本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種抗人PD-1蛋白抗體及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：哺乳動(dòng)物T細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中扮演著極其重要的角色。T細(xì)胞仰賴抗原呈現(xiàn)細(xì)胞(antigen-presentingcells簡(jiǎn)稱APC)或其他分子，將外來(lái)的或者有害的抗原消化并且重新呈現(xiàn)成T細(xì)胞可以識(shí)別的抗原型態(tài)，T細(xì)胞才得以活化。此過(guò)程受到許多分子精密的調(diào)節(jié)，有的分子會(huì)促進(jìn)T細(xì)胞活化，以確保免疫系統(tǒng)足以對(duì)抗入侵的病原體；有的分子則扮演抑制的功能，防止免疫系統(tǒng)過(guò)度活化。T細(xì)胞上有一群參與調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，被命名為CD28受體家族(ReceptorFamily)，包括：CD28、CTLA-4、PD-1(又稱CD279)、ICOS以及BTLA等分子(Okazakietal.Curr.Opin.Immunol，2002，14：391779-1782；BennettFetal.JImmunol，2003，170：711-718；Hansenetal.Immunogenics，1980，10：247-260；Ishidaetal.EMBOJ，1992，11：3887-3895；Hutloffetal.Nature，1999，397：263-266)。在此家族中，CD28是首先被發(fā)現(xiàn)具有輔助受體功能的蛋白質(zhì)，家族內(nèi)的輔助受體分為兩大類，一類是負(fù)責(zé)傳遞刺激訊號(hào)的活化性受體，另一類是傳遞抑制訊號(hào)的抑制性受體。在抗原呈現(xiàn)細(xì)胞(APC)上，則存在其對(duì)應(yīng)的配體分子，隸屬于B7家族。T細(xì)胞的抑制性受體當(dāng)中，最受矚目的兩個(gè)受體是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(CytotoxicT-LymphocyteAntigen4即CTLA-4)和計(jì)劃性死亡蛋白-1(ProgrammedcellDeathProtein1即PD-1，又稱CD279)。至今所知，在抗原呈現(xiàn)細(xì)胞上，CTLA-4所對(duì)應(yīng)的配體為B7-1和B7-2；而PD-1所對(duì)應(yīng)的配體為PD-L1和PD-L2。人PD-1是個(gè)55kDa的I型跨膜蛋白，其編碼基因?qū)儆诿庖咔虻鞍?Ig)基因超級(jí)家族(superfamily)(Agataetal.IntImmunol，1996，8：765-772)。許多研究結(jié)果顯示，PD-L1或PD-L2與PD-1的結(jié)合可以抑制T細(xì)胞的激活(Freemanetal.JExpMed，2000，192：1027-1034；Latchmanetal.NatImmunol，2001，2：261-268；Carteretal.EurJImmunol，2002，32：634-643)。PD-1主要表達(dá)于免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞，但很少在其他組織(如肌肉、表皮和神經(jīng)細(xì)胞)中表達(dá)。此外，PD-1的高表達(dá)常常與免疫細(xì)胞的激活密切相關(guān)。這些分子如今被稱為“免疫檢查點(diǎn)”受體和配體。然而，精密復(fù)雜的免疫系統(tǒng)也有失靈的時(shí)候，這或許也是很多疾病的基本成因。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)抑制免疫的機(jī)能不正常地減弱，反應(yīng)過(guò)度的免疫系統(tǒng)將可能敵友不分，開(kāi)始攻擊自身細(xì)胞組織，造成自體免疫性疾病。PD-1缺失或突變的小鼠會(huì)產(chǎn)生多種自體免疫性疾病，例如：自身免疫性心肌病、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和腎炎的狼瘡樣綜合征、腦脊髓炎以及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Nishimuraetal.Immunity，1999，11：141-151；Nishimuraetal.Science，2001，291：319-322；Salamaetal.JExpMed，2003，198：71-78；ProkuninaandAlarcon-Riquelme.HumMolGenet，2004，13：R143；Nielsenetal.Lupus，2004，13：510)。在正常情況下，免疫系統(tǒng)具有“免疫監(jiān)控”機(jī)制，可以辨認(rèn)并且消滅癌細(xì)胞。然而，癌 細(xì)胞也具備“免疫逃避”的機(jī)制，其中一種就是在自身癌細(xì)胞外表現(xiàn)B7家族配體，借助與T細(xì)胞的抑制性受體作用，抑制T細(xì)胞的抗腫瘤作用。