本發(fā)明涉及SSR引物，尤其涉及用于構(gòu)建彩葉欒樹品種指紋圖譜的SSR引物，本發(fā)明還涉及所述SSR引物在構(gòu)建彩葉欒樹品種指紋圖譜中的應(yīng)用，屬于彩葉欒樹品種指紋圖譜的構(gòu)建領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

簡單重復(fù)序列標(biāo)記技術(shù)是針對基因組DNA中簡單重復(fù)序列所設(shè)計的分子標(biāo)記技術(shù)?；蚪MDNA中重復(fù)序列包括兩種類型：分散型和串聯(lián)型，其中SSR標(biāo)記主要針對的是串聯(lián)重復(fù)序列中的微衛(wèi)星DNA，因此又被稱為微衛(wèi)星DNA標(biāo)記。由于微衛(wèi)星DNA在不同植物中存在基因組位置不同、重復(fù)次數(shù)不同、重復(fù)程度不同以及同一物種中不同基因型重復(fù)次數(shù)不同等原因，造成SSR標(biāo)記具有較高的多態(tài)性，同時SSR兩端序列又具有較高的保守性，因此通過設(shè)計合適的引物即可快速進(jìn)行SSR分子標(biāo)記多態(tài)性的檢測。

SSR分子標(biāo)記在應(yīng)用上具備多種優(yōu)勢，它數(shù)量豐富，覆蓋了整個基因組，可以鑒別出純合子和雜合子，重復(fù)性高，同時具備多等位基因的特性，提供遺傳信息量多，又由于兩端序列的保守性，在同種而不同遺傳型的個體中引物具有通用性；同時它的多態(tài)性信息量也遠(yuǎn)高于其他類型的分子標(biāo)記。SSR分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用十分廣泛，其在遺傳多樣性、定位基因、圖譜構(gòu)建以及品種鑒定等方面都有著重要應(yīng)用價值。隨著研究者們不斷的創(chuàng)新與完善，由SSR又衍生出了多種標(biāo)記技術(shù)，其中以ISSR和EST-SSR應(yīng)用最為廣泛。ISSR標(biāo)記技術(shù)是由加拿大學(xué)者Zietkiewicz等提出的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，其應(yīng)用SSR序列兩端幾個堿基作為錨定序列，對其兩側(cè)具有反向SSR排列的序列進(jìn)行擴(kuò)增，兼顧了SSR、RAPD等多種標(biāo)記的優(yōu)點，同時操作簡單，成本低，因此深受廣大研究者喜愛，多被應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定、指紋圖譜的構(gòu)建、親屬關(guān)系的研究以及輔助育種等。EST-SSR為在EST序列中開發(fā)的SSR標(biāo)記技術(shù)，由于EST序列保守型較非編碼系列高，因此EST-SSR相對于SSR標(biāo)記來說，重復(fù)性更好，更穩(wěn)定，并在藥用植物、蔬菜以及水果中的應(yīng)用都成功進(jìn)行了實踐。同樣在經(jīng)濟(jì)作物的育種過程中，EST-SSR標(biāo)記也有極高的應(yīng)用價值，在小麥、水稻、棉花以及小米的遺傳多樣性分析以及品種鑒定篩選過程中，相應(yīng)的SSR標(biāo)記都發(fā)揮了重要作用。

