本發(fā)明涉及體外核酸檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種檢測CYP2C9基因分型的引物探針組及試劑盒。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞色素P4502C9(Cyt℃hromeP4502C9，CYP2C9)占肝微粒體P450總量的20％，能催化代謝許多臨床常用藥物，其在臨床藥物代謝中的重要性越來越受到重視。CYP2C9具有高度遺傳多態(tài)性，較常見的基因突變體是CYP2C9*2(rs1799853)和CYP209*3(rs1057910)，其編碼的酶活性分別比野生型CYP2C9*1降低了30％和80％，導(dǎo)致CYP2C9基因突變個(gè)體對華法林的需求劑量較低。攜帶這兩個(gè)等位基因的個(gè)體服用華法林后達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度需要的時(shí)間較長，且在使用初期有較高出血危險(xiǎn)性，因此CYP2C9*2或CYP2C9*3基因型個(gè)體服用華發(fā)林時(shí)應(yīng)減少劑量，但是等位基因突變個(gè)體長期治療過程中過度抗凝的危險(xiǎn)性沒有增加。其他突變體CYP2C9*4，CYP2C9*5，CYP2C9*6以及CYP2C9*1l等在人群中突變頻率很低，其對華法林需求劑量的影響還有待于進(jìn)一步研究。CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因頻率在不同種族中有較大差異。高加索人中，CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因頻率大約分別是8％～20％和6％～10％。而CYP2C9*2在亞洲人群中不存在，在美洲黑人中大約是2％～4％。CYP2C9*3在亞洲人中的頻率是l％～4％，在美洲黑人中是l％～2％。華法林是一種雙香豆素衍生物，是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的口服抗凝藥物之一，用于預(yù)防和治療深靜脈血栓、肺栓塞、心臟瓣膜置換術(shù)及房顫導(dǎo)致的血栓形成。華法林治療窗較窄，很小的劑量都可能導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生，且在不同個(gè)體達(dá)到相同作用效果，高低劑量者之間可相差10倍以上。華法林是由S-華法林和R-華法林組成的消旋體，在體內(nèi)S-華法林反映了60％～70％的抗凝活性，而R-華法林占30％～40％，其中S-華法林主要由CYP2C9代謝，故CYP2C9基因多態(tài)性對華法林劑量影響較大。Sconce等的臨床研究結(jié)果顯示：達(dá)到相同抗凝效果時(shí)，CYP2C9*2、*3基因型患者的使用劑量較野生型患者低。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)明確指出：在使用華法林時(shí)，建議檢測CYP2C9基因型。目前醫(yī)院用于CYP2C9基因檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”是PCR-直接測序法，但直接測序法的敏感性不高，相比于直接測序法，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的靈敏性更高、成本更低。ARMS也稱作等位基因特異性PCR(AlleleSpecificPCR，AS-PCR)，其原理是PCR引物的3’端末位堿基與其模板DNA存在錯(cuò)配時(shí)，一般將導(dǎo)致擴(kuò)增效率急劇下降，設(shè)計(jì)等位基因特異性PCR擴(kuò)增引物，在嚴(yán)格的條件下，只有在引物3’堿基與模板配對時(shí)才能出現(xiàn)PCR擴(kuò)增信號，從而檢測出突變。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timeQuantitativePCR，QPCR)技術(shù)于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。QPCR技術(shù)一般分為探針法和染料法，本試劑盒采用的是TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。目前市場上還沒有利用ARMS結(jié)合QPCR技術(shù)進(jìn)行CYP2C9的基因多態(tài)性檢測的產(chǎn)品。