本發(fā)明涉及一種人源抗VEGFR2抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤血管為腫瘤發(fā)生、發(fā)展提供足夠的氧分和營養(yǎng)，靶向腫瘤血管新生可以達(dá)到餓死腫瘤的治療效果，但是腫瘤血管新生的分子調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，需要許多生長因子、受體及信號通路的介導(dǎo)。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)是血管新生的必要細(xì)胞因子，而VEGFR2是VEGF的三個受體之一，主要負(fù)責(zé)血管新生的信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。針對VEGF的抑制劑貝伐單抗(Bevacizumab)是由基因泰克公司開發(fā)的一種針對VEGF的重組人源化單克隆抗體，由93％人源和7％的鼠源部分組成。2004年2月26日獲得FDA的批準(zhǔn)在美國上市是美國第一個獲得批準(zhǔn)上市的抑制腫瘤血管生成的藥物。貝伐單抗2004年全球銷售額為5.56億美元，2013達(dá)到為70.37億美元。針對VEGFR2的抑制劑雷莫盧單抗(ramucirumab)，是禮來公司收購ImClone公司的IMC-1121B項目后，開發(fā)并成功上市。雷莫盧單抗是針對VEGFR2的全人IgG1單克隆抗體，特異性結(jié)合KDR/VEGFR2。該藥物于2014年5月在美國上市，應(yīng)用于晚期或轉(zhuǎn)移性胃癌或胃食管結(jié)合部腺癌。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種人源抗VEGFR2抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的人源抗VEGFR2抗體，為一種IgG，其重鏈由重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)組成，其輕鏈由輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)組成；所述重鏈可變區(qū)中的CDR1、CDR2和CDR3依次為序列表的序列1自N末端第45-54位氨基酸殘基、第69-85位氨基酸殘基和第118-124位氨基酸殘基；所述輕鏈可變區(qū)中的CDR1、CDR2和CDR3依次為序列表的序列3自N末端第44-54位氨基酸殘基、第70-76位氨基酸殘基和第109-117位氨基酸殘基。所述重鏈具體可為序列表的序列1所示的多肽。所述輕鏈具體可為序列表的序列3所示的多肽。編碼所述IgG的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。編碼所述重鏈的基因為如下(1)或(2)：(1)序列表的序列2自5’末端第10-1398位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表的序列2所示的DNA分子；編碼所述輕鏈的基因為如下(3)或(4)：(3)序列表的序列4自5’末端第25-726位核苷酸所示的DNA分子；(4)序列表的序列4所示的DNA分子。本發(fā)明還保護(hù)所述IgG在制備抑制血管細(xì)胞生長和/或增殖和/或遷移和/或微管形成的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述血管細(xì)胞為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。所述人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具體為HUVEC細(xì)胞。本發(fā)明還保護(hù)所述IgG在制備抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)所述IgG在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長和/或增殖的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述腫瘤細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞。所述人肝癌細(xì)胞具體為HepG-2細(xì)胞。本發(fā)明還保護(hù)所述IgG在制備抑制腫瘤生長的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述腫瘤生長體現(xiàn)為腫瘤的體積變大和/或腫瘤的質(zhì)量增加。所述腫瘤具體可為肝癌。所述腫瘤具體可為人肝癌細(xì)胞引起的腫瘤或皮下移植瘤。所述人肝癌細(xì)胞具體為HepG-2細(xì)胞。