本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一個通過改變已上市的奧法木(Ofatumumab，Arzerra)單抗的糖鏈組成，獲得抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性顯著性增強(qiáng)的抗體。本發(fā)明還涵蓋了該抗體的制備方法及其在治療腫瘤，尤其是CD20高表達(dá)的慢性淋巴瘤，非霍奇金氏淋巴瘤和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

CD20(亦稱為人B淋巴細(xì)胞限制性分化抗原)是前B細(xì)胞核成熟的B淋巴細(xì)胞上的疏水性跨膜蛋白(Valentine et al.,J.Bio.Chem.,1989,V264:11282-7)。研究發(fā)現(xiàn)，超過90％的非霍奇金氏淋巴瘤患者、慢性淋巴瘤患者及大B細(xì)胞淋巴瘤患者B細(xì)胞表面高度表達(dá)CD20分子(Anderson et al.,Blood,1984,V63:1424-33)，但造血干細(xì)胞、原B細(xì)胞、正常漿細(xì)胞及其它組織中并未發(fā)現(xiàn)前述特征(Tedder et al.,Immunology,1985,V135:973-9)?；诖颂卣?，Biogen公司于1997年上市了特異性針對CD20的人鼠嵌合型抗體Rituxan(Rituximab)，用于治療慢性淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤等，并在臨床上成為治療的金標(biāo)準(zhǔn)。Genmab公司隨后在2009年上市了針對CD20大小環(huán)區(qū)域的全人抗體-奧法木單抗(ofatumumab)，該抗體的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)遠(yuǎn)高于Rituxan，已被FDA批準(zhǔn)用于慢性B細(xì)胞淋巴瘤的一線治療，目前該品種正在進(jìn)行非霍奇金氏淋巴瘤一線治療的臨床研究。

目前抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)增強(qiáng)的第三代抗CD20單抗Gavyza(obinutuzumab)已在與Rituxan頭對頭的臨床試驗中顯示出壓倒性的臨床優(yōu)勢，證實了ADCC活性在以CD20為靶點的抗體治療中占據(jù)非常核心的地位。Herter等對奧法木單抗(ofatumumab)與Rituxan開展的頭對頭對比研究表明，奧法木單抗在體外和動物體內(nèi)的各項活性指標(biāo)均不遜于Rituxan，且其補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)遠(yuǎn)高于Rituxan(Herter et al.,Mol.Cancer.Ther.2013；12:2031-42)。因此，進(jìn)一步改善奧法木單抗的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，將賦予其更重要的臨床意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于ADCC活性在CD20抗體臨床治療中的突出作用，及奧法木單抗在ADCC活性的提升空間及可能性，本發(fā)明通過改變奧法木(ofatumumab)單抗的糖鏈組成提升其生物學(xué)活性，獲得一個具有更高生物學(xué)活性的新抗體。其抗腫瘤活性的提升在本發(fā)明中已通過細(xì)胞水平的體外試驗及動物水平的體內(nèi)藥效試驗證實。

同時，優(yōu)選CHO表達(dá)系統(tǒng)替代NS0表達(dá)系統(tǒng)，從而降低或消除NS0系統(tǒng)表達(dá)奧法木單抗時含有的Di-α1,3GalGal糖修飾的組分，使本發(fā)明單抗具有更低的免疫原性；

本發(fā)明的另一個目的是提供上述單抗的制備方法及其在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過下列技術(shù)措施實現(xiàn)的：

一個通過改變奧法木(ofatumumab)單抗的糖鏈組成提升其生物學(xué)活性的抗體及其制備方法。

根據(jù)所述抗體，其特征在于：其一級氨基酸序列與奧法木(ofatumumab)單抗一級氨基酸序列一致，但其在表達(dá)過程中修飾抗體的糖鏈與修飾奧法木單抗糖鏈不同，使其生物學(xué)活性較奧法木抗體顯著增強(qiáng)。

根據(jù)所述抗體，其特征在于：通過降低修飾抗體的糖鏈中巖藻糖含量，增強(qiáng)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。