研究人員發(fā)現(xiàn)，在Tumor-infiltratingLymphocytes(TILs)中PD-1的高表達(dá)，以及PD-L1的高表達(dá)與多種腫瘤密切相關(guān)，如肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤和咽喉癌等(Konishietal.ClinCancerRes，2004，10：5094-5100；Shietal.IntJCancer，2008，128：887-896；Gaoetal.ClinCancerRes，2009，13：1757-1761；Ghebehetal.Neoplasia，2006，8：190-198；Hamanishietal.ProcNatlAcadSciUSA，2007，104：3360-3365；Nomietal.ClinCancerRes，2007，13：2151-2157；Hinoetal.Cancer，2010，116：1757-1766；Ohigashietal.ClinCancerRes，2005，11：2947-2953)。PD-1和PD-L1在這些腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)常常造成這些腫瘤患者的預(yù)后效果不佳。所以，科學(xué)家們企圖了解癌細(xì)胞逃避免疫監(jiān)控的機(jī)制，針對(duì)這些路徑研發(fā)新的治療方法，使癌細(xì)胞無(wú)法抑制免疫反應(yīng)，并借此強(qiáng)化免疫系統(tǒng)本身對(duì)抗癌癥的能力。T細(xì)胞的激活過(guò)程的簡(jiǎn)單示意圖如圖1所示。PD-1和PD-L1的高表達(dá)不僅與癌細(xì)胞逃避免疫進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤有關(guān)，而且與人體中病毒的感染和擴(kuò)增有關(guān)。例如，乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)可以引起肝臟細(xì)胞PD-L1的高表達(dá)，從而激活T-effector細(xì)胞的PD-1信號(hào)通路，導(dǎo)致T細(xì)胞的大量損耗和病毒的持續(xù)感染(Bonietal.JVirol，2007，81：4215-4225；Golden-Masonetal.JImmunol，2008，180：3637-3641)。因此，獲得能中和人PD-1和/或PD-L1的抗體對(duì)于檢測(cè)和治療多種疾病，如治療腫瘤和慢性病毒感染，顯得非常有意義(Blanketal.CancerImmunolImmunother，2005，54：307-314；Okazakietal.IntImmunol，2007，19：813-824)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種抗人PD-1蛋白抗體及其編碼基因和應(yīng)用，該抗體與人PD-1具有高親和力，能用于檢測(cè)和治療人體疾病。一種抗人PD-1蛋白抗體，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)的三個(gè)高變區(qū)CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分別為：GFTFSSYAMS、AISGSGGTTYYADSVKG、AWAPFVNSIVVVTANDL；CDRH1位于重鏈可變區(qū)第26～35位，CDRH2位于重鏈可變區(qū)第50～66位，CDRH3位于重鏈可變區(qū)第99～115位；其輕鏈可變區(qū)的三個(gè)高變區(qū)CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分別為RASQGISTWLA、AASSLQS、QQANSFPI。CDRL1位于輕鏈可變區(qū)第24～34位；CDRL2位于輕鏈可變區(qū)第50～56位，CDRL3位于輕鏈可變區(qū)第89～96位。在抗體分子可變區(qū)上，三個(gè)高變區(qū)的氨基酸序列存在很大的變異性，而高變區(qū)之間的區(qū)域氨基酸序列則變化較小。這三個(gè)高變區(qū)在空間結(jié)構(gòu)上可與抗原決定簇形成精密的互補(bǔ)，因此又被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，不同重鏈輕鏈的CDR決定了抗體對(duì)抗原的特異性。優(yōu)選地，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。抗體可以是全抗體或全抗體的抗原結(jié)合部分。所述的全抗體優(yōu)選為IgG4型；所述的抗原結(jié)合部分優(yōu)選為Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段或單鏈抗體，更優(yōu)選為單鏈抗體。抗原結(jié)合部分既保留了能與抗原特異結(jié)合的區(qū)域，又避免了Fc片段的抗原性而引起的副作用；其中單鏈抗體具有易滲透腫瘤組織中增加藥物濃度，免疫原性小，在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短、易于清除，易于與毒素或酶基因連接從而直接獲得免疫毒素或酶標(biāo)抗體等優(yōu)點(diǎn)?？乖Y(jié)合部分可以通過(guò)DNA重組技術(shù)或通過(guò)酶促/化學(xué)裂解全抗體來(lái)制備。本發(fā)明抗人乳頭瘤病毒L1蛋白單鏈抗體的制備方法為：采用公開(kāi)號(hào)為CN1444651A的中國(guó)專利文獻(xiàn)公開(kāi)的方法構(gòu)建人單鏈抗體文庫(kù)，并在該人單鏈抗體文庫(kù)中篩選抗人PD-1蛋白抗體。本發(fā)明還提供了所述的抗人PD-1蛋白抗體的編碼基因，其中，重鏈可變區(qū)編碼基因的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，輕鏈可變區(qū)編碼基因如SEQIDNo.4所示。本發(fā)明還提供了含有所述編碼基因的重組載體或表達(dá)系統(tǒng)。所述重組載體的原始載體為pACT2或pET27b或全長(zhǎng)抗體表達(dá)載體。