本發(fā)明屬于禽類用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞腺病毒4型高免卵黃抗體的制備方法。

背景技術(shù)：

禽腺病毒屬于禽腺病毒科禽腺病毒屬，根據(jù)其抗原性的不同可分為3個(gè)群，且根據(jù)血清中和反應(yīng)Ⅰ群禽腺病毒包含12個(gè)血清型，4型禽腺病毒主要感染3-5周齡雞子，臨床和病理癥狀為心包積液綜合征、包涵體肝炎、腎炎等，致死率30-70％。由于腺病毒4型首次爆發(fā)于1987年的巴基斯坦，隨至傳播至印度、日本、墨西哥、智利、中國(guó)等一些國(guó)家，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)大量損失。大量研究者發(fā)現(xiàn)不同的毒株在飼養(yǎng)條件下是同等感染，自然條件或口服接種后病程是7-15天。禽腺病毒是接觸性傳染性疾病，既可以水平傳播，也可以垂直傳播。

心包積液綜合征最初認(rèn)為是由霉菌毒素、脂肪中毒、多氯聯(lián)苯、氯化鈉、藻毒素等引起的中毒或者營(yíng)養(yǎng)不良導(dǎo)致的，然而根據(jù)這些原因治療之后均不能起到有效的治療。隨后研究發(fā)現(xiàn)心包積液綜合征是由一個(gè)病毒引起的，電子顯微鏡觀察到病毒呈六邊形。后來(lái)，人們開(kāi)始通過(guò)雞胚原代肝細(xì)胞、雞胚原代腎細(xì)胞、雞胚等途徑對(duì)病毒開(kāi)始進(jìn)行純化增殖，發(fā)現(xiàn)感染3-4天后其可視細(xì)胞變圓、腫脹、脫落，感染的雞胚會(huì)生長(zhǎng)受阻、出血點(diǎn)、100％死亡。近年來(lái)，心包積液和包涵體肝炎在全世界爆發(fā)率增加，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)大量損失。

目前，大量學(xué)者嘗試各種方法來(lái)預(yù)防腺病毒帶來(lái)的危害，最開(kāi)始是用發(fā)病雞的組織來(lái)免疫雞子，但是這種方法可能導(dǎo)致病毒的傳播，后來(lái)學(xué)者發(fā)明了腺病毒滅活苗、亞單位疫苗、弱毒疫苗。卵黃抗體IgY是一種免疫球蛋白Ig，功能上類似于哺乳動(dòng)物的IgG，但是結(jié)構(gòu)上有所差異，具有典型的免疫球蛋白的空間構(gòu)象。卵黃抗體具有很多優(yōu)點(diǎn)：1)卵黃抗體不會(huì)激發(fā)補(bǔ)體系統(tǒng)，不與抗哺乳動(dòng)物抗原的抗體反應(yīng)，且不與哺乳動(dòng)物和細(xì)菌的Fc受體結(jié)合；2)卵黃抗體作為一種具有生物活性的免疫球蛋白，在貯存、生產(chǎn)、加工、攝食及消化過(guò)程中保證其穩(wěn)定性是非常關(guān)鍵的。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明IgY具有較好的穩(wěn)定性，耐酸、耐堿、耐熱。卵黃抗體較易保存，4℃條件下存放5年或室溫條件下存放6個(gè)月對(duì)抗體活性無(wú)明顯影響；3)卵黃抗體量大，成本低，便于規(guī)?；a(chǎn)。卵黃中抗體濃度能長(zhǎng)期維持在相當(dāng)于甚至超過(guò)血清抗體濃度的水平上。且卵黃抗體對(duì)動(dòng)物沒(méi)有毒副作用。目前卵黃抗體的制備及生產(chǎn)工藝已經(jīng)成熟，可以保質(zhì)保量的生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供一種雞腺病毒4型高免卵黃抗體的制備方法。

其技術(shù)方案為：

一種雞腺病毒4型高免卵黃抗體的制備方法，包括以下步驟：

步驟1、分離毒株制備疫苗：樣品經(jīng)過(guò)研磨，凍融3次，12000g/min告訴離心8min，吸取上清液，將上清液接種到雞胚尿囊腔，經(jīng)過(guò)3代的傳遞，根據(jù)雞胚的病變和PCR檢測(cè)情況，驗(yàn)證得到弱毒株XH03；

步驟2、免疫健康雞群制得蛋：采用自備的雞腺病毒滅活苗對(duì)健康21只進(jìn)行免疫，免疫兩次，間隔兩周，一周后開(kāi)始收集蛋，清理、消毒、晾干備用；

步驟3、將收集好的雞蛋表面污物洗干凈，在0.4％的新潔爾滅溶液中浸泡15min；取出后用消毒紗布擦干，從小頭打破蛋殼后倒盡蛋清；用不帶針頭的1ml無(wú)菌注射器插入蛋黃中，吸取500ul放入高壓滅菌過(guò)的2ml離心管內(nèi)，加入1ml PBS緩沖液，即卵黃：PBS以1:2的比例稀釋；在卵黃液中加入青、鏈霉素各1000單位/ml；按0.01％加入硫柳汞，以防止微生物污染；在漩渦混勻器上充分混合均勻，并用封口膜封口，放置4℃?zhèn)溆茫?/p>

步驟4、高免卵黃抗體的提取

1)用PBS稀釋卵黃液，體積比為2:1，用PEG-6000配成3.5％的PEG溶液，混合均勻，靜置20min，4℃，14000rpm離心10min；

2)棄去上清液和脂肪層。添加PEG-6000，配成12％的PEG溶液，混合均勻，靜置20min。4℃，14000rpm離心10min。

3)棄去上清液，用PBS稀釋沉淀至原卵黃液體積。然后添加PEG-6000，配成12％(w/v)的PEG溶液，混合均勻，靜置20min。4℃，14000rpm離心10min。