根據(jù)所述抗體，其特征在于：由碳水化合物所組成的修飾抗體的糖鏈中，具巖藻糖的糖鏈占修飾抗體的總糖鏈的質(zhì)量百分比不高于20％。

根據(jù)所述抗體，其特征進(jìn)一步在于：由碳水化合物所組成的修飾抗體的糖鏈中，具巖藻糖的糖鏈占修飾抗體的總糖鏈的質(zhì)量百分比不高于5％。

根據(jù)所述抗體，其特征進(jìn)一步在于：由碳水化合物所組成的修飾抗體的糖鏈中，不含巖藻糖。

根據(jù)所述抗體，其特征在于由真核宿主細(xì)胞在添加了L-巖藻糖類似物的培養(yǎng)基中翻譯表達(dá)。

根據(jù)所述巖藻糖類似物，優(yōu)選5-炔基-L-巖藻糖、2-脫氧-2-氟-L-巖藻糖以及他們相應(yīng)的過酰化衍生物。

根據(jù)所述巖藻糖類似物，優(yōu)選2-脫氧-2-氟-L-巖藻糖以及相應(yīng)的過酰化衍生物。

根據(jù)所述巖藻糖類似物，優(yōu)選2F-Peracetyl-Fucose。

根據(jù)所述宿主細(xì)胞，優(yōu)選NS0細(xì)胞系、SP2/0細(xì)胞系及CHO細(xì)胞系。

根據(jù)所述宿主細(xì)胞，優(yōu)選CHO細(xì)胞系。

一種組合物，所述組合物包含上述抗體。

所述的抗體及其制備方法在制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。

所述的抗腫瘤藥物及其應(yīng)用，優(yōu)選慢性淋巴瘤，非霍奇金氏淋巴瘤和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤。

以下主要提供本發(fā)明的主要步驟：

通過降低或去除巖藻糖提升目的單抗ADCC活性的主要技術(shù)是集中在細(xì)胞基因水平層面上進(jìn)行改造，如Biowa公司的POTELLIGENT(R)技術(shù)和羅氏的GlycoMAb技術(shù)。本發(fā)明突破性的通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝途徑而實現(xiàn)了降低或去除目的單抗中巖藻糖含量，如培養(yǎng)過程中添加巖藻糖類似物，通過工藝控制對修飾抗體的糖鏈組成進(jìn)行調(diào)節(jié)，達(dá)到了顯著性提升單抗ADCC活性的目的。

抗體在哺乳動物細(xì)胞中需要以GDP-fucose為底物，通過巖藻糖轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行α-1,6fucose修飾，細(xì)胞內(nèi)GDP-fucose可以通過利用葡萄糖從頭(合成)途徑或者利用游離的巖藻糖從補(bǔ)救途徑生成。胞內(nèi)的GDP-fucose水平會對從頭(合成)途徑的酶(如GMD)產(chǎn)生反饋抑制，或者抑制巖藻糖轉(zhuǎn)移酶的活性，從而影響核心巖藻糖修飾。通過在培養(yǎng)過程中添加巖藻糖類似物，如2F-Peracetyl-Fucose(簡稱2F)，形成GDP-2F-fucose，抑制正常的GDP-fucose的合成，并且抑制巖藻糖轉(zhuǎn)移酶活性，從而獲得低巖藻糖含量的糖鏈抗體，該抗體較奧法木單抗具有更高的ADCC活性。同時，該法較通過基因工程化改造細(xì)胞(如格黎卡特生物技術(shù)股份公司申請專利方法，CN02818173.5)更加便捷，抗體產(chǎn)量也顯著增加。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明主要的優(yōu)點：獲得的抗體保持與奧法木單抗相似的安全性同時，獲得更高的ADCC活性，這種改變在臨床上將有益的降低因患者對抗體發(fā)生治療性抵制的幾率?；诒景l(fā)明所制備的單抗，在臨床的藥效及安全性方面都顯著高于現(xiàn)有的奧法木單抗，具有顯著的先進(jìn)性，也符合我國生物醫(yī)藥開發(fā)方面的引進(jìn)、消化再吸收的開發(fā)理念，降低了藥物開發(fā)的風(fēng)險。