本發(fā)明提供了對VEGFR2的全人單克隆抗體，能夠阻斷VEGFR2與其配體VEGF結(jié)合，抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。本發(fā)明對于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移引起的疾病以及腫瘤的治療具有重大的應(yīng)用價值。附圖說明圖1為重組質(zhì)粒pCMV-H+L的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為FORTBIO試驗結(jié)果。圖3為抗體能有效抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖的試驗結(jié)果。圖4為抗體能有效抑制HUVEC細(xì)胞增殖的試驗結(jié)果。圖5為抗體有效抑制HUVEC細(xì)胞遷移的試驗結(jié)果。圖6為抗體有效抑制HUVEC細(xì)胞微管形成的試驗結(jié)果。圖7為分組處理過程中受試動物的體重變化。圖8為分組處理結(jié)束后，受試動物的瘤重分布圖(每個點(diǎn)單表一個受試動物)。圖9為分組處理結(jié)束后，受試動物的腫瘤體積。圖10為分組處理結(jié)束后，受試動物的瘤體積抑制率。圖11為熒光面積改善率結(jié)果。圖12為眼底視網(wǎng)膜增厚改善率結(jié)果。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。CHO細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)：ATCC編號為CRL-9096。HUVEC細(xì)胞(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)：sciencell公司，產(chǎn)品目錄號為8000。HepG-2細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞株)：ATCC編號為A019。實施例1、VEGFR2特異抗體的發(fā)現(xiàn)一、人源單克隆抗體文庫建立從30名知情同意的志愿者獲得外周血，分離淋巴細(xì)胞并提取總RNA。將總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板，用兼并引物PCR擴(kuò)增抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)(VH和VL)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收VH的DNA和VL的DNA，用重疊PCR連接成單鏈抗體(scFv)基因。將來自不同的志愿者的單鏈抗體基因等量混合，分組用內(nèi)切酶切割，然后進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收DNA片段并連接到已經(jīng)用相同內(nèi)切酶切割的噬菌粒載體質(zhì)粒，將連接后的噬菌粒載體質(zhì)粒用電鉆孔轉(zhuǎn)染大腸桿菌，獲得噬菌體單鏈抗體庫。二、VEGFR2人源單克隆抗體篩選首先將重組人VEGFR2蛋白質(zhì)包被在10厘米板上，加入單鏈抗體噬菌體并孵育，洗去未結(jié)合的噬菌體，回收結(jié)合的噬菌體并感染大腸桿菌，以便擴(kuò)增噬菌體。將第一輪獲得并擴(kuò)增的噬菌體再加入到包被有VEGFR2蛋白質(zhì)的10厘米板，進(jìn)行第二輪篩選，如此重復(fù)，共進(jìn)行三輪篩選富集。通過ELISA檢測富集的噬菌體對VEGFR2蛋白質(zhì)的親和力。在三輪篩選的基礎(chǔ)上，通過PCR擴(kuò)增陽性噬菌體內(nèi)的抗體序列，獲得若干抗VEGFR2蛋白質(zhì)的單鏈抗體。將各個單鏈抗體的VH的DNA和VL的DNA分別克隆到人IgG1重鏈和輕鏈的恒定區(qū)氨基端，然后連接到哺乳動物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，獲得若干抗VEGFR2全長抗體。通過ELISA比較各抗體對VEGFR2蛋白質(zhì)的結(jié)合能力，其中一個抗體表現(xiàn)出對VEGFR2蛋白質(zhì)的高度親和力，將該抗體命名為VEGFR2特異抗體。VEGFR2特異抗體的重鏈如序列表的序列1所示，重鏈可變區(qū)含有三個CDR區(qū)域(CDR1、CDR2和CDR3依次為序列表的序列1自N末端第45-54位氨基酸殘基、第69-85位氨基酸殘基和第118-124位氨基酸殘基)。VEGFR2特異抗體的重鏈的編碼序列如序列表的序列2所示。VEGFR2特異抗體的輕鏈如序列表的序列3所示，輕鏈可變區(qū)含有三個CDR區(qū)域(CDR1、CDR2和CDR3依次為序列表的序列3自N末端第44-54位氨基酸殘基、第70-76位氨基酸殘基和第109-117位氨基酸殘基)。VEGFR2特異抗體的輕鏈的編碼序列如序列表的序列4所示。