本發(fā)明涉及一種長效非洲爪蟾胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物及其應用。

背景技術：

糖尿病(Diabetes Mellitus)是一種與遺傳因素有關，又與多種環(huán)境因素相關的慢性全身性疾病，是由于體內(nèi)胰島素分泌的絕對或相對不足而引起的糖、脂肪、蛋白質(zhì)的代謝紊亂，可分為胰島素依賴型糖尿病(1型)和非胰島素依賴型糖尿病(2型)，其中2型患者占糖尿病病例的80％以上。糖尿病是一種全球性的高發(fā)病，據(jù)世界衛(wèi)生組織預測，到2025年全世界糖尿病患者將達到3億。中國近期一項流行病學調(diào)查報告表明，中國糖尿病患病率高達9.7％，遠高于全球平均患病率6.4％，按此患病率估算，我國糖尿病患病人數(shù)已超過9000萬，并且還有約1.5億潛在的糖尿病危險人群。目前對于1型糖尿病的治療，研究方向是開發(fā)給藥方便、有效的胰島素制劑及代用品。而對于2型糖尿病的治療，臨床治療手段主要是使用口服降糖藥物，傳統(tǒng)的磺酰脲類和雙胍類口服降糖藥療效有限，口服糖尿病藥物在治療2型糖尿病癥中最大的不足是無法逆轉糖尿病的病因，即“治標不知本”，對于胰島β細胞的生長、分化、增殖無明顯作用。

胰高血糖素樣肽-1(glucagon like peptide-1,GLP-1)是小腸L細胞分泌的一種多肽類腸促胰島素。自1987年Mojsov發(fā)現(xiàn)GLP-1具有強的促胰島素釋放作用以來，有關的生物學和化學研究不斷深入。GLP-1可通過多種機制控制2型糖尿病患者的血糖，當血糖濃度升高時，通過與GLP-1受體高度特異性地結合，刺激胰島素分泌，抑制胰高血糖素的產(chǎn)生，使餐后血糖降低并維持在恒定水平。在生理條件下，GLP-1刺激胰島素分泌的作用依賴于血糖濃度，不會因持續(xù)分泌而發(fā)生低血糖。除了調(diào)節(jié)血糖，GLP-1最顯著的功能是促進β細胞的再生和修復，增加胰島β細胞數(shù)量。此外GLP-1還具有調(diào)節(jié)神經(jīng)功能、延遲胃排空和降低食欲等作用。然而內(nèi)源性或外源性的GLP-1在體內(nèi)會迅速被二肽基肽酶IV(DPP-IV)和中性內(nèi)切酶(NEP 24.11)降解而失去生物活性，其體內(nèi)半衰期只有兩分鐘左右，故天然GLP-1難以獲得臨床使用。

雖然GLP-1在2型糖尿病治療中的顯著效果已被人們所公認，但是其體內(nèi)過短的半衰期限制了其直接成藥的可能。DPP-IV是使天然GLP-1失活的主要蛋白酶，其作用位點是Ala⁸-Glu⁹之間的肽鍵。天然GLP-1的另一個主要代謝酶是NEP 24.11，約50％的GLP-1在體內(nèi)會被NEP24.11降解，GLP-1肽鏈上有多個NEP 24.11的酶切位點，主要是Thr¹¹-Phe¹²、Asp¹⁵-Val¹⁶、Ser¹⁸-Tyr¹⁹、Glu²⁷-Phe²⁸和Trp³¹-Leu³²位點。因此，僅置換個別氨基酸無法抗NEP 24.11降解，而多個氨基酸置換可能會使化合物的降糖活性下降。目前大部分長效GLP-1受體激動劑的研究都是針對GLP-1的結構進行修飾，這限制了新型GLP-1受體激動劑的研發(fā)。同時，由于天然GLP-1上存在較多NEP 24.11酶切位點，很難通過氨基酸修飾的手段抵抗NEP 24.11的降解。

哺乳動物體內(nèi)的GLP-1作用效果與人GLP-1類似，所以針對哺乳動物GLP-1進行結構修飾，有望發(fā)現(xiàn)新型GLP-1類似物。目前延長多肽、蛋白藥物半衰期的方法主要基于三種原理:1、增大蛋白藥物的分子量，減少腎小球濾過率；2、利用游離型藥物和結合型藥物在血漿內(nèi)形成平衡的特點，緩慢釋放游離型蛋白藥物，使結合型藥物和游離型藥物的平衡向游離型藥物方向移動；3、減少異源蛋白的免疫原性，從而減少其體內(nèi)清除率。

