一種痰熱清膠囊指紋圖譜的建立方法及其指紋圖譜的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種痰熱清膠囊指紋圖譜的建立方法及其指紋圖譜。本發(fā)明的痰熱清膠囊由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花、連翹五種提取物組成，通過采用高效液相色譜法檢測痰熱清膠囊成分建立痰熱清膠囊指紋圖譜；色譜條件為：色譜柱為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充材料；以乙腈?0.2％甲酸水溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.8～1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：280nm。采用本發(fā)明的建立方法，獲得的指紋圖譜中有16個(gè)共有特征峰，檢測到的化學(xué)成分較多，避免了因測定個(gè)別化學(xué)成分而判定痰熱清膠囊整體質(zhì)量的片面性，從而保證產(chǎn)品的安全有效，且具有操作簡便、結(jié)果穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、精密度高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種痰熱清膠囊指紋圖譜的建立方法及其指紋圖譜
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及藥物分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種痰熱清膠囊指紋圖譜的建立方 法及其指紋圖譜。
【背景技術(shù)】
[0002] 痰熱清膠囊由黃芩(君藥）、熊膽粉(臣藥）、山羊角（臣藥）、金銀花(佐藥）、連翹(使 藥)制成，全方五味中藥互相配伍，具有疏風(fēng)清熱、化痰解毒之功效，主要用于風(fēng)溫肺熱病屬 風(fēng)熱襲肺證，癥見發(fā)熱、惡風(fēng)、咳嗽、咯痰，或咽痛、流涕、口干等。
[0003] 痰熱清膠囊現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅采用薄層色譜法，以熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、丙氨 酸、苯丙氨酸、綠原酸作為對照品，以金銀花、連翹作為對照藥材，分別進(jìn)行定性鑒別，同時(shí) 采用高效液相色譜法對痰熱清膠囊中黃芩苷和熊去氧膽酸兩個(gè)成分進(jìn)行定性鑒別和含量 測定，質(zhì)控指標(biāo)成分較少，無法全面表征中藥復(fù)方制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)以及化學(xué)成分群的整體 性和復(fù)雜性，因此，有必要建立痰熱清膠囊的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，從而較全面有效地控制痰熱清 膠囊的的內(nèi)在質(zhì)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種痰熱清膠囊指紋圖譜的建立方法，該方法操作簡便、結(jié) 果穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、精密度高。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種采用建立方法得到的痰熱清膠囊指紋圖譜。該指 紋圖譜能夠更全面表征痰熱清膠囊的物質(zhì)基礎(chǔ)以及化學(xué)成分群的整體性和復(fù)雜性。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。
[0007] 本發(fā)明提供一種痰熱清膠囊指紋圖譜的建立方法，所述痰熱清膠囊由黃芩、熊膽 粉、山羊角、金銀花、連翹組成;通過采用高效液相色譜法檢測痰熱清膠囊成分建立痰熱清 膠囊指紋圖譜，具體步驟如下：
[0008] 1)制備對照品溶液:取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異連翹酯苷A、連翹酯 苷A、野黃芩苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、連翹苷、千層紙素A-7-0-葡萄糖 醛酸苷、白楊素-7-0-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷和黃芩素，加甲醇制成各個(gè)對照品濃度為100 yg/mL的混標(biāo)溶液，作為對照品溶液，對照品溶液中每個(gè)對照品的濃度均為100μg/ml;
[0009] 2)制備供試品溶液:取痰熱清膠囊內(nèi)容物1 Omg，加70%甲醇lmL，超聲lOmin，離心， 取上清溶液，經(jīng)〇. 22mi微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液；