實施例2、重組細(xì)胞的獲得一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建1、合成編碼VEGFR2特異抗體的重鏈的DNA分子(序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子)并將其作為模板，采用H-F和H-R組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。H-F：GGCAAAGAATTCGCCGCCACCATGGAACTGGGGCTCCGCTG；H-R：GAGCTCGAATTCCTATTTACCCGGAGACAGGGAG。2、用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切步驟1得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。3、用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切pCMV-Myc質(zhì)粒，回收載體骨架。4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pCMV-H。5、合成編碼VEGFR2特異抗體的輕鏈的DNA分子(序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子)并將其作為模板，采用L-F和L-R組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。L-F：GCAAAGAATTCGGCTTAATTGCCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCTGCTCAG；L-R：GCTCGAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG。6、用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切步驟5得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。7、用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切pShuttle-CMV質(zhì)粒，回收載體骨架。8、將步驟6的酶切產(chǎn)物和步驟7的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pShuttle-L。9、用限制性內(nèi)切酶SpeI酶切重組質(zhì)粒pCMV-H，回收約7100bp的大片段。10、用限制性內(nèi)切酶SpeI酶切重組質(zhì)粒pShuttle-L，回收約2600bp的小片段。12、將步驟9的大片段與步驟10的小片段連接，得到重組質(zhì)粒pCMV-H+L。重組質(zhì)粒pCMV-H+L的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。二、重組細(xì)胞的獲得將重組質(zhì)粒pCMV-H+L轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，得到重組細(xì)胞。實施例3、VEGFR2特異抗體的大規(guī)模制備和純化CD07V4培養(yǎng)基：上海奧普邁公司產(chǎn)品。PFF06補(bǔ)料培養(yǎng)基：上海奧普邁公司產(chǎn)品。MTX的全稱為氨甲喋呤。1、取實施例2得到的重組細(xì)胞，接種至含400nMMTX的CD07V4培養(yǎng)基，37℃、振蕩培養(yǎng)至細(xì)胞密度為(2-4)×106個細(xì)胞/ml。2、利用荷蘭Applikon公司20升工作體積反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞以生產(chǎn)蛋白。將2500ml完成步驟1的培養(yǎng)體系接種至10升CD07V4培養(yǎng)基,36.5±0.5℃培養(yǎng)15天(培養(yǎng)過程中，控制pH為7.0±0.05；培養(yǎng)過程中，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速范圍60-90rpm，通氣量 0.02-0.05vvm，溶氧設(shè)點(diǎn)40％；細(xì)胞密度達(dá)到5×106個細(xì)胞/ml開始補(bǔ)料，每48小時加入體積為培養(yǎng)體系的5％的PFF06補(bǔ)料培養(yǎng)基)。3、完成步驟2后，取培養(yǎng)上清，依次采用一級膜包(MILLIPORE:D0HC，)和二級膜包(MILLIPORE:A1HC,)進(jìn)行澄清過濾，收集濾液。4、取步驟3得到的濾液，進(jìn)行親和層析。使用GEAxiChrom300層析柱和GE公司生產(chǎn)的MabselectSURE親和填料，層析柱內(nèi)徑為300毫米，裝柱高度為150毫米。