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述方法檢測CYP2C9基因分型過程中存在敏感性不高、檢測周期長、操作繁瑣及成本高的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測周期短、操作簡單并有效滿足臨床檢驗(yàn)要求的檢測CYP2C9基因分型的引物探針組及試劑盒。本發(fā)明提供了一種檢測CYP2C9基因分型的引物探針組，所述CYP2C9基因檢測的多態(tài)性位點(diǎn)為CYP2C9*2和CYP2C9*3，所述引物探針組包括：對于CYP2C9*2等位基因，包括擴(kuò)增CYP2C9*2野生型和突變型的通用下游引物：5’-CCAAGAATGTCAGTAGAGAAGATAG-3’(SEQIDNO.1)；擴(kuò)增CYP2C9*2野生型和突變型的通用探針：5’FAM-TGTTCAAGAGGAAGCCCGCTGCC-TAMRA3’(SEQIDNO.2)；擴(kuò)增CYP2C9*2野生型的上游引物：5’-AAGAGGAGCATTGAGGTCC-3’(SEQIDNO.3)；擴(kuò)增CYP2C9*2突變型的上游引物：5’-GAAGAGGAGCATTGAGGTCT-3’(SEQIDNO.4)；對于CYP2C9*3等位基因，包括擴(kuò)增CYP2C9*3野生型和突變型的通用下游引物：5’-GCAAGACAGGAGCCACATG-3’(SEQIDNO.5)；擴(kuò)增CYP2C9*3野生型和突變型的通用探針：5’FAM-ATCTCTGGACCTCGTGCACCACAGC-TAMRA3’(SEQIDNO.6)；擴(kuò)增CYP2C9*3野生型的上游引物：5’-TGGTGGGGAGAAGGTCCAT-3’(SEQIDNO.7)；擴(kuò)增CYP2C9*3突變型的上游引物：5’-TGGTGGGGAGAAGGTCCAG-3’(SEQIDNO.8)；以及擴(kuò)增內(nèi)控GAPDH基因的上游引物：5’-CACATGGCCTCCAAGGAGTAA-3’(SEQIDNO.9)；擴(kuò)增內(nèi)控GAPDH基因的下游引物：5’-TGAGGGTCTCTCTCTTCCTCTTGT-3’(SEQIDNO.10)；擴(kuò)增內(nèi)控GAPDH基因的探針：5’JOE-CTGGACCACCAGCCCCAGCAAG-TAMRA3’(SEQIDNO.11)。本發(fā)明還提供了一種檢測CYP2C9基因分型的試劑盒，所述CYP2C9基因檢測的多態(tài)性位點(diǎn)為CYP2C9*2和CYP2C9*3，所述試劑盒包括：PCR反應(yīng)液1，所述PCR反應(yīng)液1含有SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10及SEQIDNO.11所示的擴(kuò)增引物及探針；PCR反應(yīng)液2，所述PCR反應(yīng)液2含有SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10及SEQIDNO.11所示的擴(kuò)增引物及探針；PCR反應(yīng)液3，所述PCR反應(yīng)液3含有SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10及SEQIDNO.11所示的擴(kuò)增引物及探針；PCR反應(yīng)液4，所述PCR反應(yīng)液4含有SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10及SEQIDNO.11所示的擴(kuò)增引物及探針。在本發(fā)明提供的所述試劑盒的一種較佳實(shí)施例中，所述試劑盒還包括陽性對照品，其為插有SEQIDNO.1和SEQIDNO.3擴(kuò)增產(chǎn)物的CYP2C9*2野生純合子質(zhì)粒、插有SEQIDNO.1和SEQIDNO.4擴(kuò)增產(chǎn)物的CYP2C9*2突變純合子質(zhì)粒、插有SEQIDNO.5和SEQIDNO.7擴(kuò)增產(chǎn)物的CYP2C9*3野生純合子質(zhì)粒、插有SEQIDNO.5和SEQIDNO.8擴(kuò)增產(chǎn)物的CYP2C9*3突變純合子質(zhì)粒及插有SEQIDNO.9和SEQIDNO.10擴(kuò)增產(chǎn)物的內(nèi)控GAPDH質(zhì)粒的上述五種質(zhì)粒組成的質(zhì)?；旌衔?；其中，質(zhì)粒載體為pMD18-T質(zhì)粒；所述質(zhì)?；旌衔镏蠧YP2C9*2突變純合子質(zhì)粒、CYP2C9*2野生純合子質(zhì)粒、CYP2C9*3突變純合子質(zhì)粒、CYP2C9*3野生純合子質(zhì)粒和內(nèi)控GAPDH質(zhì)粒的數(shù)量比為1：1：1：1：2。在本發(fā)明提供的所述試劑盒的一種較佳實(shí)施例中，所述試劑盒還包括空白對照品，所述空白對照品為超純水。