專利名稱：一種檢測土壤和沉積物中細菌數(shù)量的熒光顯微計數(shù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境微生物學領(lǐng)域，涉及一種環(huán)境總細菌數(shù)量的檢測技術(shù)，具體涉及一種土壤和沉積物中細菌總數(shù)熒光顯微計數(shù)的樣品前處理和熒光顯微觀察的試劑組合和檢測方法。
背景技術(shù)：
熒光染色直接計數(shù)法是最近30年來發(fā)展起來的用于細菌計數(shù)的新方法，它具有快速、準確等特點，在水樣、土壤及沉積物等環(huán)境樣品中細菌數(shù)量的測定中有著廣泛的應(yīng)用。1973年Francisco等針對天然水體中的細菌總數(shù)測定，首先建立了基于AO染色體系的熒光顯微鏡染色計數(shù)法。1980年P(guān)orter等開始采用DAPI對細菌進行染色。Velji等在 Porter等的基礎(chǔ)上采用超聲波對海水、沉積物中的細菌以及海藻樣品進行了前處理，再經(jīng) DAPI染色法進行計數(shù)，取得較好效果。Limau等采用STOR Green I熒光染料染色法測定了海水和沉積物中細菌數(shù)量，并與DAPI、AO的染色計數(shù)對比，發(fā)現(xiàn)STOR Green I與DNA結(jié)合的特異性更高，染色計數(shù)的效果更好。在傳統(tǒng)膜法計數(shù)土壤或沉積物中細菌總數(shù)中，樣品的前處理至關(guān)重要。由于土壤或沉積物中包含大量與基質(zhì)顆粒結(jié)合的細菌，分布極不均勻，且某些部分可能受到不透明的礦物微粒對熒光染料吸收的影響使得熒光顯微鏡下的成像不明顯，并且由于微生物細胞產(chǎn)生的胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)與微粒有著緊密的結(jié)合形成團聚體，因而可能未被計數(shù)。為了獲得準確測量結(jié)果，細菌與基質(zhì)顆粒的分離成為膜法熒光顯微鏡觀察測定前處理的技術(shù)關(guān)鍵。這些分離方法主要分為物理法(包括離心沉降、 振蕩、超聲波處理、稀釋等)、化學法(使用焦磷酸鈉、表面活性劑、甲醇、等分散劑)和酶處理法(EPS酶)。目前通行的做法是幾種前處理方法聯(lián)用，彌補單一處理方法的不足。但是總體而言，滿足膜法熒光顯微計數(shù)的前處理方法比較費時費力，不適于大量樣本的快速檢測。如Amalfitano等在分離河床沉積物中的細菌時采用了焦磷酸鈉和聚山梨醇酯處理的化學法以及振蕩和超聲波處理結(jié)合密度梯度離心的物理法處理樣品，雖然最終約93%的細菌細胞被回收，但整個前處理耗時2. 5小時。傳統(tǒng)膜法檢測中使用的濾膜分有機和無機濾膜兩類。有機濾膜使用較早，相對低廉，但濾膜要經(jīng)過染色處理，比較費時，不適于快速檢測，如李影等的專利“細菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)熒光顯微鏡觀察與計數(shù)方法”中使用的濾膜要經(jīng)過疏水處理和染色烘干后才能用于用于熒光顯微觀察?，F(xiàn)在常用的濾膜是氧化鋁無機濾膜。無機濾膜無需染色，使用方便，但價格較貴。此外，膜法的抗褪色處理是在膜上進行的，這一處理過程最主要的缺點是膜上抗褪色劑附著量少，抗褪色效果較差，染料熒光淬滅較快，不利于觀察計數(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種省時省力、成本低廉、抗褪色效果更好，并且能快速準確檢測出泥土和沉積物中細菌數(shù)量的方法。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)(1)緩沖液配制稱取0. 446g焦磷酸鈉和0. 15g EDTA，溶于IOOml無菌蒸餾水中， 制成樣品稀釋液；稱取0. Ig對苯二胺，溶于Iml PBS-甘油緩沖液中，制成抗褪色劑。