[0010] 3)制作痰熱清膠囊指紋圖譜:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液注入高效液 相色譜儀，根據(jù)以下色譜條件進(jìn)行測定，記錄90分鐘的色譜圖，得到指紋圖譜;其中：所述色 譜條件為：
[0011]采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱;柱溫為30°C;檢測波長為280nm;以 乙腈為A相，0.2 %甲酸水溶液為B相組成流動(dòng)相，采用梯度洗脫方式，其洗脫時(shí)間、流動(dòng)相體 積和流速分別為：
[0012] 〇-l〇min，A相：10-12%、B相：90-88%，流速為 1.0mL/min;
[0013] l〇-15min，A相：12-12%、B相：88-88%，流速為l.OmL/min;
[0014] 15-20min，A相：12-19%、B相：88-81 %，流速為 1 ? OmL/min;
[0015] 20-38min，A相：19-20%、B相：81-80%，流速為 1 ? OmL/min;
[0016] 38-40min，A相：20-30%、B相：80-70%，流速為 1 ? 0-0 ? 8mL/min;
[0017] 40-60min，A相：30-30%、B相：70-70%，流速為0 ? 8mL/min;
[0018] 60-65min，A相：30-90%、B相：70-10%，流速為0 ? 8-1 ? OmL/min;
[0019] 65-75min，A相：90-90%、B相：10-10%，流速為 1 ? OmL/min;
[0020] 75-80min，A相：90-10%、B相：10-90%，流速為 1 ? OmL/min;
[0021 ] 80-90min，A相：10-10%、B相：90-90%，流速為 1 ? OmL/min。
[0022] 上述表述，洗脫時(shí)間為38_40min時(shí)，流速由1 .Oml/min變?yōu)?.8ml/min。洗脫時(shí)間為 60_65min 時(shí)，流速由 0 ? 8ml/min 變?yōu)?1 ? Oml/min。
[0023] 本發(fā)明還提供一種上述的痰熱清膠囊指紋圖譜的建立方法得到的指紋圖譜，所述 建立方法得到的指紋圖譜中共有16個(gè)特征峰，其中10號峰為對照品異綠原酸C，各峰以10號 峰為參照峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積如下：
[0024] 相對保留時(shí)間：
[0025] 峰1:0.190~0.191;峰2:0.305~0.306;峰3:0.336~0.337;峰4:0.414~0.415; 峰5:0.628~0.630;峰6:0.668~0.670;峰7:0.717~0.718;峰8:0.794~0.796;峰9:0.846 ~0.847;峰10:1.000;峰11:1.109~1.003;峰12:1.137~1.140;峰13:1.222~1.225;峰 14:1.231~1.234;峰15:1.297~1.301;峰16:1.565~1.571;
[0026] 相對峰面積：
[0027] 峰1:0.116~0.119;峰2:0.633~0.651;峰3:0.233~0.244;峰4:0.211~0.217; 峰5:0?634~0?650;峰6:1?306~1?368;峰7:0?636~0?655;峰8:0?561~0?588;峰9:0?505 ~0.527;峰10:1.000;峰11:52.040~54.917;峰12:0.204~0.212;峰13:1.518~1.559;峰 14:0.723~0.746;峰15:0.139~0.148;峰16:1.385~1.452。
[0028] 本發(fā)明中，通過對所述痰熱清膠囊復(fù)方與全方藥材的相關(guān)性研究，確認(rèn)了所述痰 熱清膠囊指紋圖譜中16個(gè)特征峰的來源，其中對應(yīng)于原料藥，7、11、13、14、15、16號峰歸屬 于痰熱清膠囊中的黃芩，1、2、3、4、8、9、10號峰歸屬于金銀花，5、6、12號峰歸屬于連翹;并 且，采用與按照痰熱清膠囊指紋圖譜測定方法獲取的對照品指紋圖譜比對，利用相同成分 色譜峰保留時(shí)間的一致性，進(jìn)行色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，其中，1號峰為新綠原酸、2號峰為綠原酸、 3號峰為隱綠原酸、4號峰為咖啡酸、5號峰為異連翹酯苷A、6號峰為連翹酯苷A、7號峰為野黃 芩苷、8號峰為異綠原酸B、9號峰為異綠原酸A、10號峰為異綠原酸C、ll號峰為黃芩苷、12號 峰為連翹苷、13號峰為千層紙素A-7-0-葡萄糖醛酸苷、14號峰為白楊素-7-0-葡萄糖醛酸 苷、15號峰為漢黃苳苷、16號峰為黃苳素。
[0029] 在檢測待測產(chǎn)品痰熱清膠囊，如痰熱清膠囊的質(zhì)量時(shí)，可以將待測產(chǎn)品的指紋圖 譜與上文所獲得的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比較，計(jì)算相似度，識別兩者所具有的特征峰的數(shù)量， 以確定廣品是否合格。
