專利名稱：一種土壤和沉積物總dna提取方法及提取試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于土壤微生物基因組DNA分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種土壤和沉積物總DNA提取方法及提取試劑盒。
背景技術(shù)：
分子指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)成為微生物生態(tài)學(xué)、環(huán)境生物學(xué)、環(huán)境工程學(xué)等領(lǐng)域普遍應(yīng)用的微生物生態(tài)學(xué)技術(shù)，然而環(huán)境樣品中(如土壤、海洋和湖泊沉積物等)總DNA的提取技術(shù)作為該技術(shù)體系的關(guān)鍵步驟和核心內(nèi)容，已經(jīng)受到人們的廣泛關(guān)注。土壤和沉積物中總DNA提取的特異性、濃度、純度等直接影響到微生物群落結(jié)構(gòu)的客觀真實(shí)性，是近年來國外期刊審稿過程中爭議較多的內(nèi)容之一。目前，對于從土壤和沉積物中獲取總DNA，仍沒有一致認(rèn)同的較佳方法，而普遍應(yīng)用的酶裂解法、化學(xué)藥品提取法等只能針對樣品中的敏感菌起作用，而且無法去除樣品中的腐殖酸。這些方法均人為的改變了環(huán)境中真實(shí)的微生物群落結(jié)構(gòu)，且存在以下問題1) DNA提取過程繁雜，時間過長，且需要較多的大型儀器設(shè)備，如酶提取法需要長時間的水浴過程；幻一般DNA提取過程往往應(yīng)用高毒高污染的化學(xué)試劑，如DNA純化過程中應(yīng)用酚/氯仿等“三致”試劑；幻提取的DNA質(zhì)量較差，碎片較多，存在腐殖酸、RNA、蛋白質(zhì)等污染；4) DNA的量太少，尤其是從沉積物中獲取DNA，無法滿足下游實(shí)驗(yàn)的需要。因此，建立一種有效的從土壤和沉積物中提取總DNA的方法已成為當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速從土壤和沉積物中獲得總DNA的方法，并提供成套的試劑盒新產(chǎn)品，應(yīng)用該試劑盒，研究者可以快速從環(huán)境樣品中獲得需要的DNA，以進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)研究。本發(fā)明首先應(yīng)用腐殖酸溶解液，最大程度地溶解和去除土壤和沉積物中的腐殖酸，再將剩余腐殖酸進(jìn)行絡(luò)合沉淀，然后無選擇地釋放所有細(xì)菌體內(nèi)的DNA，離心后去除溶液中的絡(luò)合腐殖酸和蛋白質(zhì)，而含DNA的上清溶液則通過高鹽溶液調(diào)節(jié)后，以硅膠吸附膜特異吸附得以純化回收。本發(fā)明的土壤和沉積物總DNA提取方法，依次包括如下步驟1)用腐殖酸溶解液去除樣品大部分腐殖酸，得到沉淀；2)向上述步驟1)的沉淀樣品中加入腐殖酸絡(luò)合劑，懸浮起沉淀使剩余的腐殖酸充分絡(luò)合，離心使腐殖酸絡(luò)合物和細(xì)菌樣品充分沉淀；3)向上述步驟2)的沉淀中加入細(xì)胞裂解液，漩渦振蕩釋放出細(xì)菌總DNA，離心后得到含細(xì)菌總DNA的上清液；4)向上述步驟幻的上清液中加入酸堿調(diào)節(jié)劑，離心得到去除蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)的上清溶液；5)向上述步驟4)的上清溶液中加入高鹽溶劑后，過硅膠吸附膜吸附DNA;
