專利名稱：重組馬gmcsf的制備方法及相關(guān)馬gmcsf核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及GMCSF制備技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種重組馬GMCSF的制備方法及相關(guān)GMCSF核苷酸序列。
背景技術(shù)：
細胞因子(cytokine)是一類機體在免疫反應(yīng)時產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)。機體的免疫系統(tǒng)在受到抗原和各種免疫佐劑的刺激后，產(chǎn)生的應(yīng)答性物質(zhì)，這類物質(zhì)統(tǒng)稱為細胞因子。天然的細胞因子為哺乳動物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，多數(shù)為分子量較小的單體(1x104-2. 5X104), 也有天然狀態(tài)為二體或三體的。免疫反應(yīng)通常是由多種細胞因子參與調(diào)節(jié)的。細胞因子對抗原遞呈細胞(APC)的作用有增加APC的數(shù)量和活化APC的功能兩個方面。GMCSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)是一種強烈刺激巨噬細胞和DC等抗原呈遞細胞的增殖、分化、活化、成熟及趨化的細胞因子，能促進單核吞噬細胞和顆粒細胞的分化；激活A(yù)PC的抗原處理和遞呈功能；促使B細胞成熟和分泌抗體。 GMCSF可以明顯提高機體的體液免疫機能。在被動免疫治療和預(yù)防中，馬抗體發(fā)揮了無可替代的作用。馬抗蛇毒抗體是治療蛇傷的最快速、最有效的藥物；在預(yù)防狂犬病中，馬抗狂犬病抗體的使用是不可或缺的。因此免疫獲得高滴度抗體用以制備高效價的馬抗蛇毒、抗狂犬病等抗體具有重要意義。在免疫馬匹時佐劑的使用可以大幅提高抗體的滴度，馬GMCSF是一種細胞因子，在免疫動物的同時添加馬GMCSF可以明顯提高抗體的滴度。因此，需要提供一種重組馬GMCSF的制備方法，其可以高表達、高純度地獲得具有生物學(xué)活性的重組馬GMCSF。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組馬GMCSF的制備方法及相關(guān)馬GMCSF核苷酸序列， 該重組馬GMCSF的制備方法設(shè)計巧妙，從而可以高表達、高純度地獲得具有生物學(xué)活性的重組馬GMCSF，進而可以作為免疫馬匹時的佐劑，以增強動物的免疫反應(yīng)，提高抗體的滴度， 適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種重組馬GMCSF的制備方法， 其特點是，將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的編碼馬GMCSF的核苷酸序列構(gòu)建入原核細胞誘導(dǎo)表達載體中，然后轉(zhuǎn)入原核細胞進行培養(yǎng)后誘導(dǎo)表達，并進行純化，從而獲得所述重組馬GMCSF。其中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的原核細胞所用的材料不含任何動物或人來源的物質(zhì)，而且能在發(fā)酵過程中獲得高細胞密度。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的原核細胞進行在含一種或多種可供選擇的材料， 如酵母提取物，甘油和含氮鹽類的培養(yǎng)基中實施較佳地，所述核苷酸序列是如SEQ ID NO 1所示的序列。編碼如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。較佳地，所述培養(yǎng)包括預(yù)接種的預(yù)備步驟。