[0030] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0031] 1)本發(fā)明指紋圖譜建立方法對供試品的前處理方法簡單，具有操作簡便、結(jié)果穩(wěn) 定、重現(xiàn)性好、精密度高等優(yōu)點(diǎn)。
[0032] 2)本發(fā)明指紋圖譜中特征性成分保留完整，具有16個(gè)共有峰，且對其進(jìn)行了指認(rèn) 和歸屬分析，各特征峰分離效果較好，能夠較全面的反映出產(chǎn)品的質(zhì)量信息，有利于全面監(jiān) 控產(chǎn)品質(zhì)量，及鑒別產(chǎn)品的真?zhèn)巍?br>[0033] 3)在相同測試條件下，所提供的痰熱清膠囊指紋圖譜建立方法可獲取痰熱清膠囊 中以黃芩、金銀花和連翹有效成分為特征的高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
【附圖說明】
[0034]圖1為實(shí)施例3中痰熱清膠囊內(nèi)容物HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
[0035]圖2為實(shí)施例4中不同流動(dòng)相系統(tǒng)考察HPLC圖（1:0.2%甲酸-甲醇，2:0.2%甲酸-乙腈，3:0.1%甲酸-乙腈，4:水-乙腈）。
[0036] 圖3為實(shí)施例4中不同色譜柱考察HPLC圖（Ultimate XB-C18柱，2:Shiseido Capcell PAK C18-MG柱，3:Agilent Zorbax SB-C18柱）〇
[0037] 圖4為實(shí)施例4中不同柱溫考察HPLC圖（1:35°C，2:30°C，3:25°C)。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié) 合具體實(shí)施例和附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但下述實(shí)施例僅僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并非 全部?；趯?shí)施方式中的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所獲得 的其他實(shí)施例，都屬于本專利的保護(hù)范圍。
[0039] 以下各實(shí)施例中所使用的對照品來源如下：
[0040] 綠原酸（批號140601)、新綠原酸（批號X-014-140801)、隱綠原酸（批號Y-067-140801)、異綠原酸4(批號140615)、異綠原酸8(批號￥-069-141122-1)、異綠原酸(：(批號￥-070-140801 )、咖啡酸（批號MUST-14100803)、黃芩苷（批號150517)、野黃芩苷（批號 150024)、千層紙素A-7-0-葡萄糖醛酸苷(批號141007)、白楊素-7-0-葡萄糖醛酸苷（批號 MUST-15011215 )、連翹苷(批號150118 )、連翹酯苷A (批號L-012-140730 )、異連翹酯苷A (批 號Y-184-140801)、漢黃芩苷(批號141214)、黃芩素(批號150320)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均彡98%，均購 自上海欣拓貿(mào)易有限公司。
[00411以下各實(shí)施例中所使用的供試品痰熱清膠囊(批號S1:1406101、S2:1407101、S3: 1407102)，S1批膠囊的黃芩提取物(批號1405101)、熊膽提取物(批號1405101)、山羊角取物 (批號1405101)、金銀花提取物(批號1405101)、連翹提取物(批號1405101)均由上海凱寶藥 業(yè)股份有限公司提供。
[0042]其它儀器及試劑：
[0043] Agilent 1260系列，包括四元栗、UV檢測器、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、工作站，美國安 捷倫公司；BT25S電子分析天平，德國Sartorius公司；Vortex Mixer禍旋儀，美國Labnet公 司；Sorvall Legend Micro 21R離心機(jī)，美國Thermo公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲儀，昆山市 超聲儀器有限公司。
[0044] 乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，美國Fisher公司；水為超純水。
[0045]實(shí)施例1采用HPLC法建立痰熱清膠囊內(nèi)容物的指紋圖譜