6)將上述步驟5)吸附的DNA進(jìn)行清洗后，用洗脫液洗脫得到樣品的總DNA。上述的腐殖酸絡(luò)合劑為鈣離子水溶液，優(yōu)選為氯化鈣溶液，為0. 20mol/L, pH 5. 5 7. 5 ；且土壤或沉積物樣品的濕重同鈣離子的添加比例為1. 5g/mmol/L。上述的酸堿調(diào)節(jié)劑為0. 5 1. 5mol/L醋酸鉀，pH 4. 8 5. 0，具有調(diào)節(jié)溶液體系至酸性，以進(jìn)一步沉淀腐殖酸和糖類物質(zhì)，以及變性蛋白質(zhì)的作用。上述的步驟3)漩渦振蕩釋放時間為10 12min。根據(jù)上述的提取方法建立的提取試劑盒，包括如下組分1)腐殖酸溶解液和海砂，其中海砂直徑為1 2mm，海砂和腐殖酸溶解液的質(zhì)量體積比為0. 2 0. 3g/mL ；2)腐殖酸絡(luò)合劑:0. 20mol/L氯化鈣溶液，pH 5. 5 7. 53)細(xì)胞裂解液50 100mmol/L Tris-HCl，1. 5 3. 5mol/L NaCl，l% 3% CTAB, pH 8· 0 10. 0 ；4)變性劑20% SDS，pH 9. 0 ；5)酸堿調(diào)節(jié)劑0. 5 1. 5mol/L醋酸鉀，pH 4. 8 5. 0 ；6)高鹽溶劑:3. 0 6. Omol/L 鹽酸胍，pH 5. 0 8. 0 ；7)清洗液70%乙醇；8)洗脫液2 IOmmol/L Tris-HCl, pH 8. 0 9. 0 ；9)基因組DNA吸附柱包含硅膠吸附膜內(nèi)柱的2mL離心管套裝。依據(jù)本發(fā)明的方法建立的試劑盒可以在70min時間內(nèi)同時提取多個樣品，獲得的 DNA樣品純度高，無降解，可直接用于后續(xù)分子生物學(xué)分析，同時避免了傳統(tǒng)DNA提取方法需要酚/氯仿等毒性試劑純化DNA的步驟，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1 應(yīng)用本發(fā)明試劑盒提取的不同土壤樣品DNA電泳結(jié)果圖。圖2 不同土壤樣品DNA 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果。圖3 不同土壤樣品DNA 16S rRNA基因V3區(qū)PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果。圖4 不同土壤樣品DNA氨氧化菌特異序列PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果。其中，M為marker，各片段標(biāo)注于圖右；1，2，3和4分別為農(nóng)田土、草地土、濕地土、 海洋沉積物，C為陰性對照。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的方法進(jìn)行詳細(xì)描述。本發(fā)明從土壤和沉積物中獲得總DNA的方法，依次包括如下步驟1)用海砂和腐殖酸溶解液來處理樣品，離心得到去除了大部分腐殖酸的沉淀樣
ρ
BFI 取0. 3g直徑1 2mm海砂于2mL的離心管中，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，加入1. 0 1. 5mL 滅菌的腐殖酸溶解液(100 200mmol/L Tris, 50 IOOmmol/LNei4P2O7, 50 IOOmmol/L Na2EDTA, 1. 0 3. 0% PVP，100 200mmol/L NaCl，0· 05 0. Triton X-100， pH 8.0 10.0)，置于室溫備用；