欒樹屬植物為落葉喬木，在分類學(xué)上共有4種，其中三種為中國鄉(xiāng)土樹種，分別為欒樹(Koelreuteria paniculata Laxm.)、臺灣欒樹(K.formosana Hayta.)和復(fù)羽葉欒樹(K.Bipinnata Franch.)。除此之外，在復(fù)羽葉欒樹中還有一變種為全緣葉欒樹(K.integrifolia Merr.)，在欒樹中有一芽接變種為錦葉欒。欒樹是欒樹屬植物中最主要的代表植物，與其他三種欒樹屬植物相比，它不具備完全的二回羽狀復(fù)葉，且在小葉上邊緣上有鈍鋸齒，在近基部的齒則常疏離而呈深缺刻狀；蒴果也與其他三種不同，呈圓錐形，頂端有漸尖的趨勢。由于欒樹其本身抗性強，適應(yīng)性好，因此欒樹在園林綠化應(yīng)用中具有極其重要的作用。錦葉欒為欒樹的芽接變種，其生理學(xué)特征與普通欒樹類似，它的葉色特異，為金黃色，具有獨特的紅色的莖，紅色的脈和紅色的嫩梢，觀賞價值較普通欒樹更高，具備更好的園林樹種特性。全緣葉欒樹，又稱黃山欒，是復(fù)羽葉欒樹的一個變種，其與欒樹相比，具有完整的二回羽狀復(fù)葉，果實為橢圓形、闊卵形或近球形，其頂端圓或鈍；與復(fù)羽葉欒樹相比，差異主要體現(xiàn)在它的小葉通常為全緣，或一側(cè)近頂端略有鋸齒，而復(fù)羽葉欒樹的小葉邊緣則通常具有稍密、內(nèi)彎的小鋸齒。除此之外，其與復(fù)羽葉欒樹具備相同的生理和外部特性，因其生長迅速、抗煙塵、可三季觀景的特點，常常被栽培于庭園和行道供觀賞，其木材也可制家具，種子可用作油工業(yè)的材料；同時它的根和花還具有一定的藥用價值。

開發(fā)關(guān)于欒樹屬植物的分子標(biāo)記，對欒樹屬植物的品種鑒定篩選以及優(yōu)良樹種的選育均具有重要意義，將為欒樹屬植物領(lǐng)域的相關(guān)研究發(fā)揮極其重要的作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供用于構(gòu)建彩葉欒樹品種指紋圖譜的SSR引物；

本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是將所述SSR引物應(yīng)用于構(gòu)建彩葉欒樹品種指紋圖譜以及應(yīng)用于品種鑒定。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明首先公開了用于構(gòu)建彩葉欒樹品種指紋圖譜的SSR引物，選自以下13對引物中的任意一對或多對：

引物對1：由核苷酸序列為SEQ ID No.1所示上游引物和SEQ ID No.2所示下游引物組成；引物對2：由核苷酸序列為SEQ ID No.3所示上游引物和SEQ ID No.4所示下游引物組成；引物對3：由核苷酸序列為SEQ ID No.5所示上游引物和SEQ ID No.6所示下游引物組成；引物對4：由核苷酸序列為SEQ ID No.7所示上游引物和SEQ ID No.8所示下游引物組成；引物對5：由核苷酸序列為SEQ ID No.9所示上游引物和SEQ ID No.10所示下游引物組成；引物對6：由核苷酸序列為SEQ ID No.11所示上游引物和SEQ ID No.12所示下游引物組成；引物對7：由核苷酸序列為SEQ ID No.13所示上游引物和SEQ ID No.14所示下游引物組成；引物對8：由核苷酸序列為SEQ ID No.15所示上游引物和SEQ ID No.16所示下游引物組成；引物對9：由核苷酸序列為SEQ ID No.17所示上游引物和SEQ ID No.18所示下游引物組成；引物對10：由核苷酸序列為SEQ ID No.19所示上游引物和SEQ ID No.20所示下游引物組成；引物對11：由核苷酸序列為SEQ ID No.21所示上游引物和SEQ ID No.22所示下游引物組成；引物對12：由核苷酸序列為SEQ ID No.23所示上游引物和SEQ ID No.24所示下游引物組成；引物對13：由核苷酸序列為SEQ ID No.25所示上游引物和SEQ ID No.26所示下游引物組成。