4)棄去上清液，PEG用抽氣法移走，然后用PBS溶解沉淀至體積為原卵黃溶液的二分之一。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明先通過(guò)制備出免疫性強(qiáng)的毒株制成疫苗，并制備高免蛋，經(jīng)過(guò)消毒、收集卵黃、處理得到腺病毒4型高免卵黃抗體。采用本發(fā)明的方法制備的雞腺病毒4型高免卵黃抗體不僅可以對(duì)腺病毒病進(jìn)行有效的治療，而且在臨床上減少了操作強(qiáng)度、降低飼養(yǎng)成本，本發(fā)明的雞腺病毒高免卵黃抗體便于運(yùn)輸和儲(chǔ)藏，而且保存時(shí)間長(zhǎng)，能保持較高的抗體效價(jià)。

附圖說(shuō)明

圖1是雞腺病毒4型高免卵黃抗體的制備方法的流程圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明。

如圖1所示，一種雞腺病毒4型高免卵黃抗體的制備方法，包括：分離株制備疫苗，免疫健康雞群制得蛋，將蛋經(jīng)過(guò)消毒處理，提取卵黃、配制、分裝得到腺病毒4型高免卵黃注射液。具體步驟如下：

1)分離毒株制備疫苗：本次病毒樣品主要從湖北新洲發(fā)病雞采集的肝臟、心臟等組織樣品，樣品經(jīng)過(guò)研磨，凍融3次，12000g/min告訴離心8min，吸取上清液，將上清液接種到雞胚尿囊腔，經(jīng)過(guò)3代的傳遞，根據(jù)雞胚的病變和PCR檢測(cè)情況，驗(yàn)證得到弱毒株XH03，

2)免疫健康雞群制得蛋：采用自備的雞腺病毒滅活苗對(duì)健康21只進(jìn)行免疫，免疫兩次，間隔兩周，一周后開(kāi)始收集蛋，清理、消毒、晾干備用；

3)將收集好的雞蛋表面污物洗干凈，在0.4％的新潔爾滅溶液中浸泡15min；取出后用消毒紗布擦干，從小頭打破蛋殼后倒盡蛋清；用不帶針頭的1ml無(wú)菌注射器插入蛋黃中，吸取500ul放入高壓滅菌過(guò)的2ml離心管內(nèi)，加入1ml PBS緩沖液，即卵黃：PBS以1:2的比例稀釋；在卵黃液中加入青、鏈霉素各1000單位/ml；按0.01％加入硫柳汞(thimerosal)，以防止微生物污染；在漩渦混勻器上充分混合均勻，并用封口膜封口，放置4℃?zhèn)溆谩?/p>

PEG可以是卵黃液脫脂的原因是因?yàn)閷儆诜请x子型表面活性劑，可以破壞卵黃脂類水化膜，打破卵黃的乳化狀態(tài)，卵黃脂類相互凝結(jié)而發(fā)生沉淀，從而實(shí)現(xiàn)脂水分離。然而當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)，也會(huì)破壞抗體蛋白的水化膜使之發(fā)生沉淀，從而影響抗體效價(jià)，所以微量濃度的表面活性劑有利于抗體蛋白的提取。

卵黃抗體的提取方法有多種，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件及檢測(cè)方法，選擇了三種方法：

a.有機(jī)溶劑提取方法

有機(jī)溶劑的提取方法主要根據(jù)氯仿.聚乙二醇-6000法(cH-PEG法)。具體步驟如下：

1)將卵黃液用配制好的PBS緩沖液稀釋(卵黃液與PBS的體積比為1:2)。

2)用同體積的氯仿溶液與卵黃稀釋液混合均勻，4℃，10000rpm離心30min。

3)倒盡水層，添加12％(w/v)的聚乙二醇-6000，攪拌，靜置30min，然后4℃，10000rpm離心30min。

4)棄去上清液，沉淀用PBS溶解至體積為原卵黃溶液的二分之一。

b.PEG-6000提取法(Polson等1980)

1)用PBS稀釋卵黃液，體積比為2:1，用PEG-6000配成3.5％(w/v)的PEG溶液，混合均勻，靜置20min。4℃，14000rpm離心10min。

2)棄去上清液和脂肪層。添加PEG-6000，配成12％的PEG溶液，混合均勻，靜置20min。4℃，14000rpm離心10min。

3)棄去上清液，用PBS稀釋沉淀至原卵黃液體積。然后添加PEG-6000，配成12％(w/v)的PEG溶液，混合均勻，靜置20min。4℃，14000rpm離心10min。

4)棄去上清液，PEG用抽氣法移走，然后用PBS溶解沉淀至體積為原卵黃溶液的二分之一。

c.氯仿抽提法

卵黃原液加入滅菌的燒杯中,用PBS稀釋2倍,再加入與卵黃原液生理鹽水等體積的氯仿，充分振蕩后，37℃水浴30分鐘，其間攪拌2-3次，4000r/min，離心20分鐘后，待測(cè)樣品分三層，一層為所需的提取液、第二層是蛋黃，第三層是氯仿。用ELISA試劑盒檢測(cè)提取的IgY的濃度。

表1

如表1所示，結(jié)果分析：三種方法第二種即用氯仿-PEG6000聯(lián)合提取卵黃抗體最好；此外從三種方法看出早期試驗(yàn)蛋黃中抗體較高于后期。但是從檢測(cè)數(shù)據(jù)上看三種方法檢測(cè)處理氯仿-PEG6000聯(lián)合提取，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，其他兩種方法未見(jiàn)差異。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見(jiàn)地得到的技術(shù)方案的簡(jiǎn)單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。