將土壤或沉積物樣品0. 3g加入到裝有腐殖酸溶解液和海砂的離心管中，中速渦旋振蕩1 :3min，完全混勻，使土壤樣品中的腐殖酸充分釋放出，然后IOOOOXg離心30s， 盡量吸棄上清，得到沉淀樣品；2)向上述步驟1)的沉淀樣品中加入腐殖酸絡(luò)合劑，懸浮起沉淀使剩余的腐殖酸充分絡(luò)合，離心使海砂、腐殖酸絡(luò)合物和細(xì)菌樣品充分沉淀向上述步驟1)的沉淀樣品加入ImL 0. 20mol/L氯化鈣溶液，pH 5. 5 7. 5，然后中速渦旋1 3min，完全混勻，IOOOOXg離心30s，盡量吸棄上清，得到含有DNA的沉淀。鈣離子可以與帶負(fù)電荷的大分子有機(jī)物絡(luò)合，形成不溶性沉淀，腐殖酸、蛋白質(zhì)和 DNA等在中性條件下均為帶負(fù)電荷的大分子有機(jī)物，但此時細(xì)菌細(xì)胞尚未破碎，DNA還未釋放，所以加入的鈣離子僅與腐殖酸絡(luò)合形成不溶性沉淀。而其它腐殖酸絡(luò)合試劑，由于不能與腐殖酸形成穩(wěn)定的絡(luò)合物沉淀，在后續(xù)的細(xì)胞裂解中又會使腐殖酸進(jìn)入樣品體系中。本發(fā)明需要選用水溶性好的鈣鹽，優(yōu)選氯化鈣溶液。另外，加入的腐殖酸絡(luò)合劑中的鈣離子濃度也對DNA提取產(chǎn)生重要的影響。鈣離子濃度過低，將使樣品中腐殖酸絡(luò)合不全，而過高又將殘存過多，影響后續(xù)DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量。本研究表明，在步驟1)中，取0.3g 土壤或沉積物的條件下，加入ImL 0.2mol/L氯化鈣溶液(即樣品濕重和鈣離子的比例為1. 5g/mmol/L)就可以將剩余腐殖酸完全絡(luò)合，而對 DNA產(chǎn)量影響較小。3)向上述步驟2)的沉淀中加入細(xì)胞裂解液和變性劑并漩渦振蕩釋放出細(xì)菌總 DNA，離心后得到含細(xì)菌總DNA的上清液沉淀中加入720 μ L 細(xì)胞裂解液 50 100mmol/L Tris-HCl, 1. 5 3. 5mol/LNaCl, l% 3%CTAB，pH 8.0 10.0;和8(^1^變性劑20%505，？!1 9. 0，最大速度漩渦振蕩10 12min，IOOOOXg離心60s，將上清液(< 650 μ L，避免吸取上層氣泡)轉(zhuǎn)移到一個新管內(nèi)；4)向上述步驟幻的上清液中加入酸堿調(diào)節(jié)劑，離心得到去除蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)的上清溶液加入100 μ L酸堿調(diào)節(jié)劑0. 5 1. 5mol/L醋酸鉀，pH 4. 8 6. 0 ；顛倒5次混勻， 4°C靜置5min，10000Xg離心60s，上清(< 700 μ L)移至新管；步驟3)中獲得的上清液小于650 μ L，加入的酸堿調(diào)節(jié)劑為100 μ L，即為得到較理想的酸鹽調(diào)節(jié)效果，二者的體積比需大于6. 5。5)向上述步驟4)的上清溶液中加入高鹽溶劑后，過硅膠吸附膜吸附DNA 向步驟4)的上清溶液中加入1400 μ L高鹽溶劑3. 0 6. Omol/L鹽酸胍，pH5. 0 8.0 ；混勻后，分三次(每次取700 μ L)加入同一硅膠吸附膜吸附DNA，10000 Xg離心30s ；向上述步驟4)獲得的上清溶液中，加入高濃度的鹽溶液與DNA分子競爭有效水分時，DNA分子將被析出而與有機(jī)相中的硅膠吸附膜結(jié)合。鹽酸胍具有鹽的特性，同時可以高濃度溶解于水，這是其他鹽類無法比擬的，這也是本發(fā)明應(yīng)用高濃度鹽酸胍的原因。6)將上述步驟5)吸附的DNA進(jìn)行清洗后，用洗脫液洗脫得到樣品的總DNA 加入700 μ L70%乙醇，IOOOOXg離心60s，去除濾過液后，再離心一次，將吸附柱置于新管，然后用10(^1^洗脫液2 10讓01/1 Tris-HCl,pH 8. 0 9. 0加入到吸附柱中， 于60°C水浴5min，IOOOOXg離心60s，收集濾過液，于_20°C保存。本發(fā)明的提取試劑盒包括如下的組分