在本發(fā)明提供的所述試劑盒的一種較佳實(shí)施例中，所述PCR反應(yīng)液1-4中其他組分為常規(guī)的2xMixBuffer和H2O，PCR反應(yīng)參數(shù)及體系為:95℃30s；95℃10s，58℃30s(采集熒光)，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，原料名稱加入量(μL)2xMixBuffer(含ROX)10上游引物0.75下游引物0.75探針0.5內(nèi)控上游引物0.25內(nèi)控下游引物0.25內(nèi)控探針0.5DNA模板1去離子水11總體積25本發(fā)明還提供了如上所述的引物探針組在制備用于檢測CYP2C9基因分型的試劑中的應(yīng)用。相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的檢測CYP2C9基因分型的引物探針組及試劑盒具有以下有益效果：一、通過利用ARMS技術(shù)結(jié)合QPCR技術(shù)設(shè)計(jì)了靈敏度高和特異性好的引物探針組及其試劑盒，使得所述試劑盒在檢測CYP2C9基因分型時(shí)，具有定性準(zhǔn)確，靈敏度高及特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)；此外，還具有樣品處理簡單、測序步驟簡單、測序速度快、一個(gè)小時(shí)完成一次上機(jī)反應(yīng)、直接給出檢測位點(diǎn)熒光曲線及結(jié)果直觀的優(yōu)點(diǎn)；二、通過利用ARMS技術(shù)結(jié)合QPCR技術(shù)設(shè)計(jì)了靈敏度高和特異性好的引物探針組及其試劑盒，使得所述試劑盒在檢測CYP2C9基因分型時(shí)，可實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程、反應(yīng)時(shí)間短、操作簡便及高通量樣品檢測，PCR反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行熒光采集，并比金標(biāo)準(zhǔn)方法，即毛細(xì)管電泳測序法靈敏度更高，更適合用于突變分析及臨床檢驗(yàn)；三、通過在所述試劑盒中設(shè)置了空白對照品和陽性對照品，使得所述試劑盒在檢測CYP2C9基因分型時(shí)，可以更好的確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。附圖說明圖1為華法林作用機(jī)制及CYP2C9效應(yīng)示意圖；圖2為臨床樣品CYP2C9*2野生型的熒光擴(kuò)增曲線圖；圖3為臨床樣品CYP2C9*2突變雜合型的熒光擴(kuò)增曲線圖；圖4為臨床樣品CYP2C9*2突變純合型的熒光擴(kuò)增曲線圖；圖5為臨床樣品CYP2C9*3野生型的熒光擴(kuò)增曲線圖；圖6為臨床樣品CYP2C9*3突變雜合型的熒光擴(kuò)增曲線圖；圖7為臨床樣品CYP2C9*3突變純合型的熒光擴(kuò)增曲線圖；圖8為臨床CYP2C9陽性對照品的熒光擴(kuò)增曲線圖；圖9為臨床CYP2C9空白對照品的熒光擴(kuò)增曲線圖；圖10至圖11為CYP2C9*2多組設(shè)計(jì)引物的熒光擴(kuò)增曲線圖；其中圖10的測序結(jié)果不準(zhǔn)確，圖11的測序結(jié)果真實(shí)可靠；圖12至圖13為CYP2C9*3多組設(shè)計(jì)引物的熒光擴(kuò)增曲線圖；其中圖12的測序結(jié)果不準(zhǔn)確，圖13的測序結(jié)果真實(shí)可靠。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例1：試劑盒的制備一、引物和探針的設(shè)計(jì)與合成針對人CYP2C9基因的多態(tài)性位點(diǎn)CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因，選擇特異的突變位點(diǎn)，選用的引物和探針設(shè)計(jì)在CYP2C9突變位點(diǎn)和附近的保守區(qū)，避免在引物結(jié)合區(qū)域出現(xiàn)有SNP(通過在線NCBI網(wǎng)站對靶基因序列的SNP進(jìn)行檢索)，通過在線NCBI網(wǎng)站進(jìn)行PrimerBlast，確認(rèn)引物對的特異性擴(kuò)增。探針位于一對引物之間的區(qū)域，且避免其結(jié)合區(qū)域出現(xiàn)有SNP；其中擴(kuò)增引物和熒光探針先經(jīng)過PAGE純化，再經(jīng)HPLC純化，其中目的探針SEQIDNO.2和SEQIDNO.6的5’端采用熒光報(bào)告基團(tuán)(FAM)標(biāo)記，內(nèi)控探針SEQIDNO.11的5’端采用熒光報(bào)告基團(tuán)(JOE)標(biāo)記，3’端均采用熒光淬滅基團(tuán)(TAMRA)標(biāo)記。