專利名稱：荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCS1及其植物表達(dá)載體和構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl及其植物表達(dá)載體和構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
重金屬污染是環(huán)境污染的主要方面。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國受Cd、AS、Cr、I^等重金屬污染的耕地面積近2000萬hm2，約占耕地總面積的1/5 ；其中工業(yè)“三廢”污染耕地1000萬hm2， 污水灌溉的農(nóng)田面積已達(dá)330多萬hm2[1]。因此重金屬在環(huán)境中的分布、遷移、轉(zhuǎn)化一直是環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一 [2]。近年來利用植物修復(fù)重金屬污染的土壤和水體的提出， 使綠色植物的應(yīng)用超越了過去只是作為金屬礦藏指示植物或重金屬超富集植物的使用范圍。相對于傳統(tǒng)的物理化學(xué)技術(shù)及微生物處理技術(shù)而言，植物修復(fù)技術(shù)以其成本低廉、不破壞土壤和河流生態(tài)環(huán)境、不引起二次污染等獨(dú)特優(yōu)勢，備受國內(nèi)外學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的密切關(guān)注。荷花(Nelumbo nucifera)，又稱中國蓮，屬睡蓮科蓮屬大型多年生挺水植物，是中國十大傳統(tǒng)名花之一，具有極高的觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值，多分布于淡水湖泊地區(qū)，耐水淹、抗性強(qiáng)，深受各國人民喜愛。植物絡(luò)合素(phytochelatimPC)是一類被廣泛研究的配體。PC是一類富含巰基的螯合多肽，在植物界廣泛存在，可與金屬離子螯合成穩(wěn)定的硫肽復(fù)合物，這些復(fù)合物通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠被運(yùn)輸?shù)桨猓驅(qū)⑵鋬Υ嬖谝号輧?nèi)，降低對植物的毒害，使植物能夠吸收和累積更多的污染物，提高修復(fù)效率 ]。植物絡(luò)合素基因(PCS)是一類由重金屬離子誘導(dǎo)的基因，在解除重金屬離子的毒害、維持組織中金屬離子的穩(wěn)態(tài)以及調(diào)節(jié)金屬離子向特定組織的運(yùn)輸?shù)确矫嫫鹬匾饔胻t]。PCSl基因最早在兩個植物中克隆出來，即擬南芥和小麥，然后依次從印度芥菜和 Ni超積累植株天藍(lán)遏藍(lán)菜克隆出來[5’6]，擬南芥AtPCSl基因的功能和耐重金屬機(jī)理進(jìn)行了較為深入的研究[7’8]。在植物的遺傳轉(zhuǎn)化途徑中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是應(yīng)用最為廣泛的方法之一，其中有效的植物表達(dá)載體至關(guān)重要。將植物絡(luò)合素合酶基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化，可獲得具有耐重金屬的新種質(zhì)。對于優(yōu)良作物新品種的培育及在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一個新的植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl，解決提高大型觀賞水生花卉荷花耐重金屬性，修復(fù)水體污染的問題，本發(fā)明還提供該植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl的植物表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。所構(gòu)建的植物表達(dá)載體可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的作物遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)制耐重金屬新種質(zhì)，可用于植物品種改良。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl，該基因的序列為SEQ ID NO. 1。荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl的植物表達(dá)載體，由所述的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl與植物表達(dá)載體構(gòu)成。所述的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl的植物表達(dá)載體優(yōu)選將經(jīng)Bam I和Mc I 雙酶切的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl插入到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-220得到的。所述的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)設(shè)計(jì)引物NnPCSl-ZF和NnPCSl-ZR，以冬荷cDNA為模板，用高保真酶進(jìn)行PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增上游和下游分別引入Bam I和Mc I酶切位點(diǎn)的NnPCSl基因，其中上游引物 NnPCSl-ZF 序列為 SEQ ID NO. 2，下游引物 NnPCSl-ZR 序列為 SEQ ID NO. 3 ；(2)將步驟(1)的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞， 提取陽性質(zhì)粒 PMD19-T Simple-NnPCSl ；(3)禾Ij 用 Bam I 和 Sac I 對 pMD19_T Simple-NnPCSl 和植物表達(dá)載體 PCAMBIA1301-220 分別進(jìn)行雙酶切，連接 Bam I 禾Π Sac I 雙酶切 pMD19_T Simple-NnPCSl 得到的NnPCSl片段與Bam I和Me I雙酶切pCAMBIA1301_220得到的大片段，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，陽性質(zhì)粒即為荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl植物表達(dá)載體 pCAMBIA1301-220-NnPCSl。所述的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl在提高植物的耐重金屬性中的應(yīng)用。