1)腐殖酸溶解液和海砂，其中海砂直徑為1 2mm，海砂和腐殖酸溶解液的質(zhì)量體積比為0.2 0. 3g/ml ；2)腐殖酸絡(luò)合劑:0. 20mol/L氯化鈣溶液，pH 5. 5 7. 5 ；3)細(xì)胞裂解液50 100mmol/L Tris-HCl, 1. 5 3. 5mol/LNaCl，1 % 3% CTAB, pH 8. 0 10. 0 ；4)變性劑20% SDS，pH 9. 0 ；5)酸堿調(diào)節(jié)劑0. 5 1. 5mol/L醋酸鉀，pH 4. 8 5. 0 ；6)高鹽溶劑:3. 0 6. Omol/L 鹽酸胍，pH 5. O 8. O ；7)清洗液70%乙醇；8)洗脫液2 IOmmol/L Tris-HCl, pH 8. O 9. O ；9)基因組DNA吸附柱包含硅膠吸附膜內(nèi)柱的2ml離心管套裝。應(yīng)用本試劑盒，僅需要常規(guī)非冷凍型的高速離心機(jī)、漩渦振蕩器、水浴鍋及微量移液器等一般微生物學(xué)、分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)室都具備的簡單設(shè)備，對于熟練研究者，同時提取 6個樣品DNA時間可縮短至70min之內(nèi)，極大的節(jié)省了科研工作者寶貴的時間，同時可獲得高質(zhì)量的DNA樣品，對下游的分子生物學(xué)操作無抑制，表現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力。通過對農(nóng)田土、草地土、濕地土、海洋沉積物中總DNA的提取試驗(yàn)，均得到理想的結(jié)果，并且不影響PCR 擴(kuò)增等后續(xù)分子生物學(xué)分析。實(shí)施例1 腐殖酸絡(luò)合劑濃度的選擇應(yīng)用本試劑盒，以濕地土、海洋沉積物和農(nóng)田土為對象，探討腐殖酸絡(luò)合劑濃度對提取效率的影響。樣品量為0. 3g，其中氯化鈣溶液濃度分別為0，0. 1,0. 2,0. 3,0. 4， 0.5mol/L，各加入1ml，按照本發(fā)明的方法進(jìn)行提取，用時約60min。將提取的DNA進(jìn)行電泳、染色、照相，并應(yīng)用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果表明，氯化鈣溶液濃度分別為0和0. lmol/L時(即樣品濕重和鈣離子的比例彡3g/mmol)，雖然DNA的回收率較高，為 10 15 μ g/g干土，但提取的DNA溶液為黃色，含有大量腐殖酸，表明腐殖酸沒有被完全去除，加入的氯化鈣相對量過低，這樣的DNA樣品將對分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的酶具有極大的抑制作用。同樣，應(yīng)用濃度為0. 3mol/L以上(即樣品濕重和鈣離子的比例彡lg/mmol/L)的氯化鈣溶液為腐殖酸絡(luò)合劑時，雖然DNA溶液透明清澈，但DNA回收率過低，電泳時低于檢測限值，紫外檢測表明低于lOOng/g干土，這表明過高的氯化鈣溶液殘留太多，也絡(luò)合了大量的DNA分子，這樣的DNA樣品無法滿足后續(xù)分子生物學(xué)需要。而加入ImL 0.2mol/L氯化鈣溶液(即樣品和鈣離子的比例為1. 5g/mmol/L)時，不但提取的DNA濃度高(5 7 μ g/ g)，而且質(zhì)量能夠滿足文庫構(gòu)建、變性梯度凝膠電泳(DGGE)等后續(xù)分子生物學(xué)的要求。實(shí)施例2 細(xì)菌細(xì)胞裂解漩渦振蕩時間選擇應(yīng)用本試劑盒，分別以0. 3g濕地土、農(nóng)田土為對象，對加入細(xì)胞裂解液和變性劑后的漩渦振蕩時間做了優(yōu)化。其中腐殖酸絡(luò)合劑用Iml的0. 