根據(jù)以上提示，我們推測如果能夠在肽鏈上引入大分子基團，增加多肽分子量的同時降低多肽的免疫源性，可以顯著的延長多肽的半衰期。所以，我們設計了大分子PEG化合物，通過馬來酰亞胺與半胱氨酸改構的非洲爪蟾胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物相連接，從而延長類似物的體內(nèi)生物活性作用時間和增加其降糖、減肥活性。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一類非洲爪蟾胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物。其特征在于其結構為以下形式：

His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21

(SEQ.ID NO:1)

其中：

Xaa1:Ala，Leu，Val，Met，Ile，Tyr，Phe，Arg，Asn，Lys，Thr，Asp，His，Trp，Gln，Glu，Ser或Gly；

Xaa2:Cys(S-PEG anolog)，或Thr；

Xaa3:Cys(S-PEG anolog)，或Glu；

Xaa4:Cys(S-PEG anolog)，或Tyr；

Xaa5:Cys(S-PEG anolog)，或Leu；

Xaa6:Cys(S-PEG anolog)，或Glu；

Xaa7:Cys(S-PEG anolog)，或Glu；

Xaa8:Cys(S-PEG anolog)，或Lys；

Xaa9:Cys(S-PEG anolog)，或Ala；

Xaa10:Cys(S-PEG anolog)，或Ala；

Xaa11:Cys(S-PEG anolog)，或Lys；

Xaa12:Cys(S-PEG anolog)，或Glu；

Xaa13:Cys(S-PEG anolog)，或Phe；

Xaa14:Cys(S-PEG anolog)，或Ile；

Xaa15:Cys(S-PEG anolog)，或Glu；

Xaa16:Cys(S-PEG anolog)，或Trp；

Xaa17:Cys(S-PEG anolog)，或Leu；

Xaa18:Cys(S-PEG anolog)，或Ile；

Xaa19:Cys(S-PEG anolog)，或Lys；

Xaa20:Cys(S-PEG anolog)，或Gly；

Xaa21:Cys(S-PEG anolog)-NH₂，或Lys-NH₂；

前提是所述序列不是His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH₂

其中Cys(S-PEG anolog)選自

這里，n選自30～60。

優(yōu)選，S-PEG anolog的分子量為～2000。

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1類似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Cys(S-PEG anolog)-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH₂(SEQ.ID NO:2)

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1類似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Cys(S-PEG anolog)-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH₂(SEQ.ID NO:3)

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1類似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Cys(S-PEG anolog)-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH₂(SEQ.ID NO:4)

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1類似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Cys(S-PEG anolog)-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH₂(SEQ.ID NO:5)

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1類似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Cys(S-PEG anolog)-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH₂(SEQ.ID NO:6)

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1類似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Cys(S-PEG anolog)-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH₂(SEQ.ID NO:7)

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1類似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Cys(S-PEG anolog)-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH₂(SEQ.ID NO:8)

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1類似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Cys(S-PEG anolog)-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH₂(SEQ.ID NO:9)

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1類似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Cys(S-PEG anolog)-Ile-Lys-Gly-Lys-NH₂(SEQ.ID NO:10)

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1類似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Cys(S-PEG anolog)-NH₂(SEQ.ID NO:11)

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包括治療有效量至少一種上述化合物或者其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體或稀釋劑。

本發(fā)明進一步提供了上述化合物或者其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體或稀釋劑在制備用于糖尿病和肥胖的藥物中的運用。

本發(fā)明還提供了上述化合物的制備方法，包括生物表達、液相合成和固相合成制備方法。

一種非洲爪蟾胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物的合成方法，其特征是將mPEG2000-MAL用甲醇/水(v/v＝1:1，pH 7.0)溶解，加入等摩爾的半胱氨酸改構的非洲爪蟾胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物，室溫下攪拌反應，反應結束后，反應液直接進制備液相色譜純化，凍干得純品。