優(yōu)選的，本發(fā)明用于構(gòu)建彩葉欒樹品種指紋圖譜的SSR引物，包括以下7對引物：引物對2：由核苷酸序列為SEQ ID No.3所示上游引物和SEQ ID No.4所示下游引物組成；引物對3：由核苷酸序列為SEQ ID No.5所示上游引物和SEQ ID No.6所示下游引物組成；引物對4：由核苷酸序列為SEQ ID No.7所示上游引物和SEQ ID No.8所示下游引物組成；引物對6：由核苷酸序列為SEQ ID No.11所示上游引物和SEQ ID No.12所示下游引物組成；引物對8：由核苷酸序列為SEQ ID No.15所示上游引物和SEQ ID No.16所示下游引物組成；引物對9：由核苷酸序列為SEQ ID No.17所示上游引物和SEQ ID No.18所示下游引物組成；和引物對12：由核苷酸序列為SEQ ID No.23所示上游引物和SEQ ID No.24所示下游引物組成。

本發(fā)明所述彩葉欒樹品種選自錦葉欒、晉欒1號、晉欒2號或晉欒3號。

本發(fā)明根據(jù)欒樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了SSR引物的設(shè)計，并根據(jù)設(shè)計引物的穩(wěn)定性、滲透性、產(chǎn)物的大小以及前后引物的Tm值差異進(jìn)行了初步篩選，獲得96對引物。本發(fā)明利用四個樣本(欒樹樣本B1、B2；全緣葉欒樹樣本B3、B4)對所設(shè)計的96對引物的退火溫度及擴(kuò)增效果進(jìn)行了初步篩選，結(jié)果在96對引物中有92對引物擴(kuò)增出明確條帶，其中27對為具有差異效果的引物，在總引物中占據(jù)了28％的比例，證明本發(fā)明所述SSR引物具有一定的多態(tài)性。

本發(fā)明進(jìn)一步通過對六個樣本(欒樹的四個變異品種錦葉欒、晉欒1號、晉欒2號和晉欒3號；2個欒樹樣本為對照)進(jìn)行SSR擴(kuò)增反應(yīng)，對欒樹的四個變異品種的特異SSR標(biāo)記進(jìn)行篩選。在初步篩選結(jié)果中，96對引物中共有25對引物在六個樣本中具有疑似不一致的擴(kuò)增效果，表現(xiàn)形式主要以條帶長度不一致和部分樣本為兩條相近帶等兩種形式體現(xiàn)。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果，本發(fā)明從上述對欒樹四個品種具有疑似差異擴(kuò)增效果的引物中選擇差異較為穩(wěn)定、多態(tài)性好的13對引物，用于構(gòu)建彩葉欒樹四個品種的特異指紋圖譜。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了所述的SSR引物在構(gòu)建彩葉欒樹品種指紋圖譜中的應(yīng)用。

本發(fā)明還公開了所述的SSR引物在彩葉欒樹品種鑒定中的應(yīng)用。

本發(fā)明彩葉欒樹品種指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括以下步驟：(1)提取彩葉欒樹樣品的DNA；(2)以提取的DNA為模板，以所述SSR引物為擴(kuò)增引物，建立PCR反應(yīng)體系并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，根據(jù)毛細(xì)管電泳結(jié)果對彩葉欒樹樣品DNA的擴(kuò)增結(jié)果形成引物字母編號加擴(kuò)增條帶長度數(shù)字的帶型編號，即得各個彩葉欒樹品種的指紋圖譜。

如果一份彩葉欒樹樣品經(jīng)同一對引物擴(kuò)增同時出現(xiàn)多條條帶，則依據(jù)分子量從小到大的順序用“-”連接數(shù)字(分子量單位為bp，在這里省略單位，只記錄數(shù)字)。

