)，特定的化學(xué)物質(zhì)以及離子強(qiáng)度的變化。

近些年，國(guó)內(nèi)外研究小組關(guān)于單/雙重刺激響應(yīng)納米凝膠的研究比較廣泛，例如Ding Jianxun等人設(shè)計(jì)研究了還原物質(zhì)單重刺激響應(yīng)甲氧基聚(乙二醇)-聚(L-苯丙氨酸-共-L-胱氨酸)納米凝膠，用來(lái)在生物體內(nèi)藥物轉(zhuǎn)移與釋放；LuXihua等人研究了溫度和pH雙重刺激響應(yīng)聚(N,N-二乙基丙烯酰胺/丙烯酸)納米凝膠，在不同溫度和pH條件下可控釋放裝載的客體分子。例如Yan Deyue等人報(bào)道了聚(二硒化物-磷酸鹽)自組裝納米凝膠用于癌癥治療以及HePeixin等人研究了溫度、還原物質(zhì)和pH三重刺激響應(yīng)聚(N-異丙基丙烯酰胺-共-丙烯酸)納米凝膠應(yīng)用于抗癌藥物的傳遞，這兩個(gè)研究組都成功合成了刺激響應(yīng)納米凝膠并應(yīng)用于體外藥物傳遞與釋放，但是由于材料自身的缺陷，難以通過(guò)自身實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)成像。

目前，刺激響應(yīng)納米凝膠的制備工藝復(fù)雜、成本頗高、控制釋放條件單一、難以通過(guò)材料自身的熒光在細(xì)胞內(nèi)成像。同時(shí)，具有光、pH和還原物質(zhì)刺激響應(yīng)，并且材料自身在光刺激后具有熒光的多重刺激響應(yīng)納米凝膠還鮮有報(bào)道，因此，這類同時(shí)具有多重刺激響應(yīng)性、結(jié)構(gòu)明確的聚合物材料得到了本領(lǐng)域研究人員的關(guān)注。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供具有對(duì)光，pH和還原物質(zhì)(DTT)響應(yīng)的三重刺激響應(yīng)性聚合物納米凝膠的制備方法，實(shí)現(xiàn)納米凝膠對(duì)已裝載的客體分子的可控釋放，同時(shí)本方法簡(jiǎn)單，成本低，能更好的適應(yīng)復(fù)雜的生物體環(huán)境，應(yīng)用于生物熒光細(xì)胞成像治療以及藥物遞送。

本發(fā)明三重響應(yīng)性納米凝膠制備方法的反應(yīng)方程式為：

具體步驟為：將甲基丙烯酸螺吡喃酯、丙烯酸、N,N’-雙(丙烯酰)胱胺、十二烷基硫酸鈉按照摩爾比為2:30:1:1～2:50:1:1加入充滿氮?dú)獾娜萜髦?，再放入油浴鍋?nèi)，在一定溫度下攪拌一定時(shí)間后，加入過(guò)硫酸鉀溶液，繼續(xù)攪拌若干小時(shí)，通過(guò)透析的方法除去溶液中的雜質(zhì)后，冷凍干燥30～40小時(shí)得到三重響應(yīng)性聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯納米凝膠。

所述甲基丙烯酸螺吡喃酯是通過(guò)酰化反應(yīng)制備得到，其分子結(jié)構(gòu)為：

所述油浴鍋內(nèi)反應(yīng)的溫度為70℃～80℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5～1.5小時(shí)。

所述加入過(guò)硫酸鉀后攪拌反應(yīng)的時(shí)間為10～20小時(shí)。

上所述合成的聚合物納米凝膠是兩親性的，納米凝膠不僅具有光和pH響應(yīng)性，且具有還原物質(zhì)(DTT)響應(yīng)性，分別實(shí)現(xiàn)了在光，pH和還原性物質(zhì)(DTT)刺激下的可控釋放。