本發(fā)明提供的上述化合物化學性質(zhì)穩(wěn)定，不易被體內(nèi)的二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)和中性內(nèi)切酶降解，化合物的免疫原性降低，并且不易被腎小球濾過，所有的化合物的體內(nèi)降糖作用時間顯著延長，克服了天然GLP-1必須持續(xù)靜脈滴注或持續(xù)皮下注射才能產(chǎn)生療效的缺陷。另外，本發(fā)明提供的上述化合物或化合物作為有效成分制備的藥物組合物用于降低血糖和減肥治療時，既有顯著的長效降糖效果，還有明顯的減肥作用。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1、提出的一種PEG-非洲爪蟾胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)綴合肽，是一類具有全新結構的GLP-1類似物，其生物半衰期較天然GLP-1顯著延長，其降糖活性也明顯優(yōu)于天然GLP-1，此外，其還具有很好的減肥效果，可用于糖尿病和肥胖的治療。

2、本發(fā)明所涉及的非洲爪蟾GLP-1類似物合成過程簡單，成本低，多肽粗品純度大于80％，較常規(guī)固相合成方法大大提高，并且易于實現(xiàn)自動化、大規(guī)?；?，這使其更適合工業(yè)化生產(chǎn)。

因此本發(fā)明提供的非洲爪蟾GLP-1類似物，合成周期短、收率高、粗品純化容易，生產(chǎn)成本低、易于工業(yè)自動化生產(chǎn)。制備得到的非洲爪蟾GLP-1類似物，比天然GLP-1更加穩(wěn)定，降血糖作用時間和降糖活性都優(yōu)于天然GLP-1，并且還具有很好的減肥效果，適合作為治療糖尿病和減肥藥物的活性成分。

附圖說明

上文對本發(fā)明做了一般性描述，下面附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案。其中：

圖1顯示的是Exenatide與非洲爪蟾GLP-1類似物在大鼠血漿中的溫敷降解圖；

圖2顯示的是Exenatide與非洲爪蟾GLP-1類似物在db/db模型小鼠體內(nèi)的腹腔糖耐量實驗血糖圖；

圖3顯示的是Exenatide與非洲爪蟾GLP-1類似物在db/db模型小鼠體內(nèi)的不禁食降糖實驗血糖圖；

圖4顯示的是Exenatide與非洲爪蟾GLP-1類似物在降低體重實驗中小鼠的體重增加量；

具體實施方式

在本說明書全文中采用以下縮寫：

DMF：二甲基甲酰胺；DCM：二氯甲烷；Fmoc：N-9-芴甲氧羰基；DIC：N,N’-二異丙基碳二亞胺；HOBT：1-羥基-苯并三氮唑；TFA：三氟乙酸；EDT：二巰基乙烷；HPLC：高效液相色譜；ESI-MS：電噴霧質(zhì)譜；LC-MS：液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜；Gly：甘氨酸；Ser：絲氨酸；Ala：丙氨酸；Thr：蘇氨酸；Val：纈氨酸；Ile：異亮氨酸；Leu：亮氨酸；Tyr：酪氨酸；Phe：苯丙氨酸；His：組氨酸；Pro：脯氨酸；Asp：天門冬氨酸；Met：蛋氨酸；Glu：谷氨酸；Trp：色氨酸；Lys：賴氨酸；Arg：精氨酸；Asn：天冬酰胺；Gln：谷氨酰胺；Cys：半胱氨酸。

本發(fā)明是通過下列實施例來進行說明的，但這些實施例不做任何限制本發(fā)明的解釋。

實施例1

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Cys(S-PEG anolog)-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH₂(SEQ.ID NO:2)

的固相合成(0.1mmol)

(1)樹脂的溶脹

稱取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin 0.262g(取代量0.382mmol/g)，經(jīng)7mL DCM溶脹2min，抽濾去DCM，再用10mL DCM溶脹30min，最后分別用DCM，DMF 7mL沖洗干凈。

(3)Fmoc保護基的脫除

將溶脹好的樹脂放入反應器中，加入7mL20％哌啶/DMF(V/V)溶液，在反應器中180度往返振搖反應5min，反應溫度25℃，反應結束后濾去溶液；再加入7mL20％哌啶/DMF(V/V)溶液在反應器中180度往返振搖反應15min，反應溫度25℃。反應結束后濾去溶液，用DMF洗滌干凈。得到脫去初始連接的Fmoc保護基的樹脂。