本發(fā)明抗人PD-1蛋白抗體可用于制備抗腫瘤藥物或者檢測(cè)PD-1表達(dá)細(xì)胞。本發(fā)明抗人PD-1蛋白抗體能特異地結(jié)合人PD-1蛋白，其中，利用全長(zhǎng)重組的人源抗人PD-1抗體能檢測(cè)表達(dá)PD-1的細(xì)胞，也可預(yù)防和治療腫瘤疾病。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建人單鏈抗體文庫(kù)，采用核糖體展示技術(shù)篩選單鏈抗體，獲得抗人PD-1蛋白抗體，該抗體為全人源抗PD-1蛋白抗體，能特異結(jié)合人PD-1蛋白，與PD-1蛋白的親和力高，既能用于檢測(cè)表達(dá)PD-1的細(xì)胞，也可以治療人體疾病，有效預(yù)防和治療腫瘤疾病。附圖說(shuō)明圖1為PD-1蛋白抗體與PD-1結(jié)合激活T細(xì)胞的過(guò)程示意圖。圖2為本發(fā)明核糖體展示用的全人源抗體文庫(kù)(T7-VH-Vκ-Cκ和T7-VH-Vλ-Cκ)的DNA序列構(gòu)建示意圖。圖3為本發(fā)明使用核糖體展示技術(shù)篩選單鏈抗體的流程示意圖。圖4為本發(fā)明使用核糖體展示技術(shù)篩選單鏈抗體過(guò)程中單鏈抗體表達(dá)系統(tǒng)再生流程的示意圖。圖5為抗人PD-1單鏈抗體#hPD1-B與純化后的人PD-1蛋白的ELISA檢測(cè)結(jié)果。圖6為抗人PD-1全長(zhǎng)抗體QAV123-B和非特異性抗體人IgG誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞分泌γ干擾素的結(jié)果。圖7為抗人PD-1全長(zhǎng)抗體QAV123-B、非特異性抗體人IgG和PBS對(duì)照組抑制SCID鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染PD-L1的肝癌細(xì)胞Hep3B/PD-L1的結(jié)果(箭頭為抗體藥物注射時(shí)間)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1核糖體展示用全人源單鏈抗體文庫(kù)的構(gòu)建核糖體展示用全人源抗體文庫(kù)(T7-VH-Vκ-Cκ和T7-VH-Vλ-Cκ)的DNA序列構(gòu)建過(guò)程，如圖2所示。具體構(gòu)建過(guò)程如下：1、擴(kuò)增得到人抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)DNA以來(lái)自人骨髓、人胎肝、人脾和人外周血白細(xì)胞的polyA+RNA(購(gòu)自Clontech)為模板，利用oligo(dT)和隨機(jī)引物(randomprimers)，使用逆向轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(購(gòu)自Clontech)，根據(jù)Clontech試劑盒所提供的方法指南，將polyA+RNA逆向轉(zhuǎn)錄成cDNA。以上述cDNA為模板，利用一系列識(shí)別人抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到人抗體中所有的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的DNA序列。一系列識(shí)別人抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的引物序列如下：第一組，為擴(kuò)增人抗體重鏈可變區(qū)(VH)基因的5’-端引物(SEQIDNo.11～17)，包括：VH1b：5’-CTATAGGAACAGACCACCATGCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC(C/G)G-3’；VH2b：5’-CTATAGGAACAGACCACCATGCAGGTACAGCTGCAGCAGTCA-3’；VH3b：5’-CTATAGGAACAGACCACCATGCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGG-3’；VH4b：5’-CTATAGGAACAGACCACCATGGAGGTGCAGCTG(G/T)TGGAG(A/T)C(C/T)-3’；VH5b：5’-CTATAGGAACAGACCACCATGCAGGTCCAGCT(G/T)GT(A/G)CAGTCTGG-3’；VH6b：5’-CTATAGGAACAGACCACCATGCAG(A/G)TCACCTTGAAGGAGTCTG-3’；VH7b：5’-CTATAGGAACAGACCACCATGCAGGTGCAGCTGGTG(C/G)A(A/G)TCTGG-3’；第二組，為擴(kuò)增人抗體重鏈可變區(qū)(VH)基因的3’-端引物(SEQIDNo.18～23)，包括：VH1f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGAC(A/G)GTGACCAGGGTG-3’；VH2f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTT-3’；VH3f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAAGAGACGGTGACCATTGT-3’；VH4f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC-3’；VH5f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCGGTTGGGGCGGATGCACTCC-3’；VH6f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCC(C/G)GATGGGCCCTTGGTGGA(A/G)GC-3’；第三組，為擴(kuò)增人抗體λ-輕鏈可變區(qū)(Vλ)基因的5’-端引物(SEQIDNo.24～32)，包括：VL1b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGTCTGT(C/G)(C/G/T)TGACGCAGCCGCC-3’；VL2b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTATG(A/T)GCTGAC(A/T)CAGCCAC-3’；VL3b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTATGAGCTGA(C/T)(A/G)CAGC(C/T)A