利用本方法得到的三重響應(yīng)性納米凝膠用于生物熒光細(xì)胞成像治療以及藥物遞送過(guò)程中已裝載抗癌藥物的釋放。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于通過(guò)一種簡(jiǎn)單的合成方法，得到了多重刺激響應(yīng)納米凝膠。制備的螺吡喃基聚合物納米凝膠可以在水溶液中穩(wěn)定存在并能裝載一定量客體分子，在光、pH和還原物質(zhì)(DTT)刺激下納米凝膠變形或者解體，實(shí)現(xiàn)了納米凝膠對(duì)已裝載的客體分子的可控釋放。螺吡喃基團(tuán)在經(jīng)光照刺激后，結(jié)構(gòu)的異構(gòu)化使其親-疏水性質(zhì)的反轉(zhuǎn)并且異構(gòu)化后的帶有較強(qiáng)的熒光，應(yīng)用于納米凝膠的可控釋放與生物成像有突出的效果，且此納米凝膠具有良好的生物相容性，對(duì)生物細(xì)胞產(chǎn)生的危害極低等，這些優(yōu)點(diǎn)使其在生物熒光細(xì)胞成像治療以及藥物遞送方面鋪設(shè)了有效和安全新途徑。

附圖說(shuō)明

圖1為制得的聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯納米凝膠的氫譜核磁圖譜，溶劑為氘代二甲基亞砜和重水。

圖2為聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯納米凝膠的透射電鏡照片。

圖3(a)為聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯納米凝膠在紫外光刺激下的紫外-可見(jiàn)吸收光譜；圖3(b)為聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯納米凝膠在可見(jiàn)光刺激下的紫外-可見(jiàn)吸收光譜。

圖4為聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯納米凝膠在pH刺激下的紫外-可見(jiàn)吸收光譜。

圖5(a)為納米凝膠用紫外光照射不同時(shí)間下客體分子(阿霉素鹽酸鹽)釋放量曲線；圖5(b)為納米凝膠在不同pH刺激下客體分子(阿霉素鹽酸鹽)釋放量曲線；圖5(c)為納米凝膠在不同含量的還原物質(zhì)(DTT)刺激下客體分子(阿霉素鹽酸鹽)釋放量曲線；圖5(d)為納米凝膠在協(xié)同刺激下客體分子(阿霉素鹽酸鹽)釋放量曲線。

圖6為聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯納米凝膠裝載抗癌藥物后在體外環(huán)境抑制人類乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)體外生長(zhǎng)的曲線。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

按照?；磻?yīng)的步驟制備甲基丙烯酸螺吡喃酯。分別取螺吡喃300毫克、甲基丙烯酰氯24微升和三乙胺40微升，溶解于20毫升四氫呋喃中(四氫呋喃的充入量為容器容量的40％),并把該混合溶液加入干燥的容器中，在室溫下攪拌20小時(shí)，溶液變成橘黃色并伴有沉淀，再將溶液過(guò)濾三次除去沉淀，之后把飽和的碳酸氫鈉弱堿性溶液與二氯甲烷按照體積比為1：3混合后，加入到濾去沉淀的溶液中，并在分液漏斗中進(jìn)行萃取，直至溶液變成無(wú)色，之后再用去離子水萃取三次，在最終得到的溶液中加入過(guò)量的硫酸鎂，攪拌15小時(shí)，用來(lái)除去溶液中殘留的水，除水后的溶液在40℃下進(jìn)行減壓蒸餾，得到的濃縮液備用，再將濃縮液進(jìn)行三次重結(jié)晶,重結(jié)晶是選用85％乙醇溶液。把濃縮液溶解在45℃的熱乙醇中，之后在10℃進(jìn)行重結(jié)晶,得到甲基丙烯酸螺吡喃酯。

制備三重響應(yīng)性納米凝膠。將120毫克甲基丙烯酸螺吡喃酯、300毫克丙烯酸、35毫克N,N’-雙(丙烯酰)胱胺和40毫克十二烷基硫酸鈉加入充滿氮?dú)獾娜i瓶中。把三頸瓶放入油浴鍋內(nèi)，在70℃下攪拌1.5小時(shí)后，加入過(guò)硫酸鉀溶液，繼續(xù)攪拌15小時(shí)。通過(guò)透析的方法除去溶液中的雜質(zhì)后，冷凍干燥36小時(shí)得到聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯納米凝膠。

所合成的產(chǎn)物具有光響應(yīng)，pH響應(yīng)和還原性物質(zhì)(DTT)三重刺激響應(yīng)性，氫核磁譜圖如圖1。

所合成的聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯在水中能形成穩(wěn)定的納米凝膠水溶液。將10毫克聚合物溶解在10毫升去離子水中攪拌24小時(shí)既得到未裝載客體分子的納米凝膠溶液。