將步驟3得到的濾液上樣后，先用20升平衡緩沖液(含150mMNaCl的pH7.4、20mM的PB緩沖液)平衡柱子，然后用40L淋洗液1(含20mM檸檬酸鈉和1MNaCl的水溶液,pH5.0)過柱，然后用40L淋洗液2(含20mM檸檬酸鈉的水溶液，pH5.0)過柱，然后用30升淋洗液3(含20mM檸檬酸鈉的水溶液，pH3.5)過柱。收集采用淋洗液3過柱時吸收值OD280nm為50mAU以上的過柱后溶液。5、取步驟4得到的過柱后溶液，調(diào)pH至3.7并室溫放置，完成病毒滅活。6、取步驟5得到的溶液，調(diào)pH至7.0，進(jìn)行離子交換層析。使用GEAxiChrom200層析柱和GE公司生產(chǎn)的QFF填充介質(zhì)，層析柱內(nèi)徑為200毫米，裝柱高度為300毫米。上樣后，用平衡溶液(0.02MTris水溶液,pH7.0)過柱。從上樣開始收集吸收值OD280nm為100mAU以上的過柱后溶液。7、取步驟6得到的過柱后溶液，用注射用水調(diào)電導(dǎo)率為4mS/cm以下。8、取步驟7得到的溶液，進(jìn)行POROSXS離子交換層析(目的是去除HCP、宿主殘留DNA、脫落proteinA、內(nèi)毒素和聚合體)。使用GEAxiChrom200層析柱，填充物為POROSXS，層析柱內(nèi)徑為200毫米，裝柱高度為200毫米。將步驟7得到的溶液上樣后，先用15升平衡液(20mM檸檬酸鈉水溶液，pH5.0)平衡柱子，然后用20升洗脫液(含20mM檸檬酸鈉和0.16MNaCl的水溶液,pH5.0)過柱。從用洗脫液洗脫開始收集吸收值OD280nm為100mAU以上的過柱后溶液。9、取步驟8得到的過柱后溶液，使用Millipore公司生產(chǎn)的病毒預(yù)濾器和去病毒濾器，在30psi的壓力條件下完成去病毒過濾，收集過濾液。10、取步驟9得到的過濾液，使Millipore公司生產(chǎn)的截留分子量30KD超濾膜包進(jìn)行濃縮，得到VEGFR2特異抗體溶液(蛋白濃度不低于50mg/ml)。VEGFR2特異抗體進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，呈2條帶，分子量約為55KD和22KD，與重鏈和輕鏈的分子量相吻合。長期保存于-80℃?；厥罩劓満洼p鏈對應(yīng)的蛋白條帶并進(jìn)行N端15個氨基酸殘基的測序，分別與序列1所示氨基酸序列的第1至15為和序列3所示氨基酸序列的第1至15位一致。按照專利“抗VEGF受體單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用”(申請?zhí)枮?00710171762.8；授權(quán)公告號為CN101245106)中的方法制備其權(quán)利要求1保護(hù)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2的單克隆抗體(簡稱對照抗體)，作為本發(fā)明中的VEGFR2特異抗體的對照。實施例4、抗體與VEGFR2蛋白質(zhì)的結(jié)合能力通過FORTBIO試驗檢測待測抗體與VEGFR2蛋白質(zhì)的結(jié)合能力。待測抗體為實施例3制備的VEGFR2特異抗體或?qū)φ湛贵w。鼠源VEGFR2蛋白質(zhì)和人源VEGFR2蛋白質(zhì)均購自蘇州同博生物技術(shù)有限公司，貨號分別為mSKDR和hSKDR。FORTBIO試驗結(jié)果見圖2。實施例5、抗體對HUVEC細(xì)胞的作用效果本實施例中的特異抗體，如無特殊說明均為實施例3制備的VEGFR2特異抗體。一、特異抗體能有效抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖(MTT法)HUVEC細(xì)胞表面具有VEGF受體，能夠在VEGF的誘導(dǎo)下增殖。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)：R&D公司，貨號293-VE。1、將HUVEC細(xì)胞按照5000-8000個細(xì)胞/孔的濃度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)8-10小時，棄除培養(yǎng)上清。2、完成步驟1后，取所述96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入無血清DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)4-6小時，棄除培養(yǎng)上清。3、完成步驟2后，加入含5ng/mlVEGF、2％(體積比)胎牛血清和0.015-32μg/ml特異抗體(以蛋白濃度計)的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5％二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)96小時。設(shè)置不加入VEGF且不加入特異抗體的對照甲。