本發(fā)明涉及用殼青霉PRB-2 (Penicillium crustosumPRB-2)(保藏編號是: CGMCC 11573 保藏日期：2015年11月03日) 生產(chǎn)包含吲哚生物堿類化合物的方法；本發(fā)明還涉及該類化合物在抗H1N1病毒中的用途。
背景技術(shù)：
本發(fā)明人將殼青霉PRB-2 (Penicillium crustosumPRB-2)(保藏編號是: CGMCC 11573)在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時添加吲哚（終濃度150mg/L），從得到的發(fā)酵產(chǎn)物中分離出一個吲哚生物堿類化合物。研究發(fā)現(xiàn)所示該吲哚生物堿化合物具有顯著的抗病毒活性，表明上述吲哚生物堿進一步有可能開發(fā)成新型抗病毒藥物。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在提供一種結(jié)構(gòu)新穎的具有抗病毒活性的新化合物。其結(jié)構(gòu)式是
式 Ⅰ
本發(fā)明的式Ⅰ化合物可通過微生物在含吲哚的發(fā)酵培養(yǎng)條件下來獲取含有該類化合物的發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中采用Sephadex LH20凝膠柱層析，反相中壓MPLC,反相半制備HPLC方法分離純化得到。
本發(fā)明的下述實施例中列舉了利用PRB-2 (Penicillium crustosumPRB-2)(保藏編號是: CGMCC 11573) 制備本發(fā)明式Ⅰ化合物的實例。
具體實施方式：
在如下的實施例中所指的化合物Ⅰ的化學結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)式中的阿拉伯數(shù)字是化學結(jié)構(gòu)中碳原子或氮原子的標位)是：
化合物Ⅰ
實施例1 化合物Ⅰ的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制
1 發(fā)酵生產(chǎn)
生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)：按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取殼青霉PRB-2 (Penicillium crustosumPRB-2)(保藏編號是: CGMCC 11573)適量，接種到PDA固體平面培養(yǎng)基上，在28攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。
取固體平面培養(yǎng)4天的殼青霉PRB-2 (Penicillium crustosumPRB-2)適量，接種到裝有300 mL培養(yǎng)基[培養(yǎng)基組成（克/升）：可溶性淀粉 40.0，酵母膏 1.0，味精 2.0，蔗糖 40.0，麥芽糖 30.0，黃豆粉 0.5，蛋白胨 2.0，MgSO4 · 7H2O 0.3，KH2PO4 0.5]的1000 mL錐型瓶中，并加入吲哚(45mg, 由500μL DMSO溶解)，使其在培養(yǎng)基中的終濃度150mg/L，在28攝氏度條件下靜置培養(yǎng)30天，獲得發(fā)酵產(chǎn)物。
2 浸膏的獲得
將所得發(fā)酵液直接用等量乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，減壓濃縮，得粗浸膏，共1.2克。
3 化合物的分離精制
浸膏（1.2克）用甲醇溶解后，以甲醇為溶劑進行LH20柱層析，分為4個流份。組分2先以C-18 ODS中壓柱層析，以甲醇-水為溶劑進行梯度洗脫，最后經(jīng)反相半制備高效液相色譜（甲醇：水=75:25）得化合物Ⅰ（15 mg）。
化合物Ⅰ 乳白色粉末，分子式C28H27NO6，HR-ESI-MS m/z: 474.1910 [M+H]+，計算值474.1911。IR (KBr) vmax 3345, 2923, 1625, 1330, 744 cm-1。1H和13C-NMR數(shù)據(jù)見表1。
表 1 化合物Ⅰ的1H和13C NMR數(shù)據(jù)（500和125 MHz，in DMSO-d6）a
a) 本表信號歸屬基于HMQC及HMBC圖譜解析結(jié)果。
b) 此欄中的數(shù)字和代號分別代表在HMBC譜中與相應(yīng)行中的1H給出偶合相關(guān)信號的13C核。
實施例2化合物的抗病毒活性測試
1 實驗樣品及實驗方法
被測樣品溶液的配制 測試樣品為上述實施例1中分離精制的化合物Ⅰ純品。精密稱取適量樣品，用DMSO配制成所需濃度的溶液，供測活性。
抗H1N1流感病毒活性采用CPE 方法測定，及采用細胞培養(yǎng)技術(shù)，以抗病毒藥物利巴韋林為陽性對照藥，比較觀察化合物對流感病毒引起的細胞病變（CPE）的抑制作用。將流感病毒液接種到單層 MDCK 細胞上于37oC 吸附 1 個小時，棄上清液。加入待測化合物 DMSO 溶液（終濃度 50ug/ml），37 oC保溫 48 小時，用 PBS 洗 3 次，結(jié)晶紫溶液（1%的結(jié)晶紫溶解于20%乙醇和3.7%甲醛的水溶液中）染色，之后至于酶標儀上測定 630nm 處的光密度 OD值。
抑制率按照以下公式計算：
病毒抑制率(%)= （藥物對照組OD值-病毒對照組OD值）/（細胞對照組OD值-病毒對照組OD值）*100%
抑制率大于70%視為具有強效抗流感病毒活性，介于50%~70%為中效，介于30%~50%為弱效。
2 實驗結(jié)果
采用CPE 方法對所示化合物Ⅰ抗H1N1流感病毒活性進行了研究，以抗病毒藥物利巴韋林為陽性對照藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所述化合物Ⅰ對流感病毒引起的細胞病變（CPE）有明顯的抑制作用?；衔铫裨?0μg/ml終濃度下對病毒的抑制率為82.5% （陽性對照藥利巴韋林在50μg/ml濃度下抑制率為72.1%），IC50為34μM（陽性對照藥利巴韋林IC50為94 μM）。
3 結(jié)論
化合物Ⅰ具有較好的抗H1N1流感病毒活性，可作為新型抗病毒藥，用于治療H1N1流感病毒感染。