附圖說明

圖12F-Peracetyl-Fucose處理的抗體ADCC提升單抗的MS圖譜。

圖25-Alkynyl-Fucose處理的抗體的MS圖譜

圖3CHO表達(dá)的奧法木單抗MS圖譜。

圖4原研奧法木單抗MS圖譜。

圖5抗體修飾糖鏈的示意圖。

圖6奧法木單抗通過修飾糖鏈ADCC活性改變前后其動物體內(nèi)抑瘤效果比較

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。在此，我們證明了本發(fā)明中制備的抗體與奧法木單抗相比：通過降低抗體中修飾糖鏈的巖藻糖含量，獲得較奧法木單抗具有更高的ADCC活性的抗體，在體內(nèi)出示了更強(qiáng)的抗腫瘤活性。

實施例1用不同巖藻糖類似物制備巖藻糖敲除的抗體

在本發(fā)明中，基于穩(wěn)定表達(dá)奧法木單抗的CHO(DG44)來源的細(xì)胞株ET-4-66(其篩選過程參見于鵬展等，對蒙古人和高加索人種低免疫原性的抗CD20的人抗體，申請?zhí)朇N201410003725.6，其全部內(nèi)容在此文引作參考)，通過調(diào)控巖藻糖在其細(xì)胞中的代謝過程，獲得低巖藻糖含量的糖鏈抗體。

復(fù)蘇：從液氮罐中取存有ET-4-66工作細(xì)胞的凍存管一支(裝量1.5ml)，37℃水浴化凍，立即將種子液轉(zhuǎn)入含有20-30mL CD FortiCHO培養(yǎng)基的125mL搖瓶中。將搖瓶放置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃，8％CO₂，130rpm培養(yǎng)。

接種：取對數(shù)生長期的細(xì)胞按照0.8-1.2×10⁶cells/mL細(xì)胞密度接種于125mL搖瓶中，培養(yǎng)體積30mL，在培養(yǎng)基中分別添加200μM、100μM、50μM的2F-Peracetyl-Fucose和5-Alkynyl-L-fucose，培養(yǎng)至4-5×10⁶cells/mL密度時，按0.8-1.2×10⁶cells/mL重新接種于含上述巖藻糖類似物的新鮮培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)9天，培養(yǎng)上清經(jīng)親和層析純化得到藻糖敲除的抗體，與奧法木單抗進(jìn)行糖及活性的比較研究。

實施例2高ADCC活性抗體制備

復(fù)蘇：從液氮罐中取存有ET-4-66工作細(xì)胞的凍存管一支(裝量1.5ml)，37℃水浴化凍，立即將種子液轉(zhuǎn)入含有20-30mL FortiCHO(添加MTX500nM)培養(yǎng)基的125mL搖瓶中。將搖瓶放置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃，8％CO₂，130rpm培養(yǎng)2-3天。

搖瓶擴(kuò)種：當(dāng)細(xì)胞密度增加至1.5-3.5×10⁶cells/mL時，對細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)種。操作時根據(jù)需要，補(bǔ)充適量的新鮮FortiCHO培養(yǎng)基，擴(kuò)種后細(xì)胞的密度在0.4-0.6×10⁶cells/mL。根據(jù)細(xì)胞液體積更換搖瓶，培養(yǎng)體積不超過搖瓶總體積的1/3。。N-1代開始添加50μM的2F-Peracetyl-Fucose培養(yǎng)(N指生產(chǎn)用的細(xì)胞培養(yǎng)代次)，用于反應(yīng)器實驗。

以0.8-1.2×10⁶cells/mL細(xì)胞密度接種，根據(jù)實驗方案中(見表1)設(shè)計的補(bǔ)料策略和培養(yǎng)條件進(jìn)行添加和控制，反應(yīng)器參數(shù)控制如下：

工作體積：起始1.2L培養(yǎng)基

溫度：控制在36.5℃

pH：設(shè)定7.0±0.05，分別用CO₂和0.5M NaHCO₃PID反饋控制

DO：設(shè)定40％(以空氣中氧氣為100％)，用氧氣PID反饋控制

轉(zhuǎn)速：控制80-250rpm，起始轉(zhuǎn)速80rpm，接種后1hr，轉(zhuǎn)速提高至150rpm，第5天轉(zhuǎn)速提高200rpm，若sparger通氣量超過100ml/min，轉(zhuǎn)速可提高至250rpm。