(4)Lys-Rink amide-MBHAResin的合成

將Lys(0.4mmol)，DIC(0.4mmol)，HOBT(0.4mmol)溶于5mL DMF中，再將此溶液加入上面的樹脂中，在反應器中180度往返振搖反應90min，反應溫度25℃。反應結束后濾除反應液，用7mL DMF洗滌樹脂3次。

(5)偶合效率的檢測

用茚三酮法檢測樹脂的偶合效率，顯色反應為陰性即可進入下一個偶合循環(huán)。

茚三酮法：取少量樹脂顆粒用乙醇洗滌，放入透明小瓶中加入5％茚三酮乙醇、KCN吡啶溶液(2ml 0.001M KCN稀釋于98ml吡啶中)、80％苯酚乙醇溶液各2滴，于100℃加熱5分鐘，如果樹脂顯藍色即為陽性。

(6)肽鏈的延長

按照肽鏈的序列，重復上述脫保護和偶合的步驟依次連接上相應的氨基酸直至肽鏈合成完畢，得到連有化合物的樹脂。

(7)樹脂上多肽的裂解

將上述得到的連有化合物的樹脂放入反應瓶中，各加入裂解劑Reagent K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5:5:5:5:2.5，V/V)5mL，再在常溫下攪拌反應2h。反應結束后抽濾，加少量TFA洗滌三次，合并濾液，濾液減壓濃縮。將濃縮濾液加入大量的冰乙醚中析出白色絮狀沉淀，冷凍離心得到目標多肽的粗品，最終收率為92.2％。

(8)Gly₈-Cys₁₇(S-PEG analog)-xGLP(7～36)-NH₂

將mPEG₂₀₀₀-MAL用甲醇/水(v/v＝1:1，pH 7.0)溶解，加入等摩爾的(7)步得到的半胱氨酸改構的非洲爪蟾胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物，室溫下攪拌反應，反應結束后，反應液直接進制備液相色譜純化，色譜條件為：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流動相A：0.1％TFA/水(V/V)，流動相B：甲醇(V/V)；流動相梯度：流動相B 40％～90％，20min；流速為8mL/min檢測波長為214nm，收集的溶液凍干得純品。由于PEG是混合物，分子量為226.1+44n，這里n＝40，化合物的平均理論相對分子質(zhì)量為5488.0。ESI-MS m/z:calu[M+4H]⁴⁺1373.0，[M+5H]⁵⁺1098.6；found[M+4H]⁴⁺1373.1，[M+5H]⁵⁺1098.5。

實施例2～10

根據(jù)實施例1所述的方法，根據(jù)相應的序列合成得到實施例2～10的非洲爪蟾胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物，通過ESI-MS確證各自的分子量。

實施例2

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Cys(S-PEG anolog)-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH₂(SEQ.ID NO:3)

平均理論相對分子質(zhì)量為5460.0。ESI-MS m/z:calu[M+4H]⁴⁺1366.0，[M+5H]⁵⁺1093.0；found[M+4H]⁴⁺1365.7，[M+5H]⁵⁺1092.6。

實施例3

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Cys(S-PEG anolog)-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH₂(SEQ.ID NO:4)

平均理論相對分子質(zhì)量為5425.9。ESI-MS m/z:calu[M+4H]⁴⁺1357.5，[M+5H]⁵⁺1086.2；found[M+4H]⁴⁺1357.6，[M+5H]⁵⁺1086.0。

實施例4

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Cys(S-PEG anolog)-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH₂(SEQ.ID NO:5)

平均理論相對分子質(zhì)量為5476.0。ESI-MS m/z:calu[M+4H]⁴⁺1370.0，[M+5H]⁵⁺1096.2；found[M+4H]⁴⁺1370.5，[M+5H]⁵⁺1096.3。

實施例5

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Cys(S-PEG anolog)-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH₂(SEQ.ID NO:6)

平均理論相對分子質(zhì)量為5461.0。ESI-MS m/z:calu[M+4H]⁴⁺1366.3，[M+5H]⁵⁺1093.2；found[M+4H]⁴⁺1366.5，[M+5H]⁵⁺1093.2。

實施例6

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Cys(S-PEG anolog)-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH₂(SEQ.ID NO:7)

平均理論相對分子質(zhì)量為5518.0。ESI-MS m/z:calu[M+4H]⁴⁺1380.5，[M+5H]⁵⁺1104.6；found[M+4H]⁴⁺1380.1，[M+5H]⁵⁺1104.7。