(2)樣品前處理稱取0. Ig泥樣到無菌Eppendolf管中，加入Iml樣品稀釋液，渦旋振蕩5min，制成均勻懸濁液。取0. Iml懸濁液到0. 9ml樣品稀釋液中，渦旋振蕩5min，制成樣品計數(shù)液。取80 μ 1樣品計數(shù)液到200 μ 1的離心管中，加入10 μ 1 IOX的STOR Green I熒光染料，避光染色Imin后加入10 μ 1抗褪色劑，制成染色樣品。(3)熒光顯微計數(shù)將潔凈的蓋玻片蓋在干凈的血球計數(shù)板計數(shù)室上，渦旋混勻染色樣品，用移液器取20μ 1染色樣品，沿蓋玻片邊緣加樣，使染色樣品充滿計數(shù)室。將加樣的血球計數(shù)板靜置5min，置熒光顯微鏡載物臺上，以480nm光波激發(fā)，40倍物鏡下觀察， 計數(shù)5個中方格中細菌顆粒的數(shù)量。最后按公式Y(jié) = 31. 25XAX IO6計算出Ig樣品中細菌的數(shù)量，其中Y表示Ig樣品中細菌的數(shù)量，A表示一個中方格中細菌的平均數(shù)。本發(fā)明的主要優(yōu)點是1、本發(fā)明無需繁瑣的樣品前處理工作，大大縮短了樣品前處理時間，提高了檢測效率，比傳統(tǒng)熒光顯微方法省時省力，能快速準確檢測出泥土和沉積物中細菌的數(shù)量。2、本發(fā)明在檢測過程中無需使用昂貴的無機濾膜，降低了檢測成本。3、本發(fā)明改變了抗褪色處理方法，顯著提高了抗褪色效果。


圖1 是染色后的沉積物細菌在血球計數(shù)板中通過40倍物鏡觀察的效果圖。圖2 是血球計數(shù)板熒光顯微計數(shù)法獲得的池塘沉積物細菌總數(shù)。
具體實施例方式以下結(jié)合說明書附圖和實施例對本發(fā)明做進一步的說明，但不是限制本發(fā)明。實施例1三種計數(shù)方法的比較用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌DH5 α (華中師范大學楊嬌艷老師惠贈)至其 600nm處的吸光值為0. 2 0. 3時，用0. 9%的生理鹽水進行適當稀釋。平板計數(shù)法選擇合適的稀釋梯度，吸取0. 2毫升涂布平板，使每個平板上面生長的菌落個數(shù)在30 300之間。37°C培養(yǎng)3 后計數(shù)平板上菌落數(shù)，根據(jù)菌落個數(shù)計算原始菌液的濃度。每毫升菌液細菌數(shù)=同一稀釋度3次重復的菌落平均數(shù)X稀釋倍數(shù)。血球計數(shù)板熒光顯微計數(shù)法取稀釋后的樣品80μ 1于200μ 1的離心管中，添加 10 μ 1 IOX的STOR Green I熒光染料，染色1分鐘后加入10 μ 1抗褪色劑。將潔凈的蓋玻片蓋在干凈的血球計數(shù)板計數(shù)室上，渦旋混勻染色樣品，用移液器取20 μ 1染色樣品，沿蓋玻片邊緣加樣，使染色樣品充滿計數(shù)室。將加樣的血球計數(shù)板靜置5min，置熒光顯微鏡載物臺上，以480nm光波激發(fā)，40倍物鏡下觀察。計數(shù)時用25中方格的計數(shù)板，按對角線方位，取左上、左下、右上、右下和中間的5個中方格進行計數(shù)。每毫升菌液細菌數(shù)按公式Y(jié) = 31. 25XAXCX 104，其中Y為每毫升菌液細菌數(shù)，A為每中方格細菌平均數(shù)，C為稀釋倍數(shù)。濾膜熒光顯微計數(shù)法取80 μ 1適當稀釋的樣品，按照血球計數(shù)板方法中的描述對細菌進行染色和抗褪色處理，然后用無菌生理鹽水稀釋至25ml，最后經(jīng)0. 22 μ m無機濾膜過濾。將濾膜置載玻片上，熒光顯微鏡下以480nm光波激發(fā)，40倍物鏡下觀察，隨機計數(shù) 5個視野的細菌顆粒數(shù)。每毫升菌液細菌數(shù)按公式Y(jié)= 1.25XPXKXC計算，其中Y為每毫升菌液細菌數(shù)，P為每個視野中細菌的平均數(shù)，K為濾膜的視野數(shù)，C為稀釋倍數(shù)。利用上述3種方法對3個DH5 α培養(yǎng)物進行了計數(shù)，所得結(jié)果見表1，結(jié)果證明血球計數(shù)板熒光顯微計數(shù)法檢出率要高于其他2種方法。表1. 3種計數(shù)方法計數(shù)大腸桿菌DH5 α結(jié)果比較