其中，所述PCR反應(yīng)體系包括：反應(yīng)體系的總體積為25μL，其中，2×PCR MIX 12.5μl，DNA模板2μl，上游引物2μl，下游引物0.5μl，ddH₂O3μl，M13蛋白5μl。所述PCR擴(kuò)增的程序包括：94℃，3min→94℃，30s→(每對引物的退火溫度+1℃)，30s→72℃，40s→94℃，30s→(每對引物的退火溫度+0.5℃)，30s→72℃，40s→[94℃，30s→(每對引物的退火溫度)，30s→72℃，40s]_x35→72℃，7min→4℃，∞。其中，在上游引物5‘端添加核苷酸序列為SEQ ID No.27所示的M13蛋白的序列，然后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每對引物的退火溫度為：引物對1的退火溫度為53℃；引物對2的退火溫度為52℃；引物對3的退火溫度為55℃；引物對4的退火溫度為54℃；引物對5的退火溫度為56℃；引物對6的退火溫度為54℃；引物對7的退火溫度為52℃；引物對8的退火溫度為55℃；引物對9的退火溫度為55℃；引物對10的退火溫度為55℃；引物對11的退火溫度為53℃；引物對12的退火溫度為53℃；引物對13的退火溫度為52℃。

本發(fā)明將所篩選的差異較為穩(wěn)定、多態(tài)性好的13對引物，按照固定順序用大寫字母編號，引物對1-13編號依次為A、B、C……M，通過毛細(xì)管電泳的結(jié)果，記錄每份彩葉欒樹樣品經(jīng)不同SSR引物對擴(kuò)增出現(xiàn)的條帶，依據(jù)長度從小到大的順序記錄各條帶的長度(單位為bp，在這里省略單位bp，只記錄數(shù)字)；如果一份彩葉欒樹樣品經(jīng)同一對引物擴(kuò)增同時出現(xiàn)多條條帶，則用“-”連接數(shù)字。每個彩葉欒樹樣品的DNA經(jīng)不同引物擴(kuò)增后將會形成由字母和阿拉伯?dāng)?shù)字組成的一系列帶型編號，便形成了該品種的SSR指紋圖譜。

本發(fā)明還公開了所述構(gòu)建方法構(gòu)建得到的彩葉欒樹品種指紋圖譜。

其中，所述錦葉欒的指紋圖譜為：C243-249D291-293F302H241I232L256；所述晉欒1號的指紋圖譜為：B128-194C249D291-293F302H247I232L256；所述晉欒2號的指紋圖譜為：B128-134-194-203C243-247D291-293F302H247-256I232L256；所述晉欒3號的指紋圖譜為：B128-134-194-203C249D293F302H241-256I232L256。其中，B為引物對2的字母編號，C為引物對3的字母編號，D為引物對4的字母編號，F(xiàn)為引物對6的字母編號，H為引物對8的字母編號，I為引物對9的字母編號，L為引物對12的字母編號；數(shù)字為擴(kuò)增條帶的分子量。例如錦葉欒的指紋圖譜中C243-249，則表示錦葉欒經(jīng)C引物(即引物對3)擴(kuò)增出現(xiàn)了長度分別為243bp和249bp的2條條帶。

本發(fā)明還公開了一種用于彩葉欒樹品種鑒定的試劑盒，包括：PCR擴(kuò)增引物，2×PCR MIX和ddH₂O，其中所述PCR擴(kuò)增引物包括：引物對1-引物對13；優(yōu)選的，包括引物對2、引物對3、引物對4、引物對6、引物對8、引物對9和引物對12。本發(fā)明所述試劑盒能夠用于彩葉欒樹品種錦葉欒、晉欒1號、晉欒2號和晉欒3號的準(zhǔn)確鑒定。

本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

本發(fā)明利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了欒樹屬植物SSR標(biāo)記的開發(fā)。本發(fā)明從所設(shè)計的96對SSR引物中篩選出差異較為穩(wěn)定、多態(tài)性好的13對引物，構(gòu)建了四個彩葉欒樹品種的特異指紋圖譜，將為四個具備重要觀賞價值的欒樹品種的推廣和規(guī)劃奠定良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明所述SSR引物以及用其所構(gòu)建的指紋圖譜對欒樹屬植物的品種篩選和優(yōu)良樹種的選育等具有重要的價值。