所述的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl的植物表達(dá)載體在提高植物的耐重金屬性中的應(yīng)用。其中，所述的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl的植物表達(dá)載體優(yōu)選將經(jīng)Bam I和 Sac I雙酶切的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl插入到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301_220得到的。本發(fā)明的有益效果1.本發(fā)明提供的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl是一個新的耐重金屬基因，該基因可提高植物耐重金屬性。2.本發(fā)明構(gòu)建的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl植物表達(dá)載體為首次報(bào)道，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)造耐重金屬新種質(zhì)，提高植物的耐重金屬性，可用于進(jìn)行植物品種改良。


圖1 NnPCSl瓊脂糖凝膠電泳分析M =DNA Marker ；1 =NnPCSl ；2 :pMD 19-T Simple-NnPCSl 質(zhì)粒 BamH I 和 c I 雙酶切；3 :pCAMBIA1301-220-NnPCSl表達(dá)載體質(zhì)粒BamH I和&ic I雙酶切電泳檢測圖。圖2植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-220-NnPCSl構(gòu)建方案3野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定結(jié)果，WT代表野生型擬南芥，pcsl pcs8代表八個轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。
圖4野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥qRT-PCR鑒定結(jié)果，WT代表野生型擬南芥，pcsl pcs8代表八個轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。圖5野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥重金屬鎘含量測定。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用到的引物，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同引物，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例1 NnPCSl的克隆選用荷花品種‘冬荷，(Nelumbonucifera Gaertn. ‘Donghe，)作為材料，用 400 μ MCdCl2處理生長至6到8片葉片期的‘冬荷’，3小時后取其嫩葉，參照Trizol RNA提取試劑盒(TaKaRa)說明書方法，提取葉片總RNA，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)取 IygS RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以提取的葉片cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物NnPCSl-F和NnPCSl-R進(jìn)行PCR反應(yīng)上游引物NnPCSl-F :ATGGCGATGGCAGGTCTATACAGGC (SEQ ID NO. 4)下游引物NnPCSl-R :AGAGACTGAAGGTGTGCTGAGGCCA (SEQ ID NO. 5)50yL 反應(yīng)體系10XRCR Buffer 5· 0 μ L，NnPCSl-F、NnPCSl-R 弓 | 物各 1. 0 μ L(20 μ mol · L-1)，dNTP mix 4. 0 μ L(2. 5mmol · L-1)，Taq DNA Polymerase 0. 2 μ L, cDNA 模板 1 μ L，ddH20 37. 8 μ L ；反應(yīng)程序95°C 預(yù)變性 ％iin，然后 94°C 解鏈 30sec，55°C 退火30sec，72°C延伸2min，反應(yīng)32個循環(huán)，72°C延伸7min ；PCR結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖電泳(圖 1)，產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(TAKARA)回收純化，用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接到pMD19_T Simple載體(TaKaRa)，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，序列測定為SEQ ID N0. 1。實(shí)施例2.植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-220-NnPCSl的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物NnPCS 1-ZF、NnPCSI-ZR進(jìn)行PCR反應(yīng)，在目的基因NnPCSl的上游和下游分別引入酶切位點(diǎn)Bam I和Me 1，卩0 產(chǎn)物連接到？^)19_丁 Simple載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒，Bam I和Me I雙酶切的NnPCSl片段與Bam I和Me I雙酶切的 PCAMBIA1301-220連接，轉(zhuǎn)化，提取的陽性質(zhì)，電泳檢測并測序驗(yàn)證為SEQ ID N0. 1，具體步驟如下上游引物NnPCSl-ZF :CGCGGATCCATGGCGATGGCAGGTCTATACAGGC (SEQ ID NO. 2)下游引物NnPCS 1-ZR :CGAGCTCAGAGACTGAAGGTGTGCTGAGGCCA (SEQ ID NO. 3)①以荷花葉片cDNA作為模板，用高保真酶(I^rimeSTAR HS DNAPolymerase, TaKaRa)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，50 μ L 反應(yīng)體系10XHS RCR Buffer 5. 0 μ L, NnPCSl-ZF, NnPCSl-ZR 弓1· 0 μ L(20 μ mol · Ι71)， dNTP mix 4. 0μ L(2. 