設(shè)置加入VEGF但不加入特異抗體的對照乙。4、完成步驟3后，采用四甲基偶氮唑比色法顯色。結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示2μg/ml特異抗體能夠30％抑制VEGF對HUVEC細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。二、抗體能有效抑制HUVEC細(xì)胞增殖(集落法)軟瓊脂集落生成試驗?zāi)軌驒z是體內(nèi)成瘤實驗的體外模型，對是否具有體內(nèi)成瘤性具有重要的提示。將HUVEC細(xì)胞與含0.7％(體積比)軟瓊脂、20％(體積比)小牛血清和待測抗體的DMEM培養(yǎng)基等體積混合，待測抗體在混合體系中的濃度為5-20μg/ml(以蛋白濃度計)。將混合體系加入到直徑為6cm的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)7天， 然后在倒置顯微鏡下觀察，拍照并計數(shù)集落數(shù)。設(shè)置不加入待測抗體的對照。待測抗體為特異抗體或?qū)嵤├?制備的對照抗體。結(jié)果見圖4(1：特異抗體濃度為5μg/ml；2：特異抗體濃度為20μg/ml；3：對照抗體濃度為5μg/ml；4：對照抗體濃度為20μg/ml)。與對照相比，特異抗體在5μg/ml時即能夠有效抑制HUVEC細(xì)胞的集落生成(5μg/ml時特異抗體對HUVEC細(xì)胞的抑制率為50％)，5μg/ml時對照抗體對HUVEC細(xì)胞的抑制率為20％。三、抗體有效抑制HUVEC細(xì)胞遷移(劃痕法)細(xì)胞遷移是血管新生的必要條件，利用劃痕試驗可以觀察細(xì)胞平面運(yùn)動能力。將5×105個HUVEC細(xì)胞/孔接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，形成單層細(xì)胞后，用無菌牙簽在細(xì)胞單層上劃“一”，然后以無血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞3次，加入含5μg/ml特異抗體和10％(體積比)小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后觀察。設(shè)置不加入特異抗體的對照。結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，5μg/ml時特異抗體能夠有效抑制HUVEC遷移。四、抗體有效抑制HUVEC細(xì)胞微管形成(MatriGEL法)微管形成試驗?zāi)苣M人體內(nèi)毛細(xì)血管生成的過程，包括內(nèi)皮細(xì)胞出牙增殖和毛細(xì)血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成等步驟，接近人體內(nèi)血管生成的實際過程。內(nèi)皮細(xì)胞在基質(zhì)膠培養(yǎng)基上培養(yǎng)時能夠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。將8×104個HUVEC細(xì)胞/孔接種到六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，吸棄上清后加入含10μg/ml特異抗體的基質(zhì)膠培養(yǎng)基(Matricgel)，培養(yǎng)72小時后觀察。設(shè)置不加入特異抗體的對照。結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，10μg/ml時特異抗體能夠有效抑制HUVEC形成微管結(jié)構(gòu)。實施例6、抗體對HepG-2細(xì)胞皮下移植瘤的生長抑制作用受試動物為成年BALB/C-nu/nu小鼠，18.0～22.0g，雌性，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK-(軍)2012-0001。1、用生理鹽水重懸HepG-2細(xì)胞，得到5×107個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液；取受試動物，右前肢腋部皮下接種0.2ml細(xì)胞懸液，受試動物皮下腫瘤生長至直徑約2-3cm時，無菌條件下取出瘤塊，切成約1.5mm×1.5mm大小的瘤塊。2、取新的受試動物，每只小鼠右前肢腋部皮下接種1個步驟1得到的瘤塊，分組處理如下(每組8只小鼠)：第一組：連續(xù)給藥四周，每周通過尾靜脈注射給予2次實施例3制備的VEGFR2特異抗體，單次給藥劑量為40mg藥物/kg體重；第二組：連續(xù)給藥四周，每周通過尾靜脈注射給予2次實施例3制備的VEGFR2 特異抗體，單次給藥劑量為20mg藥物/kg體重；第三組：連續(xù)給藥四周，每周通過尾靜脈注射給予2次實施例3制備的VEGFR2特異抗體，單次給藥劑量為10mg藥物/kg體重；第四組：連續(xù)給藥四周，每周通過尾靜脈注射給予2次實施例3制備的VEGFR2特異抗體，單次給藥劑量為5mg藥物/kg體重；第五組(對照組)：連續(xù)給藥四周，每周通過尾靜脈注射給予2次生理鹽水。