本發(fā)明涉及三種環(huán)狀的合成多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3及其抗菌應(yīng)用，具體地說是三種合成的衍生自LBDv活性多肽經(jīng)結(jié)構(gòu)改造產(chǎn)生的環(huán)狀多肽及其抗菌應(yīng)用。

背景技術(shù)：

對蝦的養(yǎng)殖在我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位，近些年來，對蝦養(yǎng)殖過程中的病害問題已經(jīng)嚴重阻礙了其養(yǎng)殖生產(chǎn)的健康發(fā)展，抗生素的濫用與環(huán)境的惡化使海水養(yǎng)殖動物的病害難以從根本上得到控制。

抗菌肽(蛋白)被認為是魚、蝦、貝等防御細菌、病毒等外源病原感染的重要效應(yīng)分子，在動物的先天免疫過程中發(fā)揮重要作用。目前從甲殼動物中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽種類繁多，抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharide factor，ALF)就是其中一種重要的抗菌肽。1982年，Tanaka等首次從中國鱟(Tachypleus tridentatus)和北美鱟(Limulus polyphemus)的血細胞中分離得到ALF，并發(fā)現(xiàn)其能抑制LPS介導(dǎo)的凝血反應(yīng)的激活。1985年，Morita等發(fā)現(xiàn)ALF還具有很強的抗革蘭氏陰性菌活性。之后，人們相繼在斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)、中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)、日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)、桃紅對蝦(Farfantepenaeus duorarum)等多種甲殼動物中發(fā)現(xiàn)ALF編碼基因的存在，并證實ALF的重組蛋白具有廣泛的抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌生長的活性。另外，研究還發(fā)現(xiàn)對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)預(yù)先與重組表達的ALF蛋白一起孵育后再注射入蝦體中，能抑制注入蝦體中的WSSV的復(fù)制。

與傳統(tǒng)抗生素的作用機理不同，ALF直接中和細菌細胞壁的脂多糖，溶解細菌，因此不易使細菌產(chǎn)生耐藥性。ALF抗病毒的作用機理目前尚不清楚。隨著抗生素的應(yīng)用，許多病原菌對現(xiàn)有抗生素逐步產(chǎn)生耐藥性，而新型抗生素的發(fā)現(xiàn)又極其困難，因此，ALF的研究為開發(fā)新型抗菌藥物奠定了重要基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)，ALF氨基酸序列中的兩個保守半胱氨酸之間形成二硫鍵，兩個半胱氨酸之間的氨基酸共同組成一段陰離子多肽，具有與LPS結(jié)合的能力，這段保守的結(jié)構(gòu)被命名為LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域，被認為是ALF降解革蘭氏陰性菌細胞壁脂多糖的功能域。2011年，Sachin Sharma等研究了根據(jù)鋸緣青蟹(Scylla serrata)ALF的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域合成的具24個氨基酸殘基的多肽在抗菌免疫過程中的作用，發(fā)現(xiàn)合成多肽SsALF24具有結(jié)合LPS的活性并且對大腸桿菌都具有明顯的抑制作用，其最小抑制濃度為16.16～32.32uM(Sharma S，Yedery RD，Patgaonkar MS，Selvaakumar C，Reddy KV.Antibacterial activity of a synthetic peptide that mimics the LPS binding domain of Indian mud crab，Scylla serrata anti-lipopolysaccharidefactor(SsALF)also involved in the modulation of vaginal immune functions through NF-kB signaling.Microbial pathogenesis 2011；50：179-191.)。

前期研究發(fā)現(xiàn)，中國明對蝦中ALF的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有不同的抗菌抗病毒作用，通過中國明對蝦ALF的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域改造獲得的LBDv多肽表現(xiàn)出顯著的抗菌抗病毒作用(Yang H，Li SH，Li FH，Xiang JH.Structureand bioactivity of a modified peptide derived from the LPS-binding domain of an anti-lipopolysaccharide factor(alf)of shrimp.Mar.Drugs 2016，14，96；doi：10.3390/md14050096.)。基于發(fā)表的活性多肽LBDv的氨基酸序列，本發(fā)明對其序列通過氨基酸替換等進一步改造，利用化學合成的方法獲得了改造后的環(huán)狀多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3，它們顯示出顯著的抗菌生物學活性，具有重要的應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供三種經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造的環(huán)狀合成多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3，它們具有明顯的抗菌活性。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