2mol/L的氯化鈣溶液，pH 7. 5， 細(xì)胞裂解時的漩渦振蕩時間分別選擇5min，lOmin，15min，按照本發(fā)明的方法進(jìn)行提取，用時約70min。DNA電泳、染色、照相，并應(yīng)用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果表明， 振蕩5min的環(huán)境樣品DNA回收率明顯偏低，低于1. 0μ g/g干土 ；而高于15min后，DNA回收率并無明顯增加，且出現(xiàn)了大量的DNA碎片，這對于需要長片段基因組DNA的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是不允許的，所以振蕩時間選取10 12min為宜。
實(shí)施例3 從不同土壤樣品中提取總DNA應(yīng)用本試劑盒和確定的提取條件，分別對農(nóng)田土、草地土、濕地土、海洋沉積物中總DNA進(jìn)行提取試驗(yàn)，按照本發(fā)明的方法進(jìn)行提取，用時約60min。取10 μ L DNA進(jìn)行電泳，凝膠以EB染色，凝膠成像系統(tǒng)照相，并應(yīng)用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定性定量分析，電泳結(jié)果如圖1所示。根據(jù)該圖，該試劑盒可從不同土壤和沉積物中獲得的總DNA，DNA片段長度在10 201Λ，沒有降解，也沒有RNA污染。分別對各樣品進(jìn)行紫外吸收檢測，表明所獲得的 DNA樣品在^Onm處形成均一的DNA吸收峰，在^Onm處沒有明顯的蛋白吸收峰出現(xiàn)，OD260/ OD280 = 1. 8 1. 9，說明獲得的DNA比較純凈，沒有蛋白和RNA污染，計(jì)算得知DNA的回收率為5 12μ g/g干土。為確認(rèn)應(yīng)用本試劑盒提取DNA質(zhì)量能否滿足分子生物學(xué)需要，以獲得的DNA為模板，分別應(yīng)用細(xì)菌16S rRNA基因全長的通用引物8F/1M1R、變性梯度凝膠電泳(DGGE)常用的16S rRNA基因V3區(qū)特異引物341F/534R，以及氨氧化細(xì)菌特異的16S rRNA基因引物 CT0189f/CT0654r進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR結(jié)束后，取5 μ L電泳，結(jié)果分別如圖2，圖3和圖4。 圖2顯示以8F/1M1R為引物獲得接近全長的16S RNA基因，約1500bp，濃度大約為IOng/ tL。該產(chǎn)物純化后可用于16S rRNA基因文庫的構(gòu)建，以解析環(huán)境中微生物的種類、組成與比例。圖3顯示各樣品均獲得了約200bp目標(biāo)序列，濃度大約為20ng/yL，可用于DGGE分析，以解析微生物群落的結(jié)構(gòu)及動態(tài)。圖4顯示以TO189f/CT0654r為引物進(jìn)行PCR后，各樣品均得到了長度約500bp目標(biāo)序列，濃度大約為lOng/yL。可見，應(yīng)用本試劑盒，可以從土壤、沉積物樣品中提取高質(zhì)量的DNA，能夠滿足下游分子生物學(xué)的需要。
權(quán)利要求
1.一種土壤和沉積物總DNA提取方法，依次包括如下步驟1)用腐殖酸溶解液去除待提取樣品大部分腐殖酸，得到樣品沉淀；2)向上述步驟1)的待提取樣品沉淀中加入腐殖酸絡(luò)合劑，使剩余的腐殖酸充分絡(luò)合， 離心使腐殖酸絡(luò)合物和細(xì)菌樣品沉淀；3)向上述步驟2)沉淀中加入細(xì)胞裂解液，漩渦振蕩釋放出細(xì)菌總DNA，離心得到上清溶液；4)向上述步驟幻上清溶液中加入酸堿調(diào)節(jié)劑，離心獲取上清液；5)向上述步驟4)上清液中加入高鹽溶劑，過硅膠吸附膜吸附DNA;6)將上述步驟5)吸附的DNA進(jìn)行清洗，用洗脫液洗脫得到樣品的總DNA。