所述原核細胞可以是任何合適的原核細胞。較佳地，所述原核細胞是細菌細胞。更佳地，所述細菌細胞是大腸桿菌細胞。更進一步地，所述大腸桿菌細胞是大腸桿菌BL21 (DE3)細胞。較佳地，所述誘導(dǎo)表達在培養(yǎng)液的0D_達到1-20時啟動。更佳地，所述0D_為5-15。更進一步地，所述OD6tltl為8-12。所述原核細胞誘導(dǎo)表達載體可以是分泌表達載體，也可以是非分泌表達載體。較佳地，所述原核細胞誘導(dǎo)表達載體是非分泌表達載體，在所述誘導(dǎo)表達后，裂解培養(yǎng)得到的原核細胞，斷裂DNA和分離包涵體，所述包涵體中含有所述重組馬GMCSF，將所述包涵體溶于變性緩沖液得到變性溶液，然后使所述變性溶液中的蛋白復(fù)性得到復(fù)性溶液，再進行所述純化。更佳地，所述非分泌表達載體是T7表達載體。更進一步地，所述誘導(dǎo)表達通過乳糖、IPTG或功能相同的類似物進行。更佳地，所述裂解采用凍融法或高壓細胞破碎儀進行。還可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他等同技術(shù)實施細胞裂解。更佳地，所述斷裂DNA采用生化或物理方法如加入重組來源的DNase或通過化學(xué)-機械作用來使DNA斷裂。重組來源的DNase優(yōu)選benzonase。常規(guī)通過混和器來使DNA 斷裂。更佳地，所述分離包涵體通過至少兩個循環(huán)的離心和洗滌，洗滌緩沖液內(nèi)含IM尿素，0. 5-1. OM氯化鈉，pH在7. 0-8. 0之間。更佳地，所述變性緩沖液是含尿素、異硫氰酸胍或鹽酸胍的變性緩沖液。還可以是含其它變性劑的變性緩沖液。更佳地，所述變性緩沖液加入所述包涵體中并采用勻漿或超聲處理從而將所述包涵體溶于所述變性緩沖液。更佳地，所述復(fù)性通過在所述變性溶液中添加氧化/還原劑并在溫度10_30°C攪拌10-30小時實現(xiàn)。更進一步地，所述溫度為20°C，所述攪拌進行20-23小時。更進一步地，在加入所述氧化/還原劑之前，先稀釋所述變性溶液至OD28tl達到 0. 01-2，所述氧化/還原劑是氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽，所述氧化型谷胱甘肽的濃度在0. ImM和2. 5mM之間，所述還原型谷胱甘肽的濃度在0. 25mM和6. 25mM之間。尤其更佳地，所述OD28tl達到0. 5。較佳地，所述純化采用親和層析將所述重組馬GMCSF以單體形式分離。更佳地，所述重組馬GMCSF帶有6x His標簽，所述親和層析采用Ni-親和層析柱層析，樣品上柱體積/柱體積的比率為10 1至300 1。更進一步地，所述比率為40 1。更進一步地，采用咪唑-NaCl緩沖液作為洗脫液，所述重組馬GMCSF主要在 100-250mM咪唑濃度的洗脫組分中。重組GMSCSF純化后可以進一步超濾濃縮然后添加保護劑和/或冷凍干燥保存。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種密碼子優(yōu)化的編碼GMCSF的核苷酸序列，其特點是，所述核苷酸序列是如SEQ ID NO :1所示的序列，適于上述的重組馬GMCSF的制備方法。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的重組馬GMCSF的制備方法是將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的編碼馬GMCSF的核苷酸序列構(gòu)建入原核細胞誘導(dǎo)表達載體中，然后轉(zhuǎn)入原核細胞進行培養(yǎng)后誘導(dǎo)表達，并進行純化，從而獲得所述重組馬GMCSF，表達量可達約200mg/l ；純度高， 經(jīng)檢測，不含可以用SDS-PAGE或HPLC檢測到的細菌菌體蛋白或其它細菌殘留物，通過實驗表明獲得的重組馬GMCSF具有生物學(xué)活性，因此本發(fā)明的重組馬GMCSF的制備方法設(shè)計巧妙，從而可以高表達、高純度地獲得具有生物學(xué)活性的重組馬GMCSF，進而可以作為免疫馬匹時的佐劑，以增強動物的免疫反應(yīng)，提高抗體的滴度，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。