分組給藥結(jié)束后，頸部脫臼處死動物，剝離瘤塊用于拍照，稱重。瘤重抑制率＝(對照組瘤重-給藥組瘤重)/對照組瘤重×100％。腫瘤體積＝1/2ab2(a＝腫瘤長徑，b＝腫瘤短徑)；瘤體積抑制率＝(對照組腫瘤體積－給藥組腫瘤體積)/對照腫瘤組體積×100％。試驗數(shù)據(jù)用表示。用EXCEL軟件中t-檢驗程序進(jìn)行組間統(tǒng)計學(xué)分析。分組處理開始天數(shù)，分組處理過程中受試動物的體重變化見圖7。分組處理結(jié)束后，受試動物的瘤重分布圖見圖8(每個點(diǎn)單表一個受試動物)。分組處理結(jié)束后，受試動物的腫瘤體積見圖9，瘤體積抑制率見圖10。結(jié)果見表1。表1VEGFR2特異抗體對HepG-2細(xì)胞皮下移植瘤的生長抑制作用(開始指的是分組處理開始，結(jié)束指的是分組處理結(jié)束，瘤重和腫瘤體積指的是分組處理結(jié)束后的瘤重和腫瘤體積)注：與對照組比較，“*”P<0.05，“**”P<0.01，“***”P<0.001。實施例7、抗體抑制激光致恒河猴脈絡(luò)膜新生血管恒河猴，全雄性，2-4歲，體重3.90-4.90kg，成都格林豪斯生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2011-013。一、制作動物模型采用532nm激光圍繞恒河猴眼底黃斑中心凹光凝，誘導(dǎo)眼底脈絡(luò)膜血管新生，建 立與人類脈絡(luò)膜新生血管類似的動物模型。光凝前及光凝后20-21天進(jìn)行眼底彩色照相、熒光素眼底血管造影、光學(xué)相干斷層掃描(OCT)，判定造模情況。光凝21天后，猴眼底黃斑周圍激光斑呈高熒光，顯著熒光素滲漏，滲漏基本均超過光斑邊緣，提示造模成功。二、分組給藥取造模成功的恒河猴，分組處理如下：第一組(對照組，2只)：單眼注射，經(jīng)玻璃體單次注射50μL0.9％氯化鈉注射液；第二組(3只)：單眼注射，經(jīng)玻璃體單次注射50μL實施例3制備的VEGFR2特異抗體(含0.05mgVEGFR2特異抗體，以蛋白量計)；第三組(3只)：單眼注射，經(jīng)玻璃體單次注射50μL實施例3制備的VEGFR2特異抗體(含0.2mgVEGFR2特異抗體，以蛋白量計)；第四組(2只)：單眼注射，經(jīng)玻璃體單次注射50μL實施例3制備的VEGFR2特異抗體(含0.5mgVEGFR2特異抗體，以蛋白量計)。分別于給藥后7天、21天進(jìn)行眼底彩色照相、熒光素眼底血管造影、光學(xué)相干斷層掃描等檢查觀察供試品對脈絡(luò)膜新生血管的抑制情況，并解剖動物取眼球進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。熒光素眼底血管造影的結(jié)果見表2。熒光面積改善率結(jié)果見圖11。對照組恒河猴在給予0.9％氯化鈉注射液7天及21天后：熒光素滲漏程度未見減輕，熒光斑面積未見縮小，熒光滲透面積改善率分別為-6.27％、22.66％；OCT檢查未見光凝處視網(wǎng)膜損傷及厚度有明顯好轉(zhuǎn)，病損最高處視網(wǎng)膜厚度改善率分別為10.15％、21.29％。恒河猴在給予VEGFR2特異抗體7天后，熒光素滲漏情況均較給藥前有非常明顯好轉(zhuǎn)，熒光斑面積也明顯縮小，第二組、第三組和第四組的熒光滲透面積改善率改善率依次為34.00％、34.16％、49.81％。恒河猴在給予VEGFR2特異抗體21天后，第二組、第三組和第四組的熒光滲透面積改善率依次為44.30％、51.27％、71.85％，OCT檢查可見病損處視網(wǎng)膜厚度有明顯降低，色素上皮較規(guī)整、連續(xù)。光學(xué)相干斷層掃描(OCT)檢查的結(jié)果見表3。眼底視網(wǎng)膜增厚改善率結(jié)果見圖12。恒河猴在給予VEGFR2特異抗體7天后，第二組、第三組和第四組的眼底視網(wǎng)膜增厚改善率依次為36.58％、39.36％、66.62％。恒河猴在給予VEGFR2特異抗體21天后，第二組、第三組和第四組的眼底視網(wǎng)膜增厚改善率依次為45.23％、61.59％、89.58％。第二組、第三組和第四組的效果均明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，VEGFR2特異抗體對激光致脈絡(luò)膜新生血管均有較明顯的抑制作用。