[0046] 對照品溶液的制備:取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異連翹酯苷A、連翹酯 苷A、野黃芩苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、連翹苷、千層紙素A-7-0-葡萄糖 醛酸苷、白楊素-7-0-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素對照品適量，加甲醇制成每個(gè)對照品 濃度為1 〇〇yg/mL的混標(biāo)溶液，作為對照品溶液。
[0047 ] 供試品溶液的制備:取痰熱清膠囊內(nèi)容物約1 Omg，加7 0 %甲醇1 mL，超聲1 Om i n，離 心，取上清溶液，經(jīng)〇. 22mi微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。
[0048] 指紋圖譜的測定:精密吸取對照品溶液與供試品溶液注入高效液相色譜儀，按照 高效液相色譜法測定，得到痰熱清膠囊內(nèi)容物HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，其中測定色譜條件包括：
[0049] 色譜柱為Ultimate XB-C18柱（5wii，4.6mmX250mm);檢測波長為280nm;柱溫：30 °C ;進(jìn)樣量：10此。流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.2%甲酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序見 下表1，其中流動(dòng)性比例均為體積百分比：
[0050] 表1梯度洗脫程序表
[0052]實(shí)施例2指紋圖譜建立方法的方法學(xué)考察 [0053] 1)精密度試驗(yàn)
[0054] 采用和實(shí)施例1相同的操作和條件，精密吸取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察 色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的一致性。以異綠原酸C(10號峰)為參照峰，計(jì)算其中各 個(gè)色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。
[0055] 結(jié)果表明，各個(gè)色譜峰相對保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均低于0.5%，各個(gè)色譜 峰相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均低于2.0%，符合指紋圖譜要求。
[0056] 2)穩(wěn)定性考察
[0057]采用和實(shí)施例1相同的操作和條件，制備供試品溶液，溫室封閉放置，分別在0、2、 4、8、12、24h進(jìn)樣分析，考察色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的一致性。以異綠原酸C(10 號峰)為參照峰，計(jì)算其中各個(gè)色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。
[0058]結(jié)果表明，各個(gè)色譜峰相對保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均低于0.5%，各個(gè)色譜 峰相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均低于1.7%，表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。
[0059] 3)重復(fù)性試驗(yàn)
[0060] 采用和實(shí)施例1相同的操作和條件，取同一批號樣品，制備供試品溶液6份，考察色 譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的一致性。
[0061] 結(jié)果表明，各個(gè)色譜峰相對保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均低于0.5%，各個(gè)色譜 峰相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均低于2.8%，符合指紋圖譜要求。
[0062 ]實(shí)施例3痰熱清膠囊內(nèi)容物的對照指紋圖譜的建立
[0063] 按照實(shí)施例1所述方法對S1至S3批次痰熱清膠囊內(nèi)容物進(jìn)行分析測定，獲得指紋 圖譜。
[0064] 所獲得指紋圖譜中共有16個(gè)特征峰，以10號峰為參照峰，16個(gè)特征峰的相對保留 時(shí)間范圍分別為:峰1:0.190~0.191;峰2:0.305~0.306;峰3:0.336~0.337;峰4:0.414~ 0?415;峰5:0?628~0?630;峰6:0?668~0?670;峰7:0?717~0?718;峰8:0?794~0?796;峰 9:0.846~0.847;峰10:1.000;峰11:1.109~1.003;峰12:1.137~1.140;峰13:1.222~ 1.225;峰14:1.231~1.234;峰15:1.297~1.301;峰16:1.565~1.571;