表1.突變位點(diǎn)與類型MutationBasechangeCYP2C9*2(rs1799853)C>TCYP2C9*3(rs1057910)A>C擴(kuò)增序列如表2：表2.特異性擴(kuò)增引物與探針序列二、對照品選擇陽性對照品由5種質(zhì)粒的混合物組成，所述質(zhì)?；旌衔镏蠧YP2C9*2突變純合子質(zhì)粒、CYP2C9*2野生純合子質(zhì)粒、CYP2C9*3突變純合子質(zhì)粒、CYP2C9*3野生純合子質(zhì)粒和內(nèi)控GAPDH質(zhì)粒的數(shù)量比為1：1：1：1：2；DNase/RNase-Free水為空白對照品。三、PCR反應(yīng)液組成表3.PCR反應(yīng)液1組成原料名稱加入量(μL)2xMixBuffer(含ROX)10SEQIDNO.30.75SEQIDNO.10.75SEQIDNO.20.5SEQIDNO.90.25SEQIDNO.100.25SEQIDNO.110.5去離子水11總體積24表4.PCR反應(yīng)液2組成原料名稱加入量(μL)2xMixBuffer(含ROX)10SEQIDNO.40.75SEQIDNO.10.75SEQIDNO.20.5SEQIDNO.90.25SEQIDNO.100.25SEQIDNO.110.5去離子水11總體積24表5.PCR反應(yīng)液3組成原料名稱加入量(μL)2xMixBuffer(含ROX)10SEQIDNO.70.75SEQIDNO.50.75SEQIDNO.60.5SEQIDNO.90.25SEQIDNO.100.25SEQIDNO:110.5去離子水11總體積24表6.PCR反應(yīng)液4組成由于針對兩個(gè)檢測位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，所以有4種不同的PCR反應(yīng)液，分別對CYP2C9*2和CYP2C9*3位點(diǎn)進(jìn)行檢測。實(shí)施例2：試劑盒的使用一、樣品檢測溶解引物探針干粉(引物溶解后有效期為1個(gè)月)。按照模板數(shù)配制體系：取PCR反應(yīng)液，加入溶好的引物、探針，分裝體系，加入樣品DNA、空白對照品或陽性對照品為模板，組成PCR反應(yīng)體系。按照PCR反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。CYP2C9*2體系各主要成分如下：表7.PCR反應(yīng)液1組成原料名稱加入量(μL)2xMixBuffer(含ROX)10SEQIDNO.30.75SEQIDNO.10.75SEQIDNO.20.5SEQIDNO.90.25SEQIDNO.100.25SEQIDNO.110.5DNA模板1去離子水11總體積25表8.PCR反應(yīng)液2組成CYP2C9*3體系各主要成分如下：表9.PCR反應(yīng)液3組成原料名稱加入量(μL)2xMixBuffer(含ROX)10SEQIDNO.70.75SEQIDNO.50.75SEQIDNO.60.5SEQIDNO.90.25SEQIDNO.100.25SEQIDNO.110.5DNA模板1去離子水11總體積25表10.PCR反應(yīng)液4組成該體系反應(yīng)程序如下：表11.PCR反應(yīng)程序二、ABI7500熒光定量PCR按下右端開機(jī)鍵，啟動(dòng)ABI7500。開機(jī)后機(jī)器左端“power”指示燈長亮。打開倉門，將配好的試劑放入倉內(nèi)，記好自己擺放的位置。1)雙擊“7500Softwarev2.0.5”圖標(biāo)打開軟件。在彈出的窗口中點(diǎn)擊“OK”進(jìn)入程序。2)單擊“NewExperiment”，在彈出的“ExperimentProperties”界面中依次選中“7500(96wells)”、“Quantitaion-StandadCurve”、“Reagents”圖標(biāo)使其變亮。3)點(diǎn)擊“PlateSetup”，在“Reporter”欄內(nèi)的下拉選框里選擇“FAM”，在“Quencher”欄內(nèi)的下拉選框里選擇“TAMRA”，點(diǎn)擊“AddNewTarget”，在“Reporter”欄內(nèi)的下拉選框里選擇“JOE”，在“Quencher”欄內(nèi)的下拉選框里選擇“TAMRA”；反復(fù)點(diǎn)擊“AddNewTarget”，使“SampleName”下方彈出足夠數(shù)量的方框，在這些方框內(nèi)輸入各樣本的唯一編號。