氣體控制：Overlay壓縮空氣40-150ml/min

Sparger CO₂PID反饋控制pH設(shè)定上限300ml/min

O₂ PID反饋控制DO設(shè)定上限300ml/min

每天取樣，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，計算活細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活率，用Nova進(jìn)行生化分析，并移取大于1ml樣品在1000rpm，3min條件下離心，取上清-80℃保存。

當(dāng)細(xì)胞活率低于70％，或者活細(xì)胞數(shù)是峰值的一半時，停止培養(yǎng)收獲細(xì)胞，離心留取上清純化。純化主要步驟包括深層過濾、親和層析、酸孵育滅活、陽離子交換層析、陰離子交換層析、納濾及超濾步驟。純化后的ADCC提升抗體進(jìn)行動物體內(nèi)藥效實驗

實施例3本發(fā)明所述抗體的糖型分析

糖型的解析主要基于ESI-QTOF對抗體重鏈以結(jié)合形式存在的糖鏈進(jìn)行分析，圖1至圖3是基于QSTAR XL(AB Sciex)質(zhì)譜儀分別對巖藻糖敲除的單抗和原研品奧法木單抗的測試糖譜。2F-Peracetyl-Fucose處理的抗體(圖1)、5-Alkynyl-L-fucose處理的抗 體(圖2)、CHO表達(dá)的奧法木單抗(圖3)與原研奧法木單抗(圖4)其MS圖譜具體解析見表2。

從表2的MASS結(jié)果可知，相比于奧法木原研品和未處理抗體，培養(yǎng)過程中通過添加2F-Peracetyl-Fucose和5-Alkynyl-L-fucose完全改變了抗體的修飾糖鏈。在質(zhì)譜圖上表現(xiàn)為各主要信號峰的分子量為在原研品的主要峰型基礎(chǔ)上，都減去了292Da的分子量(2個巖藻糖殘基分子量)。通過確證，確定皆脫掉了2個巖藻糖(由于單抗是2個相同重鏈通過鏈間二硫鍵連結(jié)在一起)，所以培養(yǎng)過程中，添加2F-Peracetyl-Fucose和5-Alkynyl-L-fucose均能有效移除巖藻糖。

實施例4本發(fā)明所述抗體ADCC活性的比較分析

ADCC效應(yīng)測定是基于工程化改造的NK細(xì)胞進(jìn)行，測定抗體對Wil2-s細(xì)胞的殺傷。

Wil2-s靶細(xì)胞準(zhǔn)備：取處于對數(shù)生長期的靶細(xì)胞Wil2-s，1000rpm，離心5分鐘，用RPMI 1640(#11835)洗滌一次，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁵/ml，在96孔圓底板中(除了效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)熒光對照孔和空白背景對照孔外)每孔加入50μl；

用RPMI1640將原研藥或其他待檢測樣品稀釋至1μg/ml，然后做5倍梯度稀釋，稀釋9個點，另外增加一個不含抗體的空白點；96孔板每孔加入50μl與靶細(xì)胞混合，每個濃度做2個復(fù)孔；

96孔板在37℃，5％CO2孵育30分鐘；

NK-92MI/CD16a效應(yīng)細(xì)胞：取對數(shù)生長期的效應(yīng)細(xì)胞NK-92MI/CD16a，1000rpm，離心5分鐘，用RPMI 1640洗滌一次，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁵/ml，在96孔圓底板中(除了靶細(xì)胞自發(fā)熒光對照孔和靶細(xì)胞最大裂解對照孔外)每孔加入100μl；

96孔板在37℃，5％CO2孵育4小時；

用CytoTox-ONE試劑盒檢測熒光信號：

a)96孔板孵育結(jié)束后放置室溫，平衡20～30分鐘；所有檢測試劑均先平衡至室溫；

b)靶細(xì)胞最大裂解孔內(nèi)每孔加入4μl裂解液；

c)96孔板1000rpm，離心5分鐘；

d)取上清100μl，移至96孔黑板(#3904)；

e)每孔加入100μl反應(yīng)底物，室溫放置10分鐘；

f)每孔加入50μl反應(yīng)終止液，混合均勻。

在酶標(biāo)儀SpectraMax M5記錄Fluorescence Ex560nm/Em590nm信號。

數(shù)據(jù)處理：

a)所有值應(yīng)先減去空白對照組值；按下面公式計算殺傷率ADCC％＝[(實驗組-靶細(xì)胞自發(fā)釋放組-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組)/(靶細(xì)胞最大釋放組-靶細(xì)胞自發(fā)釋放組)]×100％