2.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的步驟幻待提取樣品沉淀中加入的腐殖酸絡(luò)合劑為鈣離子水溶液。
3.如權(quán)利要求2所述的提取方法，其特征在于所述的鈣離子水溶液為氯化鈣溶液。
4.如權(quán)利要求2所述的提取方法，其特征在于所述的待提取樣品和添加的鈣離子的比例為 1. 5g :lmmol/L0
5.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的步驟3)的漩渦振蕩釋放時間為 10 lanin。
6.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的步驟4)中的上清溶液和加入的酸堿調(diào)節(jié)劑的體積比不小于6. 5。
7.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的步驟5)的高鹽溶劑為3.0 6. Omol/L 鹽酸胍，pH 5. 0 8. 0。
8.一種土壤和沉積物總DNA提取試劑盒，包括如下組分1)高效DNA分離柱包含腐殖酸溶解液和海砂；2)腐殖酸絡(luò)合劑0.20mol/L氯化鈣溶液，pH 5. 5 7. 5 ；3)細(xì)胞裂解液50 100mmol/L Tris-HCl, 1. 5 3. 5mol/L NaCl, 3% CTAB，pH 8· 0 10. 0 ；4)變性劑20%SDS，pH 9. 0 ；5)酸堿調(diào)節(jié)劑0.5 1. 5mol/L醋酸鉀，pH 4. 8 6. 0 ；6)高鹽溶劑3.0 6. Omol/L鹽酸胍，pH 5. 0 8. 0 ；7)清洗液70%乙醇；8)洗脫液2 IOmmol/L Tris-HCl，pH 8. 0 9. 0 ；9)基因組DNA吸附柱包含硅膠吸附膜內(nèi)柱的2mL離心管套裝。
9.如權(quán)利要求8所述的DNA提取試劑盒，其特征在于所述的高效DNA分離柱中海砂和腐殖酸溶解液的質(zhì)量體積比g/mL為0. 2 0. 3。
10.如權(quán)利要求8所述的DNA提取試劑盒，其特征在于所述的高效DNA分離柱為2mL可立凍存管。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種土壤和沉積物總DNA提取方法及提取試劑盒，即首先應(yīng)用腐殖酸溶解液，最大程度地溶解和去除土壤和沉積物中的腐殖酸，再將剩余腐殖酸進(jìn)行絡(luò)合沉淀，然后無選擇地裂解釋放細(xì)菌體內(nèi)的基因組DNA，離心后去除溶液中的絡(luò)合腐殖酸和蛋白質(zhì)，而含DNA的上清溶液則通過酸堿調(diào)節(jié)試劑和高鹽溶液調(diào)節(jié)后，以硅膠吸附膜特異吸附而使基因組DNA得以純化回收。本發(fā)明的方法可以在較短時間內(nèi)同時提取多個樣品，正常操作時間小于70min，可以獲得高純度、適合下游分析的大量DNA樣品。依據(jù)本發(fā)明方法建立的試劑盒獲得的DNA樣品純度高，無降解，可直接用于后續(xù)分子生物學(xué)分析，同時避免了傳統(tǒng)DNA提取方法需要酚/氯仿等毒性試劑純化DNA的步驟，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/10GK102206630SQ20111009036
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月12日
發(fā)明者劉茹, 李新偉, 王俊彩, 田偉君, 白潔, 趙陽國 申請人:中國海洋大學(xué)