圖1是表達馬GMCSF的重組大腸桿菌在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后在還原條件下SDS-PAGE 結(jié)果，其中1為蛋白分子量標準，2和5為誘導(dǎo)前樣品，3和6為誘導(dǎo)后樣品。圖2為包涵體變復(fù)性前后和Ni-S^harose High Performance金屬離子螯合層析純化后獲得的高純度馬GMCSF蛋白SDS-PAGE結(jié)果，其中1為蛋白分子量標準；2為包涵體洗滌后加變性緩沖液BD后獲得的蛋白溶液；3為變性蛋白溶液復(fù)性后的樣品；4為復(fù)性樣品過Ni-S^harose High Performance金屬離子螯合層析并用250mM咪唑溶液洗脫獲得的純化重組馬GMCSF。圖3是將帶有6x His標簽的密碼子優(yōu)化的馬GMCSF的核苷酸序列通過NdeI和 XhoI酶切位點構(gòu)建入pET30a(+)獲得的重組質(zhì)粒圖譜示意圖。
具體實施例方式為了達到使馬GMCSF在原核細胞內(nèi)高表達這個目的，通過查文獻得到該完整基因的氨基酸序列(即SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列)。根據(jù)這個氨基酸序列，設(shè)計了最佳的核苷酸序列(即SEQ ID NO :1所示的序列)，將該核苷酸序列插入表達載體，然后轉(zhuǎn)化原核細胞。然后使用相應(yīng)的誘導(dǎo)物進行誘導(dǎo)表達?？梢允褂枚喾N原核誘導(dǎo)表達系統(tǒng)。市場上可獲得的原核誘導(dǎo)表達系統(tǒng)主要有下列幾種l)pBAD表達系統(tǒng)anvitrogen)，其中蛋白合成置于araBAD啟動子控制下，可以用阿拉伯糖在大腸桿菌菌株中誘導(dǎo)。 2) T7表達系統(tǒng)anvitrogen或!Iomega)，其蛋白合成受T7噬菌體的RNA聚合酶啟動子控制，可以用乳糖或乳糖類似物(IPTG)誘導(dǎo)。需要使用大腸桿菌衍生物 DE3(BL21 (DE3)或JM109(DE3))型，即含有乳糖誘導(dǎo)型啟動子控制下的T7噬菌體的RNA聚合酶的基因拷貝。3) Trc表達系統(tǒng)anvitrogen)，其中蛋白合成置于Trc雜合啟動子控制下。這種啟動子可以通過解鏈trp啟動子和Iac啟動子而獲得，并可以依靠乳糖或其類似物(IPTG) 在不同的大腸桿菌菌株中誘導(dǎo)。4) Tac表達系統(tǒng)(Amersham Biosciences)，其蛋白合成置于tac啟動子控制下。 在這個系統(tǒng)中，依靠如乳糖類似物(IPTG)在大腸桿菌菌株lacIq(JM105型)中誘導(dǎo)蛋白合成。
表達系統(tǒng)，其中蛋白合成置于啟動子控制下，可以通過添加色氨酸誘導(dǎo)。在這種情況下，需要使用含色氨酸又導(dǎo)型啟動子控制下噬菌體Cl抑制劑的編碼基因拷貝的大腸桿菌衍生物(G1724)。步驟I 發(fā)酵和誘導(dǎo)在優(yōu)選實施方案中，含密碼子優(yōu)化的馬GMCSF的核苷酸序列(即SEQ ID NO=I所示的序列)在5’端加上Nde I位點和6個組氨酸密碼子序列，在3’端加入B10I位點。選用pET30a質(zhì)粒，用NdeI和BioI雙酶切使之線性化。將具有NdeI和BioI酶切獲得的馬 GMCSF DNA與NdeI和XhoI線性化的pET30a(+)質(zhì)粒(Invitrogen)連接(見圖3)，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株B121(DE3) (Invitrogen)獲得，名稱定為BL21 (DE3)GMCSF?？衫斫猓景l(fā)明不限于馬GMCSF因子，也涉及其它動物來源的(狗、羊、兔等)的GMCSF。本發(fā)明方法中作為接種菌的菌株BL21(DE3)GMCSF以冷凍干燥形式保存以維持其表達能力。使用時，通過適當(dāng)?shù)木彌_液，將冷凍干燥的細菌再懸浮到溶液中。為了避免污染風(fēng)險，優(yōu)選不含任何動物和人來源物質(zhì)的培養(yǎng)基中實施根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵(培養(yǎng))步驟。在優(yōu)選實施方案中，使用通過在無菌條件下含酵母提取物、甘油和硫酸銨的第一溶液(A)與含磷酸鹽緩沖液的第二溶液(B)混合而獲得的培養(yǎng)基。接著該混合物添加卡那霉素。適當(dāng)?shù)目股貪舛葹?0-300微克/ML卡那霉素，優(yōu)選50微克/ML。發(fā)酵步驟前可以進行預(yù)接種步驟，其中冷凍干燥的微生物懸浮于培養(yǎng)基中并進行連續(xù)培養(yǎng)和稀釋步驟，旨在使培養(yǎng)體系中具有最佳數(shù)量的微生物細胞。