5mmol · I71)， PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0. 4μ L, cDNA 模板 1 μ L, ddH20 37. 6 μ L ；反應(yīng)程序95°C預(yù)變性 4min， 然后94°C解鏈30sec，55°C退火30sec，72°C延伸2min，反應(yīng)32個循環(huán)，72°C延伸7min ；PCR 產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(TAKARA)回收，連接到pMD19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定并提取陽性質(zhì)粒pMD 19-T Simple-NnPCSl ；②取表達(dá)載體pCAMBIA1301-220 和 pMD19_T Simple-NnPCSl 分別用 Bam I 和 Sac I 雙酶切，雙酶切體系(50μ L) :10XK Buffer 2. 5 μ L，質(zhì)粒 pCAMBIA1301_220 或 PMD19-TSimpIe-NnPCSl 10 μ L，BamH I 2 μ L, Sac I 2 μ L, ddH20 33. 5 μ L ;37°C反應(yīng) 3h ; 雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析(圖1)，用凝膠回收試劑盒(TAKARA)回收質(zhì)粒 PCAMBIA1301-220 大片段和pMD19-T Simple-NnPCSl 小片段。用 T4DNA連接酶(TaKaRa)連接兩個回收的產(chǎn)物，連接反應(yīng)體系(IOyL) :10XT4 ligase Buffer 1 μ L，pCAMBIA1301_220 大片段2 μ L，pMD19-T Simple-NnPCSl小片段6 μ L，T4 DNA連接酶1 μ L ； 16°C過夜連接反應(yīng)，取5 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Τ0Ρ10感受態(tài)細(xì)胞。37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pCAMBIA1301-220-NnPCSl，電泳(圖1)和測序驗(yàn)證為SEQ ID NO. 1。植物表達(dá)載體 pCAMBIA1301-220-NnPCSl的構(gòu)建成功，質(zhì)粒譜圖及構(gòu)建方案圖見圖2。實(shí)施例3植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-220-NnPCSl遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥及其抗重金屬性鑒定①農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)制備及凍融法轉(zhuǎn)化從YEB (50ug/mL利福平)平板上挑取EHA105單菌落，接種于50mL含50ug/mL利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，200rpm，培養(yǎng)至OD值0. 5，而后冰浴菌液30min，離心收集菌體，懸浮于2mL預(yù)冷的IOOmM CaCl2 (20%甘油)溶液中，200uL/管分裝，待用。取IOuL pCAMBIA1301-220-NnPCSl 載體質(zhì)粒，加入 200uL EHA105 感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min,液氮冷凍5min，37°C 5min,加入800uL YEB液體培養(yǎng)基，28°C 200rpm預(yù)培養(yǎng)4h, 菌液涂板于YEB (50ug/mL利福平+50ug/mL卡那霉素)固體培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)2天，挑取單克隆PCR檢測，選取陽性克隆搖菌，用于擬南芥花序轉(zhuǎn)化。②擬南芥花序浸染及種子篩選將陽性單克隆接到50mL的YEB (50ug/mL利福平+50ug/mL卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)M小時，5000rpm離心20分鐘，然后用轉(zhuǎn)化液(1/2MS，添加50克/升的蔗糖，調(diào)pH 為5. 8，然后加200uL/L的Silwet L-77混合)劇烈懸浮沉淀至完全懸起。將擬南芥地上部分直接浸泡于上述懸浮液中1分鐘，然后用保鮮膜完全包裹植株以保濕，放回培養(yǎng)室培養(yǎng) 12小時，打開保鮮膜，待種子成熟時采收。種子消毒與播種將種子放入1. 5mL的離心管中，加入ImL 75%酒精，添加0. 1% 的TritonX-IOO搖晃15分鐘，然后在超凈臺中用95%的酒精洗兩次，而后直接把種子連同酒精倒在滅菌過的濾紙上，以吹干種子(放置30分鐘)，輕輕敲擊濾紙將干種子均勻撒播到篩選培養(yǎng)基(MS+20mg/L潮霉素+25mg/L氨芐青霉素)篩選培養(yǎng)10天，然后將抗性苗移栽到土中，用透明的蓋子覆蓋幼苗1周以保濕。③PCR鑒定及抗重金屬性鑒定待抗性苗7 8片葉，提取擬南芥葉片DNA，PCR(引物NnPCSl-F和NnPCSl-R)鑒定，結(jié)果見圖3。。經(jīng)PCR鑒定的T1代轉(zhuǎn)基因苗繼續(xù)生長，采收T2代種子。對野生型和T2代抗性轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行qRT-PCR鑒定，結(jié)果見圖4。選取經(jīng)qRT-PCR鑒定目的基因相對表達(dá)量最高的三株擬南芥進(jìn)行重金屬處理擬南芥播于MS培養(yǎng)基上，一周后移苗，三周后用50 μ MCdCl2,100 μ MCdCl2處理野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因株系，培養(yǎng)介質(zhì)為1/2 Hoagland大量營養(yǎng)液加Arnon微量營養(yǎng)液，1周后收獲地上部，測Cd2+離子含量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥較野生型積累更多的鎘離子(圖5)。綜上所述，本發(fā)明構(gòu)建了含有荷花植物絡(luò)合素合酶基因的植物表達(dá)載體 pCAMBIA1301-220-NnPCSl，其中NnPCSl首次報(bào)道。所構(gòu)建的載體可導(dǎo)入植物中，提高植物的吸收重金屬Cd的能力。參考文獻(xiàn)[1]趙其國、高俊峰.中國濕地資源的生態(tài)功能及其分區(qū)[J]中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2007，15 1-4.[2]郝立波，劉海洋，陸繼龍等.松花湖沉積物137Cs和21Tb分布及沉積速率[J] 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)地球科學(xué)版.2009 :470-473.