CC-3’；VL4b：5’GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGCCTGTGCTGACTCA(A/G)(C/T)C-3’；VL5b：5’GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAG(A/G/T)CTGTGGTGAC(C/T)CAGGAGCC-3’；VL6b：5’GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGCC(A/T)G(G/T)GCTGACTCAGCC(A/C)CC-3’；VL7b：5’GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTCTGAGCTGA(C/G)TCAGGA(C/G)CC-3’；VL8b：5’GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGTCTG(C/T)(C/T)CTGA(C/T)TCAGCCT-3’；VL9b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTAATTTTATGCTGACTCAGCCCC-3’；第四組，為擴(kuò)增人抗體λ-輕鏈可變區(qū)(Vλ)基因的3’-端引物(SEQIDNo.33～34)，包括：VL1f：5’-AGATGGTGCAGCCACAGTTCGTAGGACGGT(C/G)A(C/G)CTTGGTCC-3’；VL2f：5’AGATGGTGCAGCCACAGTTCGGAGGACGGTCAGCTGGGTGC-3’；第五組，為擴(kuò)增人抗體k-輕鏈可變區(qū)(Vk)基因的5’-端引物(SEQIDNo.35～38)，包括：Vκ1b：5’GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGACATCC(A/G)G(A/G/T)TGACCCAGTCTCC-3’；Vκ2b：5’GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGAAATTGT(A/G)(A/T)TGAC(A/G)CAGTCTCC-3’；Vκ3b：5’GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGATATTGTG(A/C)TGAC(C/G/T)CAG(A/T)CTCC-3’；Vκ4b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGAAACGACACTCACGCAGTCTC-3’；第六組，為擴(kuò)增人抗體k-輕鏈不變區(qū)(Vk)基因的3’-端引物(SEQIDNo.39)：Cκf：5’-CTCTAGAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAGCTCAGGCCCTGATGGGTGACTTCGCAGGCGTAGACTTTG-3’。擴(kuò)增人抗體中的重鏈可變區(qū)(VH)時(shí)，利用第一組引物與第二組引物的組合，即有42個(gè)PCR反應(yīng)；擴(kuò)增人抗體中的λ-輕鏈可變區(qū)(Vλ)時(shí)，利用第三組引物與第四組引物的組合，即有18個(gè)PCR反應(yīng)；擴(kuò)增人抗體中的κ輕鏈可變區(qū)(Vκ)時(shí)，利用第五組引物與第六組引物的組合，即有4個(gè)PCR反應(yīng)。第一組引物中包含有部分T7啟動(dòng)子序列、Kozak序列(CCACC)和翻譯起始編碼序列ATG；第四組和第六組引物中包含有人κ輕鏈不變區(qū)的序列(下劃線部分)；而第二組、第三組和第五組引物中包含有連接肽序列(下劃線部分)，連接肽用于連接抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。擴(kuò)增時(shí)，PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件均相同，PCR反應(yīng)體系為：將上述各組分混合均勻后置于PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為：94℃解鏈1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延伸2.5分鐘，循環(huán)30次。2、連接T7啟動(dòng)子序列、連接肽序列和κ輕鏈不變區(qū)的序列在重鏈可變區(qū)的5’-端增加T7啟動(dòng)子序列、Kozak序列和翻譯啟動(dòng)編碼ATG；而在其3’-端添加連接肽序列。在λ輕鏈可變區(qū)的5’-端增加連接肽序列；而在其3’-端添加κ輕鏈的不變區(qū)。3’-端κ輕鏈不變區(qū)的末端不含翻譯的終止編碼子(stopcodon)。