表2熒光素眼底血管造影的結(jié)果，熒光素滲漏面積改善率第一組第二組第三組第四組給藥后7天-6.27±6.4834.00±2.69*34.16±5.05*49.81±7.65*給藥后21天22.66±2.7244.30±4.32*51.27±2.75*71.85±9.44*表3光學(xué)相干斷層掃描檢查的結(jié)果，眼底視網(wǎng)膜增厚改善率第一組第二組第三組第四組給藥后7天10.15±6.1736.58±9.10*39.36±14.06*66.62±16.88*給藥后21天21.29±2.0745.23±5.32*61.59±10.51*89.58±19.23*實施例8、抗體在靈長類動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究本實施例的生物樣品分析部分依照軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所藥物代謝與藥物動力學(xué)實驗室的研究方案、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所藥物代謝與藥物動力學(xué)實驗室生物分析部現(xiàn)行SOPs執(zhí)行，依從GLP管理。本實施例研究恒河猴單次或多次靜脈滴注不同劑量抗體的血藥濃度-時間變化以及藥代動力學(xué)，為臨床試驗方案的制定提供理論與實驗依據(jù)。將恒河猴24只(雌雄各半)，分為4組，每組6只(3♀、3♂)：皮下給藥低劑量組：單次給藥，5mg實施例3制備的VEGFR2特異抗體/kg體重；皮下給藥中劑量組：單次給藥，20mg實施例3制備的VEGFR2特異抗體/kg體重；皮下給藥高劑量組：單次給藥，80mg實施例3制備的VEGFR2特異抗體/kg體重；多次給藥組：每兩周靜脈滴注1次，連續(xù)給藥4次，單次劑量為20mg實施例3制備的VEGFR2特異抗體/kg體重。自前肢靜脈取全血約0.8mL，1200×g離心10分鐘，分離血清至干凈小管內(nèi)，得到各組各時間點(diǎn)的血清樣品。恒河猴血清樣品中VEGFR2特異抗體的濃度采用經(jīng)方法學(xué)確證的酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)進(jìn)行定量檢測。最低定量限(LLOQ)為：31.25ng/mL。(一)單次給藥組的藥代動力學(xué)檢測恒河猴單次給藥低、中、高三組的達(dá)峰時間(Tmax)依次為0.6±0.2hr，0.6±0.2hr和2.3(0.5-24)hr，各組達(dá)峰時間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。恒河猴單次給藥低、中、高三組達(dá)峰濃度Cmax依次為129.1±12.0μg/mL，518.1±116.9μg/mL和2010.5±211.7μg/mL。恒河猴單次給藥低、中、高三組的AUC(0-t)(0到t時間點(diǎn)的藥時曲線下面積)依次為9580.2±1672.3hr·μg/mL，54287.9±16040.1hr·μg/mL和281480.8±62539hr·μg/mL。恒河猴單次給藥低、中、高三組的AUC(0-inf)(0至無窮的血藥濃度時間曲線下面積)依次為10185.8±2336.6hr·μg/mL，54407.7±16198.4hr·μg/mL和281670.1±62444.4hr·μg/mL。各劑量組間Cmax和AUC均存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001)。恒河猴單次給藥低、中、高三組給藥劑量比為1:4:16，Cmax之比為1:4.0:15.6， AUC(0-t)之比為1:5.7:29.3。有效T1/2依次為92.4±14.9hr，130.5±20.8hr和159.7±39.4hr，末端相T1/2依次為59.3±23.3hr，66.3±36.3hr和100±36.8hr，T1/2隨劑量增加有所延長；系統(tǒng)清除率Cl依次為0.5±0.1mL/hr/kg，0.4±0.2mL/hr/kg和0.3±0.1mL/hr/kg，隨劑量增加略有下降；表觀分布容積Vd依次為41.8±12mL/kg，33.6±10.4mL/kg和40.9±14.5mL/kg各組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。恒河猴給藥后血清藥物濃度-時間變化呈典型的“椅”狀曲線，即在一個快速分布相與消除相之后，還存在一個濃度依賴的“sink相”，與體內(nèi)游離抗原直接相關(guān)，符合抗體消除的一般規(guī)律。(二)多次給藥組的藥代動力學(xué)檢測多次給藥組首次給藥后的血清中VEGFR2特異抗體濃度峰值(Cmax)為583.2±73.3μg/mL，末次給藥后Cmax為513±240.3μg/mL；首次給藥后的AUC(0-t)和AUC(0-inf)分別為49018.4±5745.5hr·μg/mL和61269.5±18323.5hr·μg/mL，而末次給藥后的AUC(0-t)和AUC(0-inf)分別為65997.8±48453.3hr·μg/mL和67099.8±48071.3hr·μg/mL。首次給藥后消除相T1/2為112.7±47.3hr，末次給藥后，消除相半衰期T1/2為87.7±56.2hr。與首次給藥比較，第4次給藥后的蓄積率(AR)為1.3±0.9。恒河猴連續(xù)多次靜脈滴注VEGFR2特異抗體后，末次藥物暴露略高于首次給藥，蓄積因子為1.3。當(dāng)前第1頁1 2 3