[3]張斌，范仲學(xué)，柳絮等，植物修復(fù)重金屬污染土壤的遺傳工程研究[J]分子植物育種· 4 :37-43.[4] van Hoof, N, et al. A. Enhanced copper tolerance in Silene vulgaris (Moench)Garcke populations from copper mines is associated with increased transcript levels of a 2b~type metallothionein gene[J]Plant Physiology. 2001，126 :1519-1526.[5]Ha, S. , et al. Phytochelatin synthase genes from Arabidopsis and the yeast SchizoSaccharomyces pombe[J]The Plant Cell. 1999,11 :1153-1164.[6]Vatamaniuk, 0. , et al. , a phytochelatin synthase from Arabidopsis isolation and in vitro reconstitution. [J]Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1999,96 :7110-7115.[7]Lee,S. and Kang,B. S. Expression of Arabidopsis phytochelatin synthase 2 is too low to complement an AtPCS1-defective Cad1-3 mutant[J]Mol Cells. 2005, 19 :81-87.[8]Lee, S. and Korban, S. Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCSl)by cadmium during early stages of plant development[J]Planta. 2002,215 :689-693.
權(quán)利要求
1.荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl，其特征在于該基因的序列為SEQID NO. 1。
2.荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl的植物表達(dá)載體，其特征在于由權(quán)利要求1所述的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl與植物表達(dá)載體構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl的植物表達(dá)載體，其特征在于所述的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl的植物表達(dá)載體是將經(jīng)Bam I和Mc I雙酶切的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl插入到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-220得到的。
4.權(quán)利要求2或3所述的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法， 其特征在于包括如下步驟(1)設(shè)計(jì)引物NnPCSl-ZF和NnPCSl-ZR，以冬荷cDNA為模板，用高保真酶進(jìn)行PCR反應(yīng)， 擴(kuò)增上游和下游分別引入Bam I和Mc I酶切位點(diǎn)的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl，其中上游引物NnPCSl-ZF序列為SEQ ID NO. 2，下游引物NnPCSl-ZR序列為SEQ ID NO. 3 ；(2)將步驟(1)的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-TSimple載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒 pMD 19-T Simple-NnPCSl ；(3)利用BamI 和 Me I 對 pMD19_T Simple-NnPCS 1 和植物表達(dá)載體 pCAMBIA1301_220 分別進(jìn)行雙酶切，連接Bam I和Me I雙酶切pMD19_T Simple-NnPCSl得到的NnPCSl片段與Bam I和&ic I雙酶切pCAMBIA1301_220得到的大片段，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，陽性質(zhì)粒即為荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-220-NnPCSl。
5.權(quán)利要求1所述的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl在提高植物的耐重金屬性中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl的植物表達(dá)載體在提高植物的耐重金屬性中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl的植物表達(dá)載體是將經(jīng)Bam I和Me I雙酶切的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCSl插入到植物表達(dá)載體PCAMBIA1301-220得到的。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCS1及其植物表達(dá)載體和構(gòu)建方法。荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCS1，序列為SEQ ID NO.1。NnPCS1是一個新的耐重金屬基因，該基因可提高植物耐重金屬性。荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCS1的植物表達(dá)載體，由所述的荷花植物絡(luò)合素合酶基因NnPCS1與植物表達(dá)載體構(gòu)成。本發(fā)明NnPCS1的植物表達(dá)載體載體為首次報(bào)道，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)造耐重金屬新種質(zhì)，提高植物的耐重金屬性，可用于進(jìn)行植物品種改良。
文檔編號C12N15/54GK102191259SQ201110090228
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月12日
發(fā)明者劉兆磊, 陳發(fā)棣, 陳思思, 陳素梅, 顧春筍 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)