附圖說明

圖1為部分引物在欒樹六個樣品中擴(kuò)增出的效果；其中，(a)為引物11、17、27、29對欒樹六個樣本的擴(kuò)增結(jié)果，其中17號引物在B2、A1、A2三個樣本中擴(kuò)增出兩條相近的條帶，在其余樣本中擴(kuò)增出單條帶；(b)為引物13、16、26、36對欒樹六個樣本的擴(kuò)增結(jié)果，其中引物13在六個樣本中均擴(kuò)增出雙條帶，但條帶亮度并不明顯；(c)為引物21、23、24、30對欒樹六個樣本的擴(kuò)增結(jié)果，其中引物21在A2、A4樣本中擴(kuò)增條帶與其余樣本有細(xì)微差異，引物30在樣本A3中擴(kuò)增條帶與其余樣本有細(xì)微差異；(d)為引物48、67、73、81對欒樹六個樣本的擴(kuò)增結(jié)果，其中67號引物在A3、A4兩個樣本中擴(kuò)增條帶與其余樣本有細(xì)微差異；(e)為引物56、59、60、61對欒樹六個樣本的擴(kuò)增結(jié)果，其中引物60在B2、A2、A5三個樣本中均擴(kuò)增出兩條相近條帶，其余樣本擴(kuò)增出單條帶；(f)為引物70、82、83、87對欒樹六個樣本的擴(kuò)增結(jié)果，其中引物70、87未擴(kuò)增出明確條帶，引物82在B2樣本中擴(kuò)增出雙條帶，在A1樣本中擴(kuò)增出與其他樣本大小不一致的單條帶；(g)為引物71、74、75、85對欒樹六個樣本的擴(kuò)增結(jié)果，其中引物71在B2、A1樣本中擴(kuò)增出與其他樣本不一致的單條帶，引物74在A5樣本中擴(kuò)增出兩條近似帶，在其余樣本中擴(kuò)增出單條帶；

圖2為部分毛細(xì)管電泳結(jié)果圖(Gel Image)；其中，(a)、(b)、(c)分別為經(jīng)由軟件GeneMarker處理后引物17、48、92的毛細(xì)管電泳膠圖顯示結(jié)果，縱坐標(biāo)為樣本序號(1-7依次為樣本B1、B2、A1、A2、A3、A4、A5)，橫坐標(biāo)為條帶長度，方框中為擴(kuò)增差異的條帶；

圖3為部分毛細(xì)管電泳結(jié)果圖；其中，(a)、(b)、(c)分別為經(jīng)由軟件GeneMarker處理后引物17、48、92的毛細(xì)管電泳峰圖顯示結(jié)果；縱坐標(biāo)代表了引物在樣本中的擴(kuò)增效果，橫坐標(biāo)代表了擴(kuò)增條帶的長度；Sample1-7依次為樣本B1、B2、A1、A2、A3、A4、A5；

圖4為部分毛細(xì)管電泳結(jié)果圖；其中，(a)、(b)、(c)、(d)分別為經(jīng)由軟件GeneMarker處理后引物13、23、69、71的毛細(xì)管電泳峰圖顯示結(jié)果；縱坐標(biāo)代表了引物在樣本中的擴(kuò)增效果，橫坐標(biāo)代表了擴(kuò)增條帶的長度；Sample 1-7依次為樣本B1、B2、A1、A2、A3、A4、A5。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實施例1用于構(gòu)建欒樹指紋圖譜的SSR引物設(shè)計及篩選

1、材料與方法

1.1實驗材料

實驗材料及其來源見表1，錦葉欒未正式命名分種，故沒有列出學(xué)名。材料采集均采用了當(dāng)年生枝條的幼嫩葉片。

表1實驗材料及來源

錦葉欒為欒樹的芽接變種；晉欒1號、2號、3號，均為錦葉欒的種子實生苗選育品種，它們各自具備了與欒樹和錦葉欒所不同的表型性狀，主要表現(xiàn)在葉色、葉片大小以及嫩莖顏色方面，具體表型差異如表2所示。