[0065] 通過對痰熱清膠囊與組成復(fù)方的各個(gè)藥材進(jìn)行相關(guān)性研究：采用HPLC法，按照痰 熱清膠囊指紋圖譜測定方法獲取痰熱清膠囊供試品、各個(gè)藥材樣品以及其陰性復(fù)方供試品 的指紋圖譜，利用色譜保留時(shí)間相對偏差指標(biāo)考察其相關(guān)性，對痰熱清膠囊化學(xué)指紋圖譜 的峰歸屬進(jìn)行分析;在此基礎(chǔ)上，取綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異 綠原酸C、咖啡酸、黃芩苷、野黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、千層紙素A-7-0-葡萄糖醛酸苷、白 楊素-7-0-葡萄糖醛酸苷、連翹苷、連翹酯苷A、異連翹酯苷A對照品，制成單一成分的對照品 溶液，分別按照痰熱清膠囊指紋圖譜測定方法獲取指紋圖譜，利用相同成分色譜峰保留時(shí) 間的一致性確定各成分;經(jīng)分析比較確定16個(gè)特征峰的來源，其中對應(yīng)于原料藥，7、11、13、 14、15、16號峰歸屬于痰熱清膠囊中的黃芩，1、2、3、4、8、9、10號峰歸屬于金銀花，5、6、12號 峰歸屬于連翹;并且，1號峰為新綠原酸、2號峰為綠原酸、3號峰為隱綠原酸、4號峰為咖啡 酸、5號峰為異連翹酯苷A、6號峰為連翹酯苷A、7號峰為野黃芩苷、8號峰為異綠原酸B、9號峰 為異綠原酸A、10號峰為異綠原酸C、ll號峰為黃芩苷、12號峰為連翹苷、13號峰為千層紙素 A-7-0-葡萄糖醛酸苷、14號峰為白楊素-7-0-葡萄糖醛酸苷、15號峰為漢黃芩苷、16號峰為 黃芩素。
[0066]將這3批痰熱清膠囊內(nèi)容物的HPLC色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià) 系統(tǒng)》(2.0版)軟件中，進(jìn)行色譜峰匹配，軟件自動(dòng)生成痰熱清膠囊內(nèi)容物的對照指紋圖譜， 見圖1，并獲得3批痰熱清膠囊內(nèi)容物的相似度，結(jié)果為3批痰熱清膠囊供試品的相似度均為 1.000。以10號峰(異綠原酸C)為參照峰(S)，計(jì)算各個(gè)色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積結(jié) 果見表2。
[0067] 本發(fā)明提供的對照指紋圖譜可用于檢測痰熱清膠囊的質(zhì)量，可以計(jì)算待測樣品的 指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度，如果相似度大于0.900，則為合格產(chǎn)品。
[0068] 表2 3批痰熱清膠囊內(nèi)容物共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積
[0070] 實(shí)施例4色譜條件的選擇和優(yōu)化
[0071] 由于痰熱清膠囊為復(fù)方，成分復(fù)雜，在確定本發(fā)明的色譜條件之前，進(jìn)行多次比較 實(shí)驗(yàn)。主要包括：
[0072] 1)流動(dòng)相系統(tǒng)的考察
[0073]由于痰熱清膠囊的化學(xué)成分復(fù)雜且極性較大，采用等度洗脫時(shí)各組分峰分離不理 想，不能有效檢測樣品中的各成分峰，故選擇梯度洗脫進(jìn)行色譜分離，分別考察了〇 . 2 %甲 酸-甲醇、0.2%甲酸-乙腈、0.1%甲酸-乙腈以及水-乙腈等不同流動(dòng)相系統(tǒng)，色譜圖見圖2， 經(jīng)過比較四種不同流動(dòng)相系下統(tǒng)獲得的色譜圖，0.2%甲酸-乙腈的流動(dòng)相系統(tǒng)獲得的圖譜 基線平穩(wěn)、各峰分布均勻、分離效果較好，因此選擇0.2%甲酸-乙腈作為流動(dòng)相。
[0074] 2)色譜柱的考察
[0075]分別使用Ultimate XB_C18(5iim，4.6mmX250mm)柱、Shiseido Capcell PAK C18-MG(5tim，4.6mmX250mm)柱、Agilent Zorbax SB_C18(5iim，4.6mmX250mm)柱三種色譜柱對 樣品進(jìn)行測定，色譜圖見圖3,由圖可知，Ultimate XB-C18(5iim，4.6mmX250mm)柱對成分的 保留分離效果較好，因此選用Ultimate XB_C18(5iim，4.6mmX250mm)柱。
[0076] 3)柱溫的考察
[0077] 分別使用柱溫25°C、30°C、35°C對樣品進(jìn)行測定，色譜圖見圖4,由圖可知，柱溫為 30°C時(shí)，各峰分布均勻，分離度較好，因此選擇柱溫為30°C。