(1)組合T7啟動(dòng)子序列-人抗體重鏈可變區(qū)(VH)序列-連接肽序列以步驟1中PCR(第一組和第二組引物)所得的人抗體重鏈可變區(qū)DNA為模板，分別以引物7和引物8為上游引物和下游引物，序列為：上游引物(引物7，即T7Kz，SEQIDNo.40，下劃線部分為T7啟動(dòng)子序列)：5’-GCAGCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCACCATG-3’；下游引物(引物8，SEQIDNo.41，為連接肽反鏈序列)：5’-ACTGCCTCCACCACCGCTGCCACCTCCGCCAGATCCTCCGCCGCCTGATCCACCACCGCC-3’；進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件和體系同上述步驟1(所述步驟1是指本實(shí)施例中第一部分，即擴(kuò)增得到人抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)DNA的部分)。反應(yīng)完成后，人抗體重鏈可變區(qū)的DNA序列在5’-端含T7啟動(dòng)子和Kozak序列，在3’-端連接肽反鏈序列(即：T7-Kozak-VH-連接肽)。(2)組合連接肽序列-人抗體λ輕鏈可變區(qū)(Vλ)序列-和κ輕鏈不變區(qū)(Cκ)的序列應(yīng)用下列二個(gè)引物，從步驟1中獲得的人κ輕鏈DNA擴(kuò)增獲得κ鏈的不變序列：Cκb(SEQIDNo.42)：5’-CGAACTGTGGCTGCACCATCTGT-3’；Cκf(SEQIDNo.39)PCR的模板DNA是從步驟1中獲得的人κ輕鏈DNA。PCR反應(yīng)的條件和體系與步驟1一致。擴(kuò)增后所得的κ鏈不變區(qū)(Cκ)DNA序列(SEQIDNo.43)；SEQIDNo.43如下：5’-CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTCTAGAG-3’；以步驟1中PCR(第三組和第四組引物)所得的人抗體λ輕鏈可變區(qū)(Vλ)DNA為模 板，以引物9和Cκf(SEQIDNo.39)分別為上游引物和下游引物，序列如下：上游引物(引物9，SEQIDNo.44，連接肽順鏈序列)：5’-GGCGGTGGTGGATCAGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGCAGCGGTGGTGGAGGCAGT-3’；混合上述κ鏈不變區(qū)(Cκ)DNA序列(SEQIDNo.43)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件和體系同步驟1。反應(yīng)完成后，獲得含5’-連接肽順鏈序列的人抗體λ輕鏈可變區(qū)(Vλ)DNA序列-κ鏈不變區(qū)(Cκ)DNA序列(即：連接肽-Vλ-Cκ)。3、構(gòu)建核糖體展示人單鏈抗體基因文庫(kù)將上述步驟獲得的PCR產(chǎn)物混合，即：步驟2(1)中PCR擴(kuò)增得到的含T7啟動(dòng)子、Kozak序列和連接肽序列的人抗體重鏈可變區(qū)DNA(T7-Kozak-VH-連接肽)，步驟2(2)中含連接肽-人抗體λ輕鏈可變區(qū)DNA(Vλ)-κ鏈不變區(qū)(Cκ)DNA序列(連接肽-Vλ-Cκ)，以及步驟1的第五組和第六組引物PCR擴(kuò)增所得的κ鏈可變區(qū)(Vκ)和不變區(qū)(Cκ)DNA產(chǎn)物(連接肽-Vκ-Cκ)進(jìn)行混合，以該混合DNA為模板，分別以引物7(T7Kz，SEQIDNo.40)和引物Ckf(SEQIDNo.39)為上游引物和下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件和體系同步驟1。如圖2所示，反應(yīng)完成后，得到包含T7啟動(dòng)子-Kozak序列-ATG人抗體重鏈可變區(qū)DNA序列(VH)、連接肽DNA序列、輕鏈可變區(qū)DNA序列以及κ輕鏈不變區(qū)DNA序列(Cκ)的用于核糖體展示的人單鏈抗體(scFv)DNA文庫(kù)。該人單鏈抗體在3’-端κ輕鏈不變區(qū)的末端不含翻譯的終止編碼子(stopcodon)。核糖體翻譯時(shí)，在遇到不含終止編碼子的情形下不會(huì)從mRNA脫落，也不會(huì)釋放所翻譯的蛋白或多肽，而形成一個(gè)蛋白-核糖體-mRNA復(fù)合體。實(shí)施例2核糖體展示篩選結(jié)合PD-1蛋白的全人源單鏈抗體核糖體展示篩選單鏈抗體的過(guò)程如圖3所示。上述實(shí)施例1所制備的scFv單鏈抗體文庫(kù)DNA因不含終止編碼子，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，而產(chǎn)生抗體(Antibody)-核糖體(Ribosome)-mRNA所形成的復(fù)合體(“ARM復(fù)合體”)。用固定在固相上的抗原篩選ARM復(fù)合體上的抗體。將非特異ARM復(fù)合體洗脫后，用RT-PCR方法獲得能與抗原結(jié)合抗體的DNA。用PCR法重新加上T7啟動(dòng)子等，再生獲得全長(zhǎng)可用于核糖體展示的DNA。(1)生物素偶聯(lián)PD-1蛋白到親和素磁珠人PD-1蛋白(產(chǎn)品目錄號(hào)10377-H03H)購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；EZ-linkTMsulfo-NHS-LC-biotin購(gòu)自Pierce公司；親和素磁珠(DynabeadsM-280streptavidin)購(gòu)自Dynal公司。將人PD-1蛋白(磷酸緩沖液生理鹽水PBS，pH7.5)與sulfo-NHS-LC-biotin混合(混合比例為25微克蛋白：1微克sulfo-NHS-LC-biotin)，25℃的室溫條件下反應(yīng)30分鐘，在4℃ 條件下用2×500毫升PBS，pH7.5dialysis過(guò)夜。