表2欒樹特異品種的對比

1.2實驗方法

1.2.1基因組DNA的提取

針對材料的來源與生理特性：對于北京地區(qū)的材料采取實驗室內(nèi)水培，取水培枝條上新發(fā)的幼嫩葉片為實驗材料(注：實驗期間室內(nèi)平均溫度為28℃，晝夜溫差為10℃-12℃)；對于山西地區(qū)的實驗材料，實地采取當(dāng)年生葉片，保存于液氮中帶回；取欒樹新鮮葉片約100mg，加入液氮充分研磨后，采取改良的CTAB提取法對欒樹樣本進(jìn)行了DNA提取。

1.2.2SSR-PCR擴(kuò)增

1.2.2.1引物設(shè)計

本發(fā)明SSR引物的設(shè)計采用構(gòu)建基因組文庫，篩選物種的SSR位點，根據(jù)位點兩側(cè)的序列來設(shè)計引物，由之前本發(fā)明人所在實驗室獲得的欒樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了SSR引物的設(shè)計，通過QDD軟件對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后，根據(jù)設(shè)計引物的穩(wěn)定性、滲透性、產(chǎn)物的大小以及前后引物的Tm值差異進(jìn)行了初步篩選，獲得并合成了96對引物，引物具體情況見表3。由于本發(fā)明設(shè)計引物的來源為轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，故所用SSR標(biāo)記分屬于EST-SSR標(biāo)記。

表3SSR引物

1.2.2.2引物篩選

對于所合成的96對引物，本發(fā)明在實驗最初階段使用四個樣本DNA(B1、B2、B3和B4)進(jìn)行了預(yù)實驗，對于每對引物的退火溫度則采取了三個梯度，以其前后引物Tm值的均值為中間體度，上下各浮動1℃，期望可以獲得96對引物較適的退火溫度，并驗證其具有良好的多態(tài)性。

1.2.2.3SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

一個合適的SSR-PCR反應(yīng)體系對于良好的實驗結(jié)果的獲得是必不可少的。根據(jù)本發(fā)明人實驗室已有的實驗基礎(chǔ)，所采取的PCR反應(yīng)體系在20μl和50μl反應(yīng)體系中進(jìn)行選擇，具體反應(yīng)體系見表4。

表4SSR-PCR反應(yīng)體系

SSR-PCR反應(yīng)程序設(shè)置為兩部分，第一部分以合適的退火溫度上浮1℃為基準(zhǔn)，每個循環(huán)遞減0.5℃，設(shè)置3個循環(huán)；第二部分以合適的退火溫度為基準(zhǔn)，設(shè)置35個循環(huán)，延伸時間均設(shè)置為40s，反應(yīng)完成后，于瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行初步檢測。

1.2.3毛細(xì)管電泳

1.2.3.1設(shè)計引物

從篩選好的引物中選擇差異性穩(wěn)定、多態(tài)性好的幾對引物，重新合成引物，在所有前引物的5‘端添加M13蛋白的序列：TGTAAAACGACGGCCAGT。

1.2.3.2PCR擴(kuò)增

PCR退火溫度和反應(yīng)程序不變，以新合成的帶有熒光蛋白序列的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下表5所示。

表5SSR-PCR反應(yīng)體系(加入熒光蛋白)

1.2.3.3檢測及數(shù)據(jù)分析

PCR反應(yīng)完成后，先進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶確認(rèn)無誤后，送入公司進(jìn)行檢測，獲得峰圖后進(jìn)行統(tǒng)計與列表。