權(quán)利要求
1.一種檢測土壤和沉積物中細菌數(shù)量的熒光顯微計數(shù)方法，其特征在于包括以下步驟(1)緩沖液的配制用焦磷酸鈉和EDTA溶于無菌蒸餾水中，配制成樣品稀釋液；用對苯二胺溶于PBS-甘油緩沖液中，配制成抗褪色劑；(2)樣品前處理稱取0.Ig泥樣到無菌Eppendolf管中，加入Iml樣品稀釋液，渦旋振蕩5min，制成均勻懸濁液，取0. Iml懸濁液到0. 9ml樣品稀釋液中，渦旋振蕩5min，制成樣品計數(shù)液，取80 μ 1樣品計數(shù)液到200 μ 1的離心管中，加入10 μ 1 IOX的STOR Green I 熒光染料，避光染色Imin后加入10 μ 1抗褪色劑，制成染色樣品；(3)熒光顯微計數(shù)將潔凈的蓋玻片蓋在干凈的血球計數(shù)板計數(shù)室上，渦旋混勻染色樣品，用移液器取20 μ 1染色樣品，沿蓋玻片邊緣加樣，使染色樣品充滿計數(shù)室，將加樣的血球計數(shù)板靜置5min，置熒光顯微鏡載物臺上，以480nm光波激發(fā)，40倍物鏡下觀察，計數(shù) 5個中方格中細菌顆粒的數(shù)量，最后按公式Y(jié) = 31. 25XAX IO6計算出Ig樣品中細菌的數(shù)量，其中Y表示Ig樣品中細菌的數(shù)量，A表示一個中方格中細菌的平均數(shù)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測土壤和沉積物中細菌數(shù)量的熒光顯微計數(shù)方法，其特征在于所述樣品稀釋液是將0.446g焦磷酸鈉和0. 15g EDTA，溶于IOOml無菌蒸餾水中配制而成的。
3.如權(quán)利要求1所述的一種檢測土壤和沉積物中細菌數(shù)量的熒光顯微計數(shù)方法，其特征在于所述抗褪色劑是將0. Ig對苯二胺溶于Iml PBS-甘油緩沖液中配制而成的。
4.如權(quán)利要求1所述的一種檢測土壤和沉積物中細菌數(shù)量的熒光顯微計數(shù)方法，其在檢測土壤和沉積物中細菌數(shù)量的應(yīng)用。
全文摘要
一種檢測土壤和沉積物中細菌數(shù)量的熒光顯微計數(shù)方法，屬于環(huán)境微生物學領(lǐng)域。所述檢測方法包括以下步驟(1)配制樣品稀釋液和抗褪色劑；(2)將樣品加入到樣品稀釋液中進行處理，制成樣品計數(shù)液。取樣品計數(shù)液到離心管中，加入10×的SYBR Green I熒光染料，避光染色后加入抗褪色劑，制成染色樣品；(3)將潔凈的蓋玻片蓋在干凈的血球計數(shù)板計數(shù)室上，渦旋混勻染色樣品，用移液器取染色樣品，沿蓋玻片邊緣加樣，使染色樣品充滿計數(shù)室。將加樣的血球計數(shù)板靜置5min，置熒光顯微鏡載物臺上，以480nm光波激發(fā)，40倍物鏡下觀察，計數(shù)5個中方格中細菌顆粒的數(shù)量。最后按公式Y(jié)＝31.25×A×106計算出1g樣品中細菌的數(shù)量，其中Y表示1g樣品中細菌的數(shù)量，A表示一個中方格中細菌的平均數(shù)。該方法省時省力、成本低廉、抗褪色，能快速準確檢測出泥土和沉積物中細菌的數(shù)量。
文檔編號C12Q1/06GK102321729SQ20111018770
公開日2012年1月18日 申請日期2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月6日
發(fā)明者何緒剛, 廖明軍, 張敏, 謝從新, 陸詩敏 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學