4)點(diǎn)擊“AssignTargetsandSamples”，在“PassiveReference”欄內(nèi)的下拉選框里選擇“ROX”，選中試劑所放的孔位，確認(rèn)與儀器相對應(yīng)，在“Assignsample(s)totheselectedwells”欄內(nèi)的方框里打“√”，在“Assigntarget(s)totheselectedwells”欄內(nèi)的方框里打“√”，并點(diǎn)擊對應(yīng)的圖標(biāo)使其變亮：“U”(待測樣本)、“S”(陽性對照)、“N”(空白對照)。5)反應(yīng)條件設(shè)置：單擊“RunMethod”進(jìn)入反應(yīng)條件設(shè)置面板，制定所需的擴(kuò)增程序，在“HoldingStage”欄內(nèi)設(shè)置95℃30秒，將光標(biāo)移至“CyclingStage”欄，在第1節(jié)“Step1”中設(shè)置95℃10秒，在“Step2”中設(shè)置58℃30秒，并在該節(jié)中點(diǎn)擊熒光采集圖標(biāo)使其變亮，在“NumberofCycles”欄內(nèi)輸入45，并在“ReactionVolumePerWell”欄內(nèi)輸入25。6)確認(rèn)無誤后，點(diǎn)擊“STARTR…”對當(dāng)次PCR編號并保存在對應(yīng)的文件夾，點(diǎn)擊確定，開始運(yùn)行。開始后會有一段預(yù)熱，正式開始循環(huán)時(shí)“INUSE”指示燈閃爍。7)運(yùn)行完后，打開倉門，將產(chǎn)物倒入垃圾桶，填寫儀器使用記錄。三、結(jié)果判斷反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行自動(dòng)調(diào)整基線和閾值。設(shè)定之后，點(diǎn)擊“Analyse”(分析)按鍵，即可從“ViewWellTable”窗口的“Ct”處得到各樣本的Ct值。四、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)對于CYP2C9*2：配有PCR反應(yīng)液1的反應(yīng)管Ct值定為Ct1，配有PCR反應(yīng)液2的反應(yīng)管Ct值定為Ct2，△Ct＝Ct2-Ct1；對于CYP2C9*3：配有PCR反應(yīng)液3的反應(yīng)管Ct值定為Ct3，配有PCR反應(yīng)液4的反應(yīng)管Ct值定為Ct4，△Ct＝Ct4-Ct3。陽性對照的Ct≤32，-1.7≤△Ct≤3.4；空白對照無S型擴(kuò)增曲線或無Ct值顯示。以上條件必須在同一次實(shí)驗(yàn)中全部滿足，否則本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效。五、結(jié)果報(bào)告：對于待檢樣本：1)若Ct﹥32，說明DNA質(zhì)量太低，需要重新提取DNA或更換樣本；2)若Ct≤32，即對于ΔCT絕對值>11的樣本定義為相應(yīng)的純合子，-1.640≤ΔCT≤1.370的樣本定義為CYP2C9*2的雜合型，-0.672≤ΔCT≤3.350的樣本定義為CYP2C9*3的雜合型。而3.350≤ΔCT≤11的樣本則需要重做試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)核，重做結(jié)果一致，則認(rèn)定為取樣過程或樣本處理過程存在污染，需要重新取樣。圖1為華法林作用機(jī)制及CYP2C9效應(yīng)示意圖；圖2及圖5分別顯示的是臨床樣品檢測結(jié)果中CYP2C9*2及CYP2C9*3的野生型；圖3及圖6分別顯示的是臨床樣品檢測結(jié)果中CYP2C9*2及CYP2C9*3的雜合型；圖4及圖7分別顯示的是臨床樣品檢測結(jié)果中CYP2C9*2及CYP2C9*3的突變純合型；圖8及圖9分別顯示的是臨床檢測結(jié)果中陽性對照品和空白對照品的熒光擴(kuò)增曲線圖。其中，圖2反應(yīng)液1中FAM曲線Ct1值為28.12，反應(yīng)液2中FAM曲線無Ct1值，△Ct絕對值＞11判定為*2野生型。圖3反應(yīng)液1中FAM曲線Ct1值為31.50，反應(yīng)液2中FAM曲線Ct2值為31.74，△Ct＝31.74-31.50＝0.24，-1.640≤ΔCT≤1.370，判定為*2雜合型。圖4反應(yīng)液1中FAM曲線無Ct1值，反應(yīng)液2中FAM曲線Ct2值為25.88，△Ct絕對值＞11判定為*2突變純合型。圖5反應(yīng)液3中FAM曲線Ct3值為26.14，反應(yīng)液4中FAM曲線無Ct4值，△Ct絕對值＞11判定為*3野生型。