優(yōu)選地，在37度過夜培養(yǎng)該微生物，接著再稀釋和培養(yǎng)幾個小時。隨后離心所選預(yù)接種體積，再次懸浮于富含卡那霉素的培養(yǎng)基中并在發(fā)酵容器中孵育進行發(fā)酵步驟。在添加卡那霉素的上述培養(yǎng)基中，于適合該細菌的溫度下，通常在大約37度，在溶解O2百分比為20-40%，優(yōu)選30% (相對于空氣飽和度)條件下實施發(fā)酵。發(fā)酵期間，pH 保持在中性或弱酸性值(6. 4-7. 0)。此外，在發(fā)酵過程，可優(yōu)選使用防泡劑。發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的光密度逐漸增加。光密度是本發(fā)明利用的參數(shù)，以監(jiān)測發(fā)酵進展程度。600nm的光密度讀數(shù)最適合。本發(fā)明的主要特征是表達誘導(dǎo)時細菌能達到的高密度。由于本發(fā)明培養(yǎng)基的原因，培養(yǎng)物在600nm的光密度可以達到1-50。優(yōu)選高于10的密度以獲得高表達量。特別優(yōu)選12-15之間的密度開始誘導(dǎo)，以得到最佳結(jié)果。使用了用含T7噬菌體啟動子的表達載體修飾的細菌菌株BL21(DE3)時用適當(dāng)濃度的乳糖或其衍生物(即大于0.5mM)，如IPTG誘導(dǎo)表達。根據(jù)需要誘導(dǎo)持續(xù)時間可以變化。優(yōu)選誘導(dǎo)時間為3-4個小時；在最佳方法中，通過使用大約等于10%的溶解O2百分比， 誘導(dǎo)3小時。誘導(dǎo)前后取細胞樣品進行分析，如用SDS-PAGE電泳，來確定誘導(dǎo)結(jié)果。當(dāng)?shù)鞍妆磉_達到預(yù)期水平時，離心培養(yǎng)物，取出細胞進行下列步驟。步驟II:包涵體提取和純化細菌菌株中表達的重組蛋白是以包涵體形式存在于細胞中。本發(fā)明提供了細胞裂解、核酸(DNA)的破裂和包涵體回收和洗滌的方法。洗滌細胞并懸浮于含去垢劑的溶液，優(yōu)選含0. 5% -1% Triton XlOO (V/V)的緩沖液進行細菌細胞的懸浮。接著進行細胞的裂解，細胞裂解可以用凍/融、高壓破菌儀、超聲處理或其它類似已知技術(shù)實施。對于本發(fā)明所用的細菌菌株BL21(DE3)的優(yōu)選方法是凍/融方法，在最優(yōu)選實施方案中，該凍/融方法重復(fù)至少兩個循環(huán)。裂解后，裂解混合溶液需在室溫下，持續(xù)攪拌2-10分鐘，優(yōu)先選擇攪拌5分鐘。裂解細菌細胞中包涵體的釋放伴隨著微生物其它成分如細胞蛋白、類脂和核酸物質(zhì)的釋放。這些物質(zhì)可干擾重組蛋白純化。因此，必須采用化學(xué)或物理方法來盡可能地除這些雜質(zhì)。如用DNAse (天然或重組酶如Benzonase)、脫氧膽酸、或物理-機械試劑，如超聲處理或依靠葉片進行高能量攪拌處理。重懸于含螯合劑和洗滌劑(例如EDTA和Triton X100)的包涵體進行反復(fù)洗滌，優(yōu)選3次，離心、棄去上清，以除去包涵體中的雜質(zhì)。步驟III蛋白的變性和復(fù)性將含GMCSF的包涵體沉淀溶于含變性劑如尿素、異硫氰酸胍、鹽酸胍的溶液中。優(yōu)選變性溶液為8M的尿素溶液或6M鹽酸胍溶液。為了加速溶解過程，該包涵體沉淀可以勻漿或超聲處理。包涵體溶解后，用變性緩沖液稀釋到0擬SOnm大約0.5的光密度。并適當(dāng)加入稀釋緩沖液。GMCSF蛋白在稀釋緩沖液中復(fù)性時，須在溶液添加適當(dāng)濃度的氧化/還原劑，隨后在攪拌下于10-30度(優(yōu)選20度)孵育10至30小時，優(yōu)選20-23小時完成。氧化/還原劑的實例是胱氨酸/半胱氨酸，胱胺/半胱胺，2-羥基乙基二硫化物/2-巰基-乙醇。氧化/還原劑的優(yōu)選實例是氧化和還原型的谷胱甘肽，分別為0. ImM和2. 5mM(優(yōu)選0. 5mM) 之間和0. 25mM和6. 25mM(優(yōu)選1. 25mM)之間的濃度。步驟IV Ni-Sepharose High Performance金屬離子螯合層析純化由于在重組馬GMCSF的構(gòu)建中加入了 6x His標簽，使得重組馬GMCSF可以與Ni 離子鰲合，通過Ni-kpharose High Performance金屬離子螯合層析，只需用一步層析方法就可以將目的蛋白與其它分子分離。