[0078]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的特點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的僅為本發(fā)明 的優(yōu)選例，并不用來限制本發(fā)明，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種 變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所 附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種痰熱清膠囊指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述痰熱清膠囊由黃芩、熊膽 粉、山羊角、金銀花和連翹組成;通過采用高效液相色譜法檢測痰熱清膠囊成分建立痰熱清 膠囊指紋圖譜，具體步驟如下： 1) 制備對照品溶液:取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、 野黃芩苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、連翹苷、千層紙素 A-7-0-葡萄糖醛酸 苷、白楊素-7-0-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷和黃芩素，加甲醇制成各個(gè)對照品濃度為IOOyg/ mL的混標(biāo)溶液，作為對照品溶液； 2) 制備供試品溶液:取痰熱清膠囊內(nèi)容物IOmg，加70 %甲醇ImL，超聲IOmin，離心，取上 清溶液，經(jīng)0.22μπι微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液； 3) 制作痰熱清膠囊指紋圖譜:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液注入高效液相色 譜儀，根據(jù)以下色譜條件進(jìn)行測定，記錄90分鐘的色譜圖，得到指紋圖譜;其中：所述色譜條 件如下： 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱;柱溫為30°C;檢測波長為280nm;以乙腈 為A相，0.2%甲酸水溶液為B相組成流動(dòng)相，采用梯度洗脫方式，其洗脫時(shí)間、流動(dòng)相體積和 流速分別為： O-IOmin，A相：10-12%、B相：90-88%，流速為 1.0mL/min; 10-15min，A相：12-12 %、B相：88-88 %，流速為 1 · OmL/min; 15-20min，A相：12-19 %、B相：88-81 %，流速為 1 · OmL/min; 20-38min，A相：19-20 %、B相：81-80 %，流速為 1 · OmL/min; 38-40min，A相：20-30 %、B相：80-70 %，流速為 1 · 0-0 · 8mL/min; 40-60min，A相：30-30 %、B相：70-70 %，流速為O · 8mL/min; 60-65min，A相：30-90 %、B相：70-10 %，流速為O · 8-1 · OmL/min; 65-75min，A相：90-90 %、B相：10-10 %，流速為 1 · OmL/min; 75-80min，A相：90-10 %、B相：10-90 %，流速為 1 · OmL/min; 80-90min，A相：10-10 %、B相：90-90 %，流速為 1 · OmL/min。2. -種如權(quán)利要求1所述的痰熱清膠囊指紋圖譜的建立方法得到的指紋圖譜，其特征 在于，所述建立方法得到的指紋圖譜中共有16個(gè)特征峰，其中10號峰為對照品異綠原酸C， 各峰以10號峰為參照峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積如下： 相對保留時(shí)間： 峰I:O·190~O·191;峰2:O·305~O·306;峰3:O·336~O·337;峰4:O·414~O·415;峰5: O·628~O·630;峰6:O·668~O·670;峰7:O·717~O·718;峰8:O·794~O·796;峰9:O·846~ 0.847;峰10:1.000;峰11:1.109~1.003;峰12:1.137~1.140;峰13:1.222~1.225;峰14: 1.231~1.234;峰15:1.297~1.301;峰16:1.565~1.571; 相對峰面積： 峰I:O·116~O·119;峰2:0·633~O·651;峰3:0·233~O·244;峰4:0·211~O·217;峰5: O·634~O·650;峰6:1·306~1·368;峰7:O·636~O·655;峰8:O·561~O·588;峰9:O·505~ 0.527;峰10:1.000;峰11:52.040~54.917;峰12:0.204~0.212;峰13:1.518~1.559;峰 14:0.723~0.746;峰15:0.139~0.148;峰16:1.385~1.452。
【文檔編號】G01N30/02GK105891353SQ201610192503
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年3月30日
【發(fā)明人】徐英, 劉紹勇, 薛東升, 鐘蘋蘋, 張小利
【申請人】上海凱寶藥業(yè)股份有限公司