所制備的未裝載客體分子的納米凝膠溶液的在紫外光和可見(jiàn)光刺激下的以及pH刺激下的的紫外-可見(jiàn)吸收光譜分別如圖3和圖4。

按照上述步驟將聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯制備出來(lái)。制備裝載阿霉素鹽酸鹽(Dox)的納米凝膠溶液：將聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯5毫克和1毫克阿霉素鹽酸鹽(Dox)溶于5毫升去離子水中，充分?jǐn)嚢?4小時(shí)，在去離子水中透析3天，充分去除未裝載的阿霉素鹽酸鹽(Dox)，即可得到裝載阿霉素鹽酸鹽(Dox)的納米凝膠。如圖2所示得到的納米凝膠的形貌為球型，直徑為70-80納米。

由圖5可見(jiàn),圖5(a)展示了納米凝膠在紫外光照射不同時(shí)間下阿霉素鹽酸鹽的釋放曲線，隨著光照時(shí)間增長(zhǎng)納米凝膠裝載的阿霉素釋放量有所提高，但是并不明顯。圖5(b)為納米凝膠在不同pH刺激下控制阿霉素鹽酸鹽的釋放，隨著pH值的遞減(酸度遞增)，裝載的阿霉素釋放量顯著提升，在pH值為5時(shí)(刺激12小時(shí)后)釋放量能達(dá)到90％以上。圖5(c)為納米凝膠在不同含量的還原物質(zhì)(DTT)刺激下阿霉素鹽酸鹽的釋放曲線，隨著還原物質(zhì)(DTT)的量逐漸增加，阿霉素的釋放量也有明顯提升，加入10mmol DTT刺激12小時(shí)后，包載的阿霉素的釋放量達(dá)到70％。圖5(d)為納米凝膠在協(xié)同刺激下阿霉素鹽酸鹽釋放曲線。在包載阿霉素的納米凝膠溶液中，單獨(dú)把酸度增加到pH值為6刺激12小時(shí)，釋放量只達(dá)到40％，并不理想；當(dāng)用pH和光同時(shí)刺激包載阿霉素的納米凝膠溶液時(shí)(刺激12小時(shí))，釋放量提升到50％左右；但是，當(dāng)用pH、光和DTT三種物質(zhì)聯(lián)合刺激包載阿霉素的納米凝膠時(shí)，釋放量顯著提升，并在12小時(shí)內(nèi)釋放量達(dá)到65％。通過(guò)圖5得到的數(shù)據(jù)說(shuō)明，單獨(dú)刺激下，刺激條件尖銳時(shí)，才能達(dá)到大的釋放量；但是聯(lián)合刺激釋放時(shí)，每個(gè)刺激條件都比較溫和就能達(dá)到相對(duì)大的釋放量，提供了多重刺激響應(yīng)納米凝膠在生物體內(nèi)應(yīng)用的可能性。

由圖6可知,聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯納米凝膠裝載抗癌藥物后在體外環(huán)境抑制人類乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)體外生長(zhǎng)的情況。包載阿霉素的納米凝膠在不同刺激下在體外明顯抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，證明了納米凝膠的生物相容性高，毒副作用低等，這些優(yōu)點(diǎn)使其在生物熒光細(xì)胞成像治療以及藥物遞送方面鋪設(shè)了有效和安全新途徑。

實(shí)施例2

按照?；磻?yīng)的步驟制備甲基丙烯酸螺吡喃酯。分別取螺吡喃400毫克、甲基丙烯酰氯55微升和三乙胺45微升，溶解于15毫升四氫呋喃中(四氫呋喃的充入量為容器容量的30％)，并把該混合溶液加入干燥的容器中，在室溫下攪拌30小時(shí)，溶液變成橘黃色并伴有沉淀，再將溶液過(guò)濾三次除去沉淀，之后把弱堿性溶液與二氯甲烷按照體積比為1：4混合后，加入到濾去沉淀的溶液中，并在分液漏斗中進(jìn)行萃取，直至溶液變成無(wú)色，之后再用去離子水萃取三次，在最終得到的溶液中加入過(guò)量的硫酸鎂，攪拌20小時(shí)，用來(lái)除去溶液中殘留的水，除水后的溶液在45℃下進(jìn)行減壓蒸餾，得到的濃縮液備用，再將濃縮液進(jìn)行三次重結(jié)晶,重結(jié)晶是選用95％乙醇溶液。把濃縮液溶解在50℃的熱乙醇中，之后在5℃進(jìn)行重結(jié)晶,得到甲基丙烯酸螺吡喃酯。