復(fù)性處理后的含重組馬GMCSF的細菌包涵體溶液離心除去不溶性顆粒物質(zhì)后可以直接過Ni-S印harose High Performance金屬離子螯合層析柱，樣品過完后先后用洗滌液和含IOmM咪唑的洗滌液充分洗滌Ni-kpharose High Performance金屬離子螯合層析柱，接著用含50-500mM咪唑，較優(yōu)的為含100-350mM咪唑最優(yōu)為含250mM咪唑的洗脫液洗脫重組馬GMCSF。收集洗脫獲得的蛋白峰，這個蛋白峰即為高純度重組馬GMCSF。為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特列舉以下具體實施例詳細說明。然而，具體實施例僅僅是用于舉例說明，而不是對本發(fā)明的限制。實施例1 發(fā)酵
材料
SBM 液
溶液A(1升)
酵母提取物34g
硫酸銨2. 5g
甘油100ml
水加至1000ml
溶液B (IOx)
KH2PO4 1. 7g
K2HP04-3H20 20g
H2O 加至 IOOml溶液A和B分別高壓消毒后在無菌條件下混和。IPTG溶液IPT5g溶于IOOml蒸餾水，用0. 22n. m過濾器過濾該溶液，制備成 200mMIPTGQ00X)，-20°C保存。防泡劑是 Antifoam 0-30 (Sigma Cat A-8082)，使用的工程菌菌株是BL21 (DE3) GMCSF0取一管凍干BL21 (DE3) GMCSF工程菌菌種懸浮于30ml的SBM (含 50yg/ml卡那霉素)中。在37°C搖床中培養(yǎng)過夜，搖床轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分。第二天，稀釋于800ml的SBM (含50 μ g/ml卡那霉素)中，分到4個1升三角燒瓶，每瓶200ml，37°C培養(yǎng) 6小時?；旌?瓶培養(yǎng)物。加入發(fā)酵罐中，加入的比例為每升發(fā)酵培養(yǎng)液加20毫升上述細菌培養(yǎng)物。在下列實驗條件下實施發(fā)酵培養(yǎng)基SBM (含50 μ g/ml卡那霉素)溫度37°C溶解氧30% (相對于空氣飽和度)pH 6. 4-7. 4防泡劑(1 10稀釋于水中)；以每750ml培養(yǎng)基加140μ1稀釋的防泡劑的比例進行添加。誘導(dǎo)誘導(dǎo)起始的OD6tltl :16-20 ；誘導(dǎo)劑IPTG，終濃度ImM ；溶解氧10% (相對于空氣飽和度)；誘導(dǎo)時間3小時30分鐘。誘導(dǎo)結(jié)束后收集培養(yǎng)液，于4°C，7500g離心10分鐘，棄去上清，保留沉淀的細菌體。結(jié)果SDS-PAGE電泳檢查誘導(dǎo)結(jié)果，如圖1所示。其中2和5的誘導(dǎo)前樣品制備如下取600nm下吸光度為0. 1單位的未誘導(dǎo)培養(yǎng)液。取20微升這種物質(zhì)添加20微升還原緩沖液并煮沸3分鐘，取20微升加樣到SDS-PAGE基質(zhì)上。3和6為誘導(dǎo)后樣品，誘導(dǎo)結(jié)束后收集的培養(yǎng)液，用生理鹽水稀釋培養(yǎng)液至600nm下吸光度為0. 1單位濃度，取20微升添加20微升還原緩沖液并煮沸3分鐘，取20微升加樣到SDS-PAGE基質(zhì)上。發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)后樣品中(3和6)，相當(dāng)于分子量指示14. 3kD的附近出現(xiàn)小一個明顯的蛋白條帶(箭頭所示)， 未誘導(dǎo)樣品0和幻無此條帶，該條帶相應(yīng)于表達和存在于包涵體中的GMCSF蛋白，表達量為200毫克/升。實施例2 包涵體的提取和純化下列步驟涉及GMCSF的包涵體的制備和重折疊。通過重折疊，GMCSF蛋白被部分復(fù)性。材料裂解溶液lmMMg2S04+20mM Tris-HO pH8+l% Triton XlOO0洗滌溶液0.5% Triton X100+10mM EDTApH 8。BD (變性緩沖液):8M 尿素，50mM Tris pH 8，NaCl 20mM 溶液。氧化型谷胱甘肽200x =IOOmM水溶液。還原型谷胱甘肽200x: :250mM水溶液。稀釋緩沖液600μ M PEG 4000(2. 4g/l) ,50mM Tris-HCl pH 8,20mM NaCl0防泡劑Antifoam0-30 (非硅；Sigma)。