實施例7

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Cys(S-PEG anolog)-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH₂(SEQ.ID NO:8)

平均理論相對分子質(zhì)量為5518.0。ESI-MS m/z:calu[M+4H]⁴⁺1380.5，[M+5H]⁵⁺1104.6；found[M+4H]⁴⁺1380.3，[M+5H]⁵⁺1104.8。

實施例8

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Cys(S-PEG anolog)-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH₂(SEQ.ID NO:9)

平均理論相對分子質(zhì)量為5476.0。ESI-MS m/z:calu[M+4H]⁴⁺1370.0，[M+5H]⁵⁺1096.2；found[M+4H]⁴⁺1370.3，[M+5H]⁵⁺1096.5。

實施例9

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-I le-Glu-Trp-Cys(S-PEG anolog)-Ile-Lys-Gly-Lys-NH₂(SEQ.ID NO:10)

平均理論相對分子質(zhì)量為5476.0。ESI-MS m/z:calu[M+4H]⁴⁺1370.0，[M+5H]⁵⁺1096.2；found[M+4H]⁴⁺1369.5，[M+5H]⁵⁺1096.3。

實施例10

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-I le-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Cys(S-PEG anolog)-NH₂(SEQ.ID NO:11)

平均理論相對分子質(zhì)量為5461.0。ESI-MS m/z:calu[M+4H]⁴⁺1366.3，[M+5H]⁵⁺1093.2；found[M+4H]⁴⁺1366.7，[M+5H]⁵⁺1093.4。

實施例11

非洲爪蟾GLP-1類似物對大鼠血漿的穩(wěn)定性實驗

大鼠眼球取血，血液裝入含有肝素的離心管中，3000rpm離心10分鐘，取上清血漿作為溫孵血漿，利用LC-MS來檢測化合物的響應信號。100ul的Exenatide(對照)和非洲爪蟾GLP-1類似物與100ul的血漿，渦旋混合后置入37℃水浴中，溫孵24小時，在0，1，2，4，8，12，24，36，48h時間點取10ul，加入20ul乙腈沉淀，14000rpm離心，取上清液進LC-MS，計算各個時間點的峰面積，做出衰減曲線。如圖1所示，Exenatide的血漿半衰期為4.5h左右，而非洲爪蟾GLP-1類似物的血漿半衰期都在24小時以上。

實施例12

非洲爪蟾GLP-1類似物的腹腔糖耐量實驗

6周齡db/db糖尿病模型小鼠，適應性飼養(yǎng)一周，隨機分組，每組六只。小鼠在禁食18h，提前30min腹腔給予陽性對照Exenatide(25nmol/kg)，陰性對照生理鹽水和非洲爪蟾GLP-1類似物(25nmol/kg)，0min腹腔給予葡萄糖(1g/kg)，在0，15，30，60，120min用血糖儀監(jiān)測血糖水平。如圖2所示，非洲爪蟾GLP-1類似物的降糖活性與Exenatide相當，說明PEG化并沒有影響非洲爪蟾GLP-1類似物的血糖控制能力。

實施例13

非洲爪蟾GLP-1類似物的不禁食降糖實驗

七周齡db/db糖尿病模型小鼠，適應性飼養(yǎng)一周，血糖儀測定小鼠的血糖值高于20mmol/L后，隨機分組，每組六只。分為陽性對照組Exenatide(25nmol/kg)，陰性對照組生理鹽水，化合物組SEQ.ID NO:5，SEQ.ID NO:6，SEQ.ID NO:10(25nmol/kg)。小鼠自由飲水、飲食，0h給予化合物，在0，1，2，4，8，12，24，36，48h用血糖儀測定血糖，做出時間-血糖曲線，檢測各組小鼠血糖恢復到8.35mmol/L的時間。如圖3所示，化合物組的血糖穩(wěn)定時間都優(yōu)于陽性對照Exenatide，它們血糖穩(wěn)定時間都超過24h。

實施例14

非洲爪蟾GLP-1類似物的降低體重實驗

6周齡db/db糖尿病模型小鼠，適應性飼養(yǎng)一周，隨機分組，每組6只。小鼠每天2次給予陽性對照Exenatide(25nmol/kg)，陰性對照生理鹽水，給藥組1天1次給予SEQ.ID NO:5，SEQ.ID NO:6(25nmol/kg)，治療周期20天，每兩天檢測一次小鼠的體重。如圖4所示，化合物能SEQ.ID NO:5、SEQ.ID NO:6夠顯著抑制小鼠的體重增長，并且其體重減輕作用優(yōu)于陽性對照Exenatide，表明了非洲爪蟾GLP-1類似物具有良好的治療糖尿病和減肥的藥用前景。