利用化學合成的方法獲得了環(huán)狀的合成多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3，分別具有SEQ ID No.1、2、3所示的氨基酸序列，其序列特征分別為：

SEQ ID No.1：Ac-c(CKLKVKPKIKRFKLKFKGRMWC)-NH₂；

SEQ ID No.2：Ac-c(CKLKVKPKIKRFKLKFKKRMWC)-NH₂；

SEQ ID No.3：Ac-c(CKFKVKPKFKRWKLKFKGRMKC)-NH₂。

所述的環(huán)狀的合成多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3具有二硫鍵結(jié)構(gòu)。其結(jié)構(gòu)特征在于：合成多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3的氨基端第一個半胱氨酸(C)和羧基端第一個半胱氨酸(C)之間具有二硫鍵結(jié)構(gòu)；多肽的氨基端C的氨基被乙?；?Ac-)，羧基端C的羧基被酰胺化(-NH₂)。

所述的環(huán)狀的合成多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3衍生自活性多肽LBDv的結(jié)構(gòu)改造。LBDv的特征在于：具有序列列表中SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。

所述的環(huán)狀的合成多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3具有明顯的抗菌活性。具體為：對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長或增殖均具有很強的抑制作用。

所述環(huán)狀的合成多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3可作為抗菌的活性成份，可用于制備抗菌的藥物或制劑中。

本發(fā)明有如下優(yōu)點

1、本發(fā)明確定了三種衍生自活性多肽LBDv結(jié)構(gòu)改造的抗菌多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3及其結(jié)構(gòu)特征。

2、通過本發(fā)明可開發(fā)有效的細菌類疾病的防治藥物。

附圖說明

圖1合成多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3的空間結(jié)構(gòu)圖；

圖2中，(a)(b)(c)分別為合成多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3的HPLC純度檢測圖；

圖3中，(a)(b)(c)分別為合成多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3的MS質(zhì)譜鑒定圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。

三種化學合成的具有明顯抗菌活性的對蝦環(huán)狀多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3，它們的序列及來源序列信息如下：

(1)SEQIDNo.1、2、3的信息

(a)序列特征

*長度：22氨基酸

*類型：氨基酸

*鏈型：單鏈

*拓撲結(jié)構(gòu)：環(huán)形，兩個半胱氨酸之間形成二硫鍵

*空間結(jié)構(gòu)：兩個半胱氨酸之間通過二硫鍵相連接，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有圖1所示的空間結(jié)構(gòu)：多肽序列形成兩個相連的β折疊結(jié)構(gòu)。

(b)分子類型：蛋白

序列描述：

SEQ ID No.1

Ac-c(CKLKVKPKIKRFKLKFKGRMWC)-NH₂

SEQ ID No.2

Ac-c(CKLKVKPKIKRFKLKFKKRMWC)-NH₂

SEQ ID No.3

Ac-c(CKFKVKPKFKRWKLKFKGRMKC)-NH₂

其中括號內(nèi)的氨基酸為成環(huán)的氨基酸，括號外左側(cè)的小寫c表示括號內(nèi)的氨基酸為形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的氨基酸；Ac-表示氨基酸C的氨基被乙?；?NH₂表示氨基酸C的羧基被酰胺化。

(2)SEQ ID No.4的信息

(a)序列特征

*長度：24氨基酸

*類型：氨基酸

*鏈型：單鏈

*拓撲結(jié)構(gòu)：環(huán)形，兩個半胱氨酸之間形成二硫鍵

(b)分子類型：蛋白

序列描述：SEQ ID No.4

Ac-Yc(CKFRVKPKFKRWRLRFKGRMWC)P-NH₂

所述抗菌多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3的合成、環(huán)化、純化、鑒定及生物活性分析：

通過人工化學合成途徑，利用固相合成方法獲得粗品多肽，經(jīng)固相環(huán)化、質(zhì)譜鑒定和液相色譜純化獲得含有二硫鍵的合成多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3。具體為：