GMCSF包涵體的制備以每毫升0D_450單位的細菌體添加Iml裂解濃液的比例添加裂解溶液，混勻細菌。以_80°C冰凍/37°C融合的方式，實施3次凍/融循環(huán)，使細菌沉淀溶解。接著在RT攪拌O50rpm)孵育30分鐘后以每毫升0D_450單位細菌體加3ml洗滌溶液的比例，添加洗滌溶液，同時添加未稀釋防泡劑，比例為每毫升樣品添加0. 4 μ 1未稀釋防泡劑。攪拌30分鐘后13000g離心30分鐘，廢棄上清，沉淀按每毫升4500D_細菌添加6. 5ml洗滌溶液的比例添加洗滌溶液，室溫下攪拌45分鐘。如此獲得的懸液在25°C以13000g速度離心30分鐘， 棄去上清，沉淀以每毫升0D_450的細菌體添細1洗滌溶液的比例進行重懸，接著在上述條件下離心并除去上清。此步驟重復(fù)兩次，以除去可溶性細菌蛋白。實施例3 =GMCSF蛋白變性和復(fù)性變性緩沖液BD (含8M尿素)加至上述洗滌后沉淀中，使沉淀溶解，并進一步加BD 直到OD28tl為0. 8。為了使尿素終濃度達到5M，添加0. 6體積的稀釋緩沖液，并添加200x還原型谷胱甘肽，使終濃度為1. 25mM ；添加200x氧化型谷胱甘肽，使終濃度為0. 5mM。上述蛋白溶液在20°C溫度下攪拌18-20小時。攪拌結(jié)束后，緩慢滴加稀釋緩沖液使尿素的濃度降到4M，繼續(xù)在室溫條件下攪拌1小時。緊接著，繼續(xù)滴加稀釋緩沖液，使尿素濃度降到3M 后在室溫下攪拌1小時，然后再加稀釋緩沖液，使得尿素濃度為2M，樣品溶液在室溫下攪拌 1小時，此時蛋白復(fù)性基本完成。復(fù)性后的樣品20°C，13000g離心10分鐘，棄沉淀，保留上清。結(jié)果SDS-PAGE電泳分析折疊前和重折疊后的蛋白溶液(圖2)。結(jié)果表明純化后的重組馬GMCSF (箭頭所示)純度高，不含可以用SDS-PAffi或HPLC檢測到的細菌菌體蛋白或其它細菌殘留物。SDS-PAGE凝膠薄層掃描顯示馬GMCSF主條帶占95%以上，最終得率為 47%。實施例 4 :Ni-Sepharose High Performance 金屬離子螯合層析材料:Ni-Sepharose High Performance透析緩沖液:20mMTris, 150mM NaCl, ρΗ7· 4.上述經(jīng)復(fù)性處理后的樣品可以直接用Ni-S印harose High Performance金屬離子螯合層析方法來純化。用重力方法組裝Ni-S印harose High Peformance層析柱，柱高控制在5-lOcm，層析柱的直徑根據(jù)上樣蛋白量來決定。樣品過層析柱的體積和凝膠的體積比例控制在每2-400ml上述實施例3的蛋白樣品用1毫升Ni-S印harose High Peformance凝膠的量，較佳地比例為10-300毫升蛋白樣品用1毫升凝膠的量，最佳的比例為40-60毫升蛋白樣品用1毫升Ni-S印harose High Peformance凝膠。層析柱用PBS洗滌，接著用3柱體積的5M尿素，50mMTris, 20mMNaCl pH8. 0的緩沖液洗滌。上述步驟完成后，實施例3的蛋白樣品以30cm(柱長)/小時的線速度過凝膠柱，上樣完成后層析柱先后用5體積的2M尿素、 50mM Tris、20mMNaCl pH8. 0 的洗滌液和 5 體積的 2M尿素、50mM Tris、500mM NaCl pH8. 0 的洗滌液洗滌，以除去雜蛋白。緊接著用250mM咪唑、2M尿素、150mM NaCl pH8. 0的洗脫液洗脫馬GMCSF。收集洗脫的蛋白峰，該峰即含有高純度的馬GMCSF蛋白。得到的蛋白溶液可以對透析緩沖液透析除去尿素和咪唑。除去尿素和咪唑的馬GMCSF蛋白溶液需分裝后-20°C 保存，以保持生物學(xué)活性。實施例5.馬GMCSF生物學(xué)活性測定