1.2.4指紋圖譜構(gòu)建

指紋圖譜的構(gòu)建方法參考李瑞峰等(李瑞峰,高鵬,朱子成,欒非時.基于形態(tài)學(xué)標(biāo)記及SSR標(biāo)記的甜瓜主栽品種分類鑒定研究[J].中國蔬菜,2014,06:20-27.)的指紋圖譜構(gòu)建方法，從篩選好的引物中選擇出差異較為穩(wěn)定、多態(tài)性好的引物對，將其按照固定順序用大寫字母編號，通過利用毛細(xì)管電泳的結(jié)果，記錄每對引物對七個欒樹樣品擴(kuò)增結(jié)果，對四個彩葉欒樹品種樣品的DNA形成字母加數(shù)字的帶型編號，將其作為每個品種的指紋圖譜。

2、實驗結(jié)果

2.1SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

通過對樣本B1、B2、B3和B4進(jìn)行的預(yù)實驗，50μl的反應(yīng)體系效果較20μl顯著，能夠很好的避免操作過程中實驗操作的誤差，因此在本發(fā)明后期實驗中均采用50μl反應(yīng)體系。

通過樣本B1、B2、B3和B4對所設(shè)計的96對引物的退火溫度進(jìn)行了初步探索，對其效果進(jìn)行了初步篩選，在96對引物中有92對引物擴(kuò)增出明確條帶，其中27對為具有差異效果的引物，在總引物中占據(jù)了28％的比例，因此可認(rèn)定本發(fā)明所用引物具有一定的多態(tài)性。

SSR-PCR反應(yīng)程序：94℃，3min→94℃，30s→(合適的退火溫度+1℃)，30s→72℃，40s→94℃，30s→(合適的退火溫度+0.5℃)，30s→72℃，40s→[94℃，30s→(合適的退火溫度)，30s→72℃，40s]_x35→72℃，7min→4℃，∞。每對引物合適的退火溫度及擴(kuò)增情況，則如表6所示。

表6SSR引物退火溫度及擴(kuò)增情況總述

2.2欒樹屬植物品種間SSR擴(kuò)增差異

通過對六個樣本B2、A1、A2、A3、A4和A5進(jìn)行SSR擴(kuò)增反應(yīng)，其中B2和A1為對照組，對欒樹的四個變異品種(錦葉欒、晉欒1號、晉欒2號、晉欒3號)的特異SSR標(biāo)記進(jìn)行了篩選。在初步篩選結(jié)果中，96對引物中共有25對引物在六個樣本中具有疑似不一致的擴(kuò)增效果，表現(xiàn)形式主要以條帶長度不一致和部分樣本為兩條相近帶等兩種形式體現(xiàn)(圖1)。

2.3欒樹四個品種指紋圖譜的構(gòu)建

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果，從對于欒樹四個品種具有疑似差異擴(kuò)增效果的引物中選取了13對引物，進(jìn)行了毛細(xì)管電泳；根據(jù)毛細(xì)管電泳結(jié)果詳細(xì)得出了每對引物在各個品種中擴(kuò)增條帶的長度，并結(jié)合引物的字母編號得出了四個品種的特異指紋圖譜。

指紋圖譜構(gòu)建所用引物的字母編號具體如表7所示，各個品種的指紋圖譜如表8所示，部分毛細(xì)管電泳結(jié)果如圖2、圖3和圖4所示。

表7指紋圖譜構(gòu)建所用引物字母編號

表8欒樹四個品種的指紋圖譜

引物13(字母編號為B)雖然在樣本A2(錦葉欒)中擴(kuò)增出128bp和194bp長度的峰，但其峰值較低(峰值至少在500bp以上才有價值)，且對樣本A2用引物13進(jìn)行重復(fù)驗證，發(fā)現(xiàn)其峰值一直持續(xù)保持在低水平。因此為保證實驗的準(zhǔn)確性，本發(fā)明舍棄了引物13在樣本A2中的擴(kuò)增結(jié)果，將其擴(kuò)增出的兩個峰視為引物不特異造成的。