圖6反應(yīng)液3中FAM曲線Ct3值為26.64，反應(yīng)液4中FAM曲線Ct4值為28.81，△Ct＝28.81-26.64＝2.17，-0.672≤ΔCT≤3.350，判定為*3雜合型。圖7反應(yīng)液3中FAM曲線無Ct3值，反應(yīng)液4中FAM曲線Ct4值為27.33，△Ct絕對值＞11判定為*3突變純合型。圖8反應(yīng)液1-4FAM曲線均有CT值，JOE曲線也均有CT值。圖9反應(yīng)液1-4FAM曲線均無CT值，JOE曲線也均無CT值。圖10至圖11顯示的是設(shè)計(jì)的CYP2C9*2多組引物的熒光擴(kuò)增曲線圖，其中圖11的引物為最佳，是我們產(chǎn)品中選定的引物；圖12至圖13顯示的是設(shè)計(jì)的CYP2C9*3多組引物的熒光擴(kuò)增曲線圖，其中圖13的引物為最佳，是我們產(chǎn)品中選定的CYP2C9*3引物。本發(fā)明提供的檢測CYP2C9基因分型的引物探針組及試劑盒具有以下有益效果：一、通過利用ARMS技術(shù)結(jié)合QPCR技術(shù)設(shè)計(jì)了靈敏度高和特異性好的引物探針組及其試劑盒，使得所述試劑盒在檢測CYP2C9基因分型時(shí)，具有定性準(zhǔn)確，靈敏度高及特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)；此外，還具有樣品處理簡單、測序步驟簡單、測序速度快、一個(gè)小時(shí)完成一次上機(jī)反應(yīng)、直接給出檢測位點(diǎn)熒光曲線及結(jié)果直觀的優(yōu)點(diǎn)；二、通過利用ARMS技術(shù)結(jié)合QPCR技術(shù)設(shè)計(jì)了靈敏度高和特異性好的引物探針組及其試劑盒，使得所述試劑盒在檢測CYP2C9基因分型時(shí)，可實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程、反應(yīng)時(shí)間短、操作簡便及高通量樣品檢測，PCR反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行熒光采集，并比金標(biāo)準(zhǔn)方法，即毛細(xì)管電泳測序法靈敏度更高，更適合用于突變分析及臨床檢驗(yàn)；三、通過在所述試劑盒中設(shè)置了空白對照品和陽性對照品，使得所述試劑盒在檢測CYP2C9基因分型時(shí)，可以更好的確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其它相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>長沙三濟(jì)生物科技有限公司<120>檢測CYP2C9基因分型的引物探針組及試劑盒<130>2016<160>11<170>PatentInversion3.3<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>1ccaagaatgtcagtagagaagatag25<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2tgttcaagaggaagcccgctgcc23<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>3aagaggagcattgaggtcc19<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4gaagaggagcattgaggtct20<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>5gcaagacaggagccacatg19<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>6atctctggacctcgtgcaccacagc25<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>7tggtggggagaaggtccat19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>8tggtggggagaaggtccag19<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>9cacatggcctccaaggagtaa21<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>10tgagggtctctctcttcctcttgt24<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>11ctggaccaccagccccagcaag22當(dāng)前第1頁1 2 3