b)X軸數(shù)據(jù)為log轉(zhuǎn)換的原研藥的質(zhì)量濃度(ng/ml)，Y軸數(shù)據(jù)為ADCC％。

c)用GraphPad Prism 5作非線性回歸，使用4參數(shù)公式f(x)＝B+(A-B)/(1+10^((C-x)*D))擬合獲得測試樣品殺死Wil2-s細(xì)胞的回歸曲線。計算EC50，R2等。

從表3可以看出，通過添加巖藻糖替代物2F-Peracetyl-Fucose和5-Alkynyl-L-fucose，改變細(xì)胞株的代謝流，從而制備出高ADCC活性的抗體，該抗體的ADCC活性(EC₅₀為0.1718～0.3372ng/mL)與羅氏新批準(zhǔn)的ADCC提升的Gazyva單抗相似(EC₅₀為0.3836ng/mL)，遠(yuǎn)高于原研奧法木單抗和CHO表達(dá)得奧法木單抗的ADCC活性(EC₅₀分別為2.718ng/mL和3.097ng/mL)。從而支持了本專利中所述：通過添加巖藻糖類似物調(diào)控細(xì)胞的代謝，從而獲得低巖藻糖含量的抗體。

實施例5本發(fā)明所述抗體體內(nèi)活性的評價

BALB/cA-nude裸小鼠，6-7周，♀，裸小鼠皮下接種人B細(xì)胞淋巴瘤Daudi細(xì)胞，待腫瘤生長至100-150mm³后，將動物隨機(jī)分組(D0)。給藥劑量和給藥方案見表4。每周測2－3次瘤體積，稱鼠重，記錄數(shù)據(jù)。腫瘤體積(V)計算公式為：

V＝1/2×a×b²其中a、b分別表示長、寬。

T/C(％)＝(T-T₀)/(C-C₀)×100％其中T、C為實驗結(jié)束時的腫瘤體積；T₀、C₀為實驗開始時的腫瘤體積。

給藥方案及實驗結(jié)果見表4及圖6。奧法木單抗、ADCC提升單抗(3mg/kg,IV,每周2次，共4次)明顯抑制CD20陽性B細(xì)胞淋巴瘤Daudi裸小鼠皮下移植瘤的生長，抑瘤率分別為84％和95％,奧法木單抗組有2/6腫瘤部分消退；ADCC提升抗體組有2/6腫瘤部分消退和1/6腫瘤完全消退；對照藥物Gazyva相同劑量和方案對Daudi的抑瘤率為89％，有1/6腫瘤部分消退和1/6腫瘤完全消退；另一個參比藥物美羅華(30mg/kg,IV,每周2次，共4次)對Daudi的抑瘤率為109％,有1/6腫瘤部分消退和2/6腫瘤完全 消退。荷瘤小鼠對以上藥物均能很好耐受，沒有體重減輕等癥狀發(fā)生。ADCC提升抗體對Daudi的療效強(qiáng)于奧法木，與Gazyva相似。

表1 2F應(yīng)用于3L反應(yīng)器性能測試實驗設(shè)計

備注：葡萄糖控制＞2.5g/L；

EFC：第3天開始每天按初始工作體積在線補(bǔ)加3％(V/V)，補(bǔ)加總量為33-36％；

Tyr：第7天添加1/500(V/V)，第13天添加1/1000(V/V)；

Cys：第7天添加1/100(V/V)，第13天添加1/200(V/V)；

表2 奧法木單抗與ADCC提升樣品的MS信號峰解析

表3.細(xì)胞水平測定的ADCC結(jié)果

表4.各抗體對人B細(xì)胞淋巴瘤Daudi裸小鼠皮下移植瘤的療效。

注：D0:第一次給藥時間；P值指與溶劑相比；采用Student’s t檢驗。實驗開始時小鼠數(shù)目：溶劑組n＝12，治療組n＝6。