BALB/c小鼠骨髓細胞作為檢測細胞。處死小鼠，立即分離股骨和脛骨，用 RPMI1640細胞培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，收集骨髓細胞，用無血清RPMI1640洗滌細胞3次，然后用含10%小牛血清的RPMI1640稀釋細胞，以每孔IO5個細胞接種于96孔板中，待測樣品與標準品分別用含10%小牛血清的RPMI1640倍比稀釋后加到各孔，使每孔的總體積為200微升，370C 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)96小時后加入5g//L噻唑藍(MTT)染料20微升、孔，繼續(xù)培養(yǎng) 4小時后吸出培養(yǎng)上清，每孔加100微升DMS0，震搖10分鐘后測定0D5TO。用本方法測定的馬GMCSF的活性為hl06U/mg。從上可以看出，本發(fā)明的提取和純化用誘導(dǎo)型原核表達系統(tǒng)表達的重組馬GMCSF 的方法包括下列步驟1)細菌細胞的發(fā)酵，II)包涵體的提取和純化，III)表達蛋白的變性和復(fù)性，IV)親和層析純化，和任選V)超濾濃縮添加保護劑和/或冷凍干燥保存。根據(jù)這種方法，實施發(fā)酵(步驟I)直到獲得培養(yǎng)基中高細菌密度，高細菌密度是由培養(yǎng)物的高光學(xué)密度得到體現(xiàn)。步驟(II)包括細菌裂解、DNA破裂和包涵體分離。通過包涵體溶解于變性緩沖液并稀釋，同時添加氧化還原劑和長時間攪拌來獲得表達蛋白的復(fù)性(步驟III)。在步驟(IV)中，表達的GMCSF蛋白與其它雜蛋白分離，隨后超濾濃縮，添加保護劑并冷凍干燥。 結(jié)果表明，采用本發(fā)明的方法可以高表達、高純度地獲得具有生物學(xué)活性的重組馬GMCSF。綜上，本發(fā)明的重組馬GMCSF的制備方法設(shè)計巧妙，從而可以高表達、高純度地獲得具有生物學(xué)活性的重組馬GMCSF，進而可以作為免疫馬匹時的佐劑，以增強動物的免疫反應(yīng)，提高抗體的滴度，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書和附圖應(yīng)被認為是說明性的而非限制性的。
權(quán)利要求
1.一種重組馬GMCSF的制備方法，其特征在于，將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的編碼馬GMCSF的核苷酸序列構(gòu)建入原核細胞誘導(dǎo)表達載體中，然后轉(zhuǎn)入原核細胞進行培養(yǎng)后誘導(dǎo)表達，并進行純化，從而獲得所述重組馬GMCSF。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組馬GMCSF的制備方法，其特征在于，所述核苷酸序列是如 SEQ ID NO 1所示的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組馬GMCSF的制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)包括預(yù)接種的預(yù)備步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組馬GMCSF的制備方法，其特征在于，所述原核細胞是細菌細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組馬GMCSF的制備方法，其特征在于，所述細菌細胞是大腸桿菌細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組馬GMCSF的制備方法，其特征在于，所述大腸桿菌細胞是大腸桿菌BL21(DE3)細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組馬GMCSF的制備方法，其特征在于，所述原核細胞誘導(dǎo)表達載體是非分泌表達載體，在所述誘導(dǎo)表達后，裂解培養(yǎng)得到的原核細胞，斷裂DNA和分離包涵體，所述包涵體中含有所述重組馬GMCSF，將所述包涵體溶于變性緩沖液得到變性溶液，然后使所述變性溶液中的蛋白復(fù)性得到復(fù)性溶液，再進行所述純化。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組馬GMCSF的制備方法，其特征在于，所述非分泌表達載體是T7表達載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組馬GMCSF的制備方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)表達通過乳糖、IPTG或功能相同的類似物進行。