偶聯(lián)有生物素的PD-1蛋白可用于偶聯(lián)到親和素磁珠。將50微升親和素磁珠(DynabeadsM-280streptavidin)用300微升0.1M磷酸緩沖液(pH7.5)洗3遍后，再懸浮于50微升PBS中。將5微克偶聯(lián)有生物素的PD-1蛋白與親和素磁珠混合(蛋白與磁珠的混合比例為10微克：1毫克)，25℃的室溫條件下反應(yīng)30分鐘。用300微升PBS洗3遍后，將偶聯(lián)有PD-1蛋白的磁珠再懸浮于50微升的PBS(含0.02％疊氮化鈉SodiumAzide)。(2)制備“ARM復(fù)合體”文庫(kù)T7系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄和翻譯聯(lián)合(TNT)的兔血紅細(xì)胞裂解液(RabbitReticulocyteLysateTNTforT7)購(gòu)自Promega公司；AMV逆向轉(zhuǎn)錄酶(AMVReverseTranscriptase)購(gòu)自Promega公司；無(wú)RNase的DNaseI(Rnase-freeDnaseI)購(gòu)自Roche公司。在30℃溫度下孵育60分鐘。孵育后加入14μL的10×DNaseI緩沖液(400mMTris-HCl，pH7.5，60mMMgCl2，100mMNaCl)和200單位的RNase-freeDNaseI，H2O至140μL，30℃下繼續(xù)孵育30分鐘，以消解DNA。然后，加入210μL冷(4℃)的PBS(含5mMMgAcetate)，得到“ARM復(fù)合體”文庫(kù)。(3)人PD-1蛋白篩選ARM復(fù)合體文庫(kù)取150μL上述(2)步驟獲得的ARM復(fù)合體文庫(kù)，混合5μL偶聯(lián)了PD-1蛋白的磁珠，在4℃環(huán)境中緩緩搖動(dòng)2小時(shí)；然后，用100μL冷PBS將磁珠洗3遍；加入20μL的不含RNase的無(wú)菌水。(4)原位RT-PCR回收scFv抗體DNA鑒于上述篩選后的ARM復(fù)合體的3’-端的mRNA序列被停留在3’末端的核糖體所占領(lǐng)，在回收過(guò)程中應(yīng)用mRNA3’末端上游約60個(gè)堿基位置的引物(RT1)進(jìn)行逆向轉(zhuǎn)錄。過(guò)程如圖4所示。RT-PCR試劑盒購(gòu)自Roche公司。RT1引物(SEQIDNo.45)的序列如下：RT1：5’-ACTTCGCAGGCGTAGAC-3’；而在RT-PCR反應(yīng)中，另一端的引物(Kz1)則使用在mRNA上游包含Kozac序列和ATG的序列。引物Kz1的序列如下(SEQIDNo.46)：Kz1：5’-GAACAGACCACCATG-3’；RT-PCR反應(yīng)條件如下：反應(yīng)條件如下：1個(gè)循環(huán)：48℃，45分鐘；94℃，2分鐘；35個(gè)循環(huán)：94℃，30秒；54℃，1分鐘；68℃，2分鐘；最后，68℃，7分鐘；然后4℃維持。(5)再生全長(zhǎng)scFv抗體DNA上述(4)步驟所得的DNA產(chǎn)物比原始的DNA短，而且不含T7啟動(dòng)子序列。應(yīng)用引物T7Kz(SEQIDNo.40)和引物Ckf(SEQIDNo.39)通過(guò)PCR反應(yīng)再生全長(zhǎng)scFv抗體DNA。反應(yīng)條件為：反應(yīng)條件如下：30個(gè)循環(huán)：94℃，30秒；54℃，1分鐘；68℃，2分鐘；最后，68℃，7分鐘；然后4℃維持。重復(fù)上述第(2)至(5)步驟3個(gè)循環(huán)，用PCR克隆試劑盒(購(gòu)自LifeTechnologies公司)將最終的PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體，并對(duì)最終獲得的scFv單鏈抗體DNA進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)上述多步驟、多循環(huán)的富集、分析后，得到一個(gè)對(duì)人PD-1蛋白具有特異性的單鏈抗體，編號(hào)為#hPD1-B，使用ABI自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)該單鏈抗體進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示：#hPD1-B的重鏈可變區(qū)的DNA序列如SEQIDNo.3所示；#hPD1-B的重鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNo.1)為：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNNLRVEDTAVYYCAKAWAPFVNSIVVVTANDLWGQGTLVTVSSGSASAPT；其中，下劃線部分依次為三個(gè)高變區(qū)CDRH1、CDRH2、CDRH3(SEQIDNo.5～7)；#hPD1-B的輕鏈可變區(qū)的DNA序列如SEQIDNo.4所示；#hPD1-B的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNo.2)為：DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPITFGQGTRLEIK；其中，下劃線部分依次為三個(gè)高變區(qū)CDRL1、CDRL2、CDRL3(SEQIDNo.8～10)。