制備三重響應(yīng)性納米凝膠。將200毫克甲基丙烯酸螺吡喃酯、650毫克丙烯酸、75毫克N,N’-雙(丙烯酰)胱胺和85毫克十二烷基硫酸鈉加入充滿氮?dú)獾娜i瓶中。把三頸燒瓶放入油浴鍋內(nèi)，在65℃下攪拌1小時(shí)后，加入過(guò)硫酸鉀溶液，繼續(xù)攪拌20小時(shí)。通過(guò)透析的方法除去溶液中的雜質(zhì)后，冷凍干燥40小時(shí)得到聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯納米凝膠。

所合成的產(chǎn)物具有光響應(yīng)，pH響應(yīng)和還原性物質(zhì)(DTT)三重刺激響應(yīng)性。

所合成的聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯在水中能形成穩(wěn)定的納米凝膠水溶液。將15毫克聚合物溶解在10毫升去離子水中攪拌24小時(shí)既得到未裝載客體分子的納米凝膠溶液。

按照上述步驟將聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯制備出來(lái)。制備裝載阿霉素鹽酸鹽(Dox)的納米凝膠溶液：將聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯7毫克和1毫克阿霉素鹽酸鹽(Dox)溶于5毫升去離子水中，充分?jǐn)嚢?4小時(shí)，在去離子水中透析3天，充分去除未裝載的阿霉素鹽酸鹽(Dox)，即可得到裝載阿霉素鹽酸鹽(Dox)的納米凝膠。

實(shí)施例3

按照?；磻?yīng)的步驟制備甲基丙烯酸螺吡喃酯。分別取螺吡喃350毫克、甲基丙烯酰氯50微升和三乙胺60微升，溶解于30毫升四氫呋喃中(四氫呋喃的充入量為容器容量的60％)，并把該混合溶液加入干燥的容器中，在室溫下攪拌25小時(shí)，溶液變成橘黃色并伴有沉淀，再將溶液過(guò)濾三次除去沉淀，之后把弱堿性溶液與二氯甲烷按照體積比為1：2混合后，加入到濾去沉淀的溶液中，并在分液漏斗中進(jìn)行萃取，直至溶液變成無(wú)色，之后再用去離子水萃取三次，在最終得到的溶液中加入過(guò)量的硫酸鎂，攪拌10小時(shí)，用來(lái)除去溶液中殘留的水，除水后的溶液在35℃下進(jìn)行減壓蒸餾，得到的濃縮液備用，再將濃縮液進(jìn)行三次重結(jié)晶,重結(jié)晶是選用90％乙醇溶液。把濃縮液溶解在60℃的熱乙醇中，之后在7℃進(jìn)行重結(jié)晶,得到甲基丙烯酸螺吡喃酯。

制備三重響應(yīng)性納米凝膠。將160毫克甲基丙烯酸螺吡喃酯、380毫克丙烯酸、46毫克N,N’-雙(丙烯酰)胱胺和51毫克十二烷基硫酸鈉加入充滿氮?dú)獾娜i瓶中。把三頸燒瓶放入油浴鍋內(nèi)，在70℃下攪拌2小時(shí)后，加入過(guò)硫酸鉀溶液，繼續(xù)攪拌10小時(shí)。通過(guò)透析的方法除去溶液中的雜質(zhì)后，冷凍干燥30小時(shí)得到聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯納米凝膠。

所合成的產(chǎn)物具有光響應(yīng)，pH響應(yīng)和還原性物質(zhì)(DTT)三重刺激響應(yīng)性。

所合成的聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯在水中能形成穩(wěn)定的納米凝膠水溶液。將10毫克聚合物溶解在15毫升去離子水中攪拌24小時(shí)既得到未裝載客體分子的納米凝膠溶液。

按照上述步驟將聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯制備出來(lái)。制備裝載阿霉素鹽酸鹽(Dox)的納米凝膠溶液：將聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯4毫克和1毫克阿霉素鹽酸鹽(Dox)溶于5毫升去離子水中，充分?jǐn)嚢?4小時(shí)，在去離子水中透析3天，充分去除未裝載的阿霉素鹽酸鹽(Dox)，即可得到裝載阿霉素鹽酸鹽(Dox)的納米凝膠。