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組馬GMCSF的制備方法，其特征在于，所述裂解采用凍融法或高壓細胞破碎儀進行。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組馬GMCSF的制備方法，其特征在于，所述斷裂DNA采用生化或物理方法使DNA斷裂。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組馬GMCSF的制備方法，其特征在于，所述分離包涵體通過至少兩個循環(huán)的離心和洗滌，洗滌緩沖液內(nèi)含IM尿素，0. 5-1. OM氯化鈉，pH在7. 0-8. 0 之間。
13.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組馬GMCSF的制備方法，其特征在于，所述變性緩沖液是含尿素、異硫氰酸胍或鹽酸胍的變性緩沖液。
14.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組馬GMCSF的制備方法，其特征在于，所述變性緩沖液加入所述包涵體中并采用勻漿或超聲處理從而將所述包涵體溶于所述變性緩沖液。
15.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組馬GMCSF的制備方法，其特征在于，所述復(fù)性通過在所述變性溶液中添加氧化/還原劑并在溫度10-30°C攪拌10-30小時實現(xiàn)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的重組馬GMCSF的制備方法，其特征在于，在加入所述氧化/ 還原劑之前，先稀釋所述變性溶液至OD28tl達到0. 01-2，所述氧化/還原劑是氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽，所述氧化型谷胱甘肽的濃度在0. ImM和2. 5mM之間，所述還原型谷胱甘肽的濃度在0. 25mM和6. 25mM之間。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組馬GMCSF的制備方法，其特征在于，所述重組馬GMCSF帶有6x His標簽，所述純化采用親和層析將所述重組馬GMCSF以單體形式分離。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的重組馬GMCSF的制備方法，其特征在于，所述親和層析采用 Ni-親和層柝柱層柝。
19.一種密碼子優(yōu)化的編碼馬GMCSF的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列是如 SEQ ID NO :1所示的序列，適于根據(jù)權(quán)利要求1-18任一所述的重組馬GMCSF的制備方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組馬GMCSF的制備方法，將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的編碼馬GMCSF的核苷酸序列構(gòu)建入原核細胞誘導(dǎo)表達載體中，然后轉(zhuǎn)入原核細胞進行培養(yǎng)后誘導(dǎo)表達，并進行純化，從而獲得重組馬GMCSF，較佳地，原核細胞誘導(dǎo)表達載體是非分泌表達載體，在誘導(dǎo)表達后，裂解培養(yǎng)得到的原核細胞，斷裂DNA和分離包涵體，包涵體中含有重組馬GMCSF，將包涵體溶于變性緩沖液得到變性溶液，然后使變性溶液中的蛋白復(fù)性得到復(fù)性溶液，再進行純化，重組馬GMCSF最好帶有標簽，采用相關(guān)親和層析柱層析純化，本發(fā)明設(shè)計巧妙，從而可以高表達、高純度地獲得具有生物學(xué)活性的重組馬GMCSF，進而可以作為免疫馬匹時的佐劑，以增強動物的免疫反應(yīng)，提高抗體的滴度，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
文檔編號C12N15/19GK102212542SQ20111009026
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月11日
發(fā)明者孫九如, 楊濤, 王靜, 范志和 申請人:上海賽倫生物技術(shù)有限公司