<110> 江蘇師范大學

<120> 長效非洲爪蟾胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）類似物及其應用

<160> 10

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成構建體

<222> (2)..(2)

<223> 第2位的Xaa是Ala，Leu，Val，Met，Ile，Tyr，Phe，Arg，Asn，Lys，Thr，Asp，His，Trp，Gln，Glu，Ser或Gly

<220>

<221> 合成構建體

<222> (11)..(11)

<223> 第11位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Thr

<220>

<221> 合成構建體

<222> (12)..(12)

<223> 第12位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Glu

<220>

<221> 合成構建體

<222> (13)..(13)

<223> 第13位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Tyr

<220>

<221> 合成構建體

<222> (14)..(14)

<223> 第14位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Leu

<220>

<221> 合成構建體

<222> (15)..(15)

<223> 第15位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Glu

<220>

<221> 合成構建體

<222> (16)..(16)

<223> 第16位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Glu

<220>

<221> 合成構建體

<222> (17)..(17)

<223> 第17位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Lys

<220>

<221> 合成構建體

<222> (18)..(18)

<223> 第18位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Ala

<220>

<221> 合成構建體

<222> (19)..(19)

<223> 第19位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Ala

<220>

<221> 合成構建體

<222> (20)..(20)

<223> 第20位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Lys

<220>

<221> 合成構建體

<222> (21)..(21)

<223> 第21位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Glu

<220>

<221> 合成構建體

<222> (22)..(22)

<223> 第22位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Phe

<220>

<221> 合成構建體

<222> (23)..(23)

<223> 第23位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Ile

<220>

<221> 合成構建體

<222> (24)..(24)

<223> 第24位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Glu

<220>

<221> 合成構建體

<222> (25)..(25)

<223> 第25位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Trp

<220>

<221> 合成構建體

<222> (26)..(26)

<223> 第26位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Leu

<220>

<221> 合成構建體

<222> (27)..(27)

<223> 第27位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Ile

<220>

<221> 合成構建體

<222> (28)..(28)

<223> 第28位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Lys

<220>

<221> 合成構建體

<222> (29)..(29)

<223> 第29位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Gly

<220>

<221> 合成構建體

<222> (30)..(30)

<223> 第30位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)-NH2或Lys-NH2

<400> 1

His Xaa Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

20 25 30

<210> 2

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成構建體

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Cys (S-PEG anolog) Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Ile Lys Gly Lys

20 25 30

<210> 3

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成構建體

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Thr Cys (S-PEG anolog) Tyr Leu Glu Glu Lys Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Ile Lys Gly Lys

20 25 30

<210> 4

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成構建體

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Thr Glu Cys (S-PEG anolog) Leu Glu Glu Lys Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Ile Lys Gly Lys

20 25 30

<210> 5

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成構建體

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Thr Glu Tyr Cys (S-PEG anolog) Glu Glu Lys Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Ile Lys Gly Lys

20 25 30

<210> 6

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成構建體

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Thr Glu Tyr Ley Glu Glu Cys (S-PEG anolog) Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Ile Lys Gly Lys

20 25 30

<210> 7

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成構建體

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Thr Glu Tyr Ley Glu Glu Lys Cys (S-PEG anolog) Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Ile Lys Gly Lys

20 25 30

<210> 8

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成構建體

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Thr Glu Tyr Ley Glu Glu Lys Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Cys (S-PEG anolog) Glu Trp Leu Ile Lys Gly Lys

20 25 30

<210> 9

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成構建體

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Thr Glu Tyr Ley Glu Glu Lys Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Cys (S-PEG anolog) Glu Trp Leu Ile Lys Gly Lys

20 25 30

<210> 10

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成構建體

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Thr Glu Tyr Ley Glu Glu Lys Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Ile Glu Trp Cys (S-PEG anolog) Ile Lys Gly Lys

20 25 30

<210> 11

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成構建體

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Thr Glu Tyr Ley Glu Glu Lys Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Ile Lys Gly Cys (S-PEG anolog)

20 25 30