實(shí)施例3單鏈抗體表達(dá)與純化將單鏈抗體#hPD1-B的編碼基因克隆到表達(dá)載體pET27b(+)中，構(gòu)建得到pET27b-HPD1b；將pET27b-HPD1b轉(zhuǎn)化入表達(dá)細(xì)菌E.coliBL21(DE3)，并按照Novagen公司提供的方法用IPTG(0.5mM)誘導(dǎo)表達(dá)；表達(dá)出的目標(biāo)蛋白中，scFv的N端是pelB序列，pelB序列可將表達(dá)后的scFv分泌到BL21(DE3)的周質(zhì)腔(periplasmicspace)中；scFv的C端含有一個(gè)HSV標(biāo)記物和一個(gè)6×His標(biāo)記物，方便目標(biāo)蛋白的純化；應(yīng)用Qiagen公司所提供的方法方便地用Ni-NTA柱分離純化得到抗人PD-1蛋白的單鏈抗體。實(shí)施例4ELISA測(cè)試單鏈抗體對(duì)人PD-1蛋白的特異性重組人PD-1蛋白(hPD1)購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司。該重組PD-1蛋白的C末端帶有His標(biāo)記以及人IgG1的Fc片段。ELISA測(cè)試方法如下：(1)用hPD1蛋白包被96-孔板，在2-8℃過(guò)夜；(2)包被后的96-孔板再用SuperBlock作封閉處理；(3)將單鏈抗體#hPD1-B在0.02％BSA中作系列稀釋后加入已包被有hPD1蛋白的96-孔中，與hPD1蛋白結(jié)合；(4)將96-孔板清洗后，加入稀釋5000倍的鼠抗HSV標(biāo)記物的抗體，用來(lái)檢測(cè)結(jié)合了的單鏈抗體；(5)將96-孔板清洗后，加入稀釋10000倍的山羊抗鼠IgG抗體-辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物；(6)將96-孔板最終清洗后，應(yīng)用辣根過(guò)氧化物酶底物TMB試劑作顯色處理；(7)用0.5M的硫酸終止反應(yīng)，并檢測(cè)450nm的吸收光譜。檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，表明單鏈抗體#hPD1-B能有效地結(jié)合hPD1蛋白。實(shí)施例5抗人PD-1全長(zhǎng)抗體與人PD-1的親和力委托青島艾華隆生物科技有限公司制備全長(zhǎng)重組人源抗人PD-1蛋白抗體QAV123-B(緩沖液為常規(guī)磷酸緩沖液，濃度為1.0mg/ml)。全長(zhǎng)的QAV123-B為IgG4型，其可變區(qū)序列與單鏈抗體#hPD1-B的可變區(qū)序列相同。人PD-1蛋白(產(chǎn)品目錄號(hào)10377-H03H)購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司，該蛋白通過(guò)人細(xì)胞表達(dá)。應(yīng)用光學(xué)表面等離子共振(SurfacePlasmonResonance，SPR)原理的BIAcoreTMT-200儀器(GELifeSciences)基本采用常規(guī)方法檢測(cè)QAV123-B與PD-1蛋白的親和常數(shù)。檢測(cè)用緩沖液為HBSN緩沖液(10mMHEPESpH7.4，0.15MNaCl，3mMEDTA，0.005％v/vSurfactantP20，GEHealthcare)。結(jié)合速率(Associationrates，Kon)和解離速率(Dissociationrates，Koff)根據(jù)Langmuir親和模型計(jì)算(BIAEvaluation軟件，GELifeSciences)。平衡親和常數(shù)(KD)為Koff/Kon的比值。結(jié)果如下：表1.QAV123-B抗體親和常數(shù)抗體Kon(M-1，s-1)Koff(s)KD(M)QAV123-B1.83×1057.26×10-33.97×10-8實(shí)施例6抗人PD-1全長(zhǎng)抗體激活人原代外周血單核細(xì)胞(PBMC)γ干擾素的分泌1、建立穩(wěn)定細(xì)胞株HEK293細(xì)胞源自美國(guó)ATCC(Rockville，Maryland)。編碼人PD-L1的cDNA(NCBIAccession#NM-014143)由南京金斯瑞公司合成，并克隆到pcDNA3.1/Hygromycin質(zhì)粒中。應(yīng)用常規(guī)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，把上述帶有PD-L1的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，并在包含200μg/mlHygromycin(Sigma公司)的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。篩選后的HEK293/PD-L1細(xì)胞通過(guò)有限稀釋培養(yǎng)(LimitedDilution)的方法獲得細(xì)胞株(FullerSA等，2001.CurrentProtocolsofMolecularBiology.第11章，11.8節(jié))。表達(dá)PD-L1的細(xì)胞株再用抗PD-L1抗體(產(chǎn)品目錄號(hào)17-5983，美國(guó)eBioscience公司，SanDiego)結(jié)合流式細(xì)胞儀FACS進(jìn)行分析，挑選PD-L1表達(dá)量高的細(xì)胞株。2、抗人PD-1抗體激活人PBMC的γ干擾素的分泌人原代外周血單核細(xì)胞PBMC細(xì)胞中多數(shù)(約60-70％)為T細(xì)胞，T細(xì)胞表面表達(dá)有PD-1分子。經(jīng)抗CD3抗體預(yù)處理后，在抗PD-1抗體和表面表達(dá)有PD-L1的細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，T細(xì)胞會(huì)被激活而分泌γ干擾素。PBMC源自健康捐獻(xiàn)者的外周血，根據(jù)供應(yīng)商提供的方法，用FicollLymphocyteSeparationMedium(美國(guó)Sigma-Aldrich公司，Histopaque-1077)密度梯度離心方法制備獲得。上述所制備的PBMC細(xì)胞首先用抗CD3單克隆抗體(40ng/ml)(美國(guó)加州eBioscience公司，產(chǎn)品目錄號(hào)16-0037)預(yù)處理3天；然后，預(yù)處理過(guò)的PBMC細(xì)胞(1x104)與上述的HEK293/PD-L1細(xì)胞(3x104)在96-孔平等細(xì)胞培養(yǎng)板中共培養(yǎng)18小時(shí)，培養(yǎng)基中包含1.0nM抗PD-1抗體QAV123-B或包含1.0nM非特異人IgG抗體(美國(guó)Sigma公司)；培養(yǎng)18小時(shí)后，取培養(yǎng)基上清液應(yīng)用γ干擾素(γ-IFN)ELISA試劑盒(美國(guó)Beckton-Dickinson公司)分析。分泌γ干擾素是T細(xì)胞激活非常重要的指標(biāo)。結(jié)果如圖6所示，與非特異人IgG相比，抗人PD-1抗體能激活PBMC的T細(xì)胞，并使T細(xì)胞有效分泌γ干擾素。實(shí)施例7抗人PD-1抗體激活人外周血單核細(xì)胞PBMC并在動(dòng)物模型體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)人肝癌腫瘤細(xì)胞株Hep3B源自美國(guó)ATCC(Rockville，Maryland)。編碼人PD-L1的cDNA(NCBIAccession#NM-014143)由南京金斯瑞公司合成，并克隆到pcDNA3.1/Hygromycin 質(zhì)粒中。應(yīng)用常規(guī)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，把上述帶有PD-L1的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染入Hep3B細(xì)胞，并在包含200μg/mlHygromycin(Sigma公司)的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選14天；篩選后的Hep3B/PD-L1細(xì)胞株通過(guò)稀釋培養(yǎng)的方法獲得細(xì)胞株(FullerSA等，2001.CurrentProtocolsofMolecularBiology.第11章，11.8節(jié))。表達(dá)PD-L1的細(xì)胞株再用抗PD-L1抗體(產(chǎn)品目錄號(hào)17-5983，美國(guó)eBioscience公司，SanDiego)結(jié)合流式細(xì)胞儀FACS進(jìn)行分析，挑選PD-L1表達(dá)量高的人肝癌腫瘤細(xì)胞株Hep3B/PD-L1。根據(jù)文獻(xiàn)(PollackVA等1999.“InhibitionofEpidermalgrowthfactorreceptor-associatedtyrosinephosphorylationinhumancarcinomaswithCP-358：Dynamicsofreceptorinhibitioninsituandantitumoreffectsinathymicmice.”J.Pharmacol.Exp.Ther.291：739-748.)中記載的方法，在SCID鼠體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤。將人肝癌腫瘤細(xì)胞株Hep3B/PD-L1(約3x106個(gè)細(xì)胞)與50％Matrigel(美國(guó)Beckton-Dickinson公司)制劑皮下注射到6-7周雄性的SCID鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤；腫瘤細(xì)胞接種15天后，腫瘤形成到約100-200mm3大小時(shí)，在腫瘤內(nèi)注射5×105個(gè)原代人外周血單核細(xì)胞PBMC(混合后的來(lái)源于三個(gè)健康捐獻(xiàn)者的PBMC細(xì)胞)。在接種PBMC三天后，將這些SCID鼠分成三組，分別將(1)抗PD-1抗體(QAV123-B)、(2)非特異的人IgG蛋白(美國(guó)Sigma公司)、(3)磷酸緩沖液PBS以皮下注射方式注射入上述的SCID鼠體內(nèi)。抗體用量為10mg/kg，隔10天后相同劑量再次注射，共注射三次。用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的二個(gè)直徑來(lái)確定腫瘤的尺寸，并根據(jù)文獻(xiàn)(“Protocolsforscreeningchemicalagentsandnaturalproductsagainstanimaltumorsandotherbiologicalsystems.”CancerChemother.Rep.3：1-104.)記載的方法計(jì)算腫瘤的體積，腫瘤體積＝(長(zhǎng)度×[寬度]2)/2。圖7所示的為接種PBMC三天后，分別將抗PD-1抗體(QAV123-B)或非特異的人IgG蛋白或磷酸緩沖液PBS以皮下注射方式注射入上述的SCID鼠體內(nèi)處理后，腫瘤大小與時(shí)間變化的關(guān)系。檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，抗PD-1抗體QAV123-B對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的腫瘤抑制效果?？筆D-1抗體QAV123-B處理40天以后，腫瘤大小僅為對(duì)照組的約60％。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3