1)多肽合成

采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)合成策略，從C端向N端方向合成。用10mg Rink-Amide-Resin樹脂(AAPPTec，貨號RRZ001)作為載體，依靠載體本身的活性基團與5mg被Fmoc進行氨基保護的第一個氨基酸(Fmoc-Pro-NH₂)的羧基相連(詳細方法參考文獻：Panagiotis Stathopoulos，Serafim Papas，Vassilios Tsikaris.C-terminal N-alkylated peptide amides resulting from the linker decomposition of the Rink amide resin.Anew cleavage mixture prevents their formation.Journal of Peptide Science 2006；12：227-232.)。

用N-甲基毗咯皖酣(NMP)沖洗樹脂除去多余保護氨基酸，向反應(yīng)器(固相合成器)中加入20％哌啶/NMP溶液(體積分數(shù))脫除Fmoc基團，反應(yīng)20min，排空反應(yīng)器，用5mL NMP振蕩沖洗樹脂，重復(fù)3次，脫除第一個氨基酸殘基的Fmoc保護；裸露出的活性氨基基團與下一個被Fmoc進行氨基保護的氨基酸(5mg)的羧基相連，形成第一個肽鍵(Cys-Trp)。此段的以上步驟循環(huán)進行(不同之處在于：只是每次需采用對應(yīng)的被Fmoc進行氨基保護的氨基酸)直至多肽序列Ac-CKLKVKPKIKRFKLKFKGRMWC-NH₂合成完畢，得到約20mg線性多肽。通過相同方法合成多肽序列Ac-CKLKVKPKIKRFKLKFKKRMWC-NH₂和Ac-CKFKVKPKFKRWKLKFKGRMKC-NH₂，分別獲得約20mg線性多肽。

2)多肽環(huán)化

20mg線性多肽偶聯(lián)完最后一個氨基酸后，配置0.1mol/L的I₂溶液(I₂溶于體積比1∶1的甲醇：DMF混合溶液中)，加入10mL至固相合成器中，氮氣吹拂反應(yīng)，約6小時。

3)多肽純化和鑒定

用50mL切肽試劑三氟乙酸：苯甲硫醚：苯酚：乙二硫醇：雙蒸水(體積比82.5∶5∶5∶2.5∶5)將20mg環(huán)化后的多肽從載體樹脂上裂解下來，2小時后，加入4℃預(yù)冷的乙醚100ml使多肽沉淀，離心收集沉淀物，并用乙醚洗滌3遍，真空抽干，得到的多肽粗品經(jīng)反向液相色譜純化，純化后的多肽凍干后進行HPLC純度檢測(圖2)和質(zhì)譜鑒定(圖3)。檢測HPLC色譜柱為250*4.6mm，Kromasil-C18-5μm；流動相A：0.1％TFA/乙腈，流動相B：0.1％TFA/H₂O；線性洗脫梯度：15％A-100％A；流速為1ml/min，檢測波長為220nm；一次進樣量為10μl。HPLC和MS檢測結(jié)果顯示，合成多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3的純度分別為97.76％、97.28％、95.43％，分子量分別為2805.67、2876.80、2854.71，與預(yù)測分子量(分別為2805.67、2876.79、2854.70)基本一致。

4)抑菌試驗

合成多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3分別用50mmol/L pH 7.4的PBS溶解至濃度為640μmol/L的溶液，同時以50mmol/LpH 7.4的PBS為陰性對照。采用最低抑菌濃度(MIC)方法檢測合成多肽對革蘭氏陰性菌包括哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、大腸桿菌(Escherichia coli)、美人魚發(fā)光桿菌(Photobacterium damselae subsp.piscicida)和革蘭氏陽性菌包括表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)等細菌的抑菌活性。即：將待測大腸桿菌、表皮葡萄球菌分別在37℃，200r/min培養(yǎng)條件下于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至1×10⁸cells/mL，哈維氏弧菌、美人魚發(fā)光桿菌分別在30℃，200r/min培養(yǎng)條件下于TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至1×10⁸cells/mL；培養(yǎng)的細菌分別加入到48孔培養(yǎng)板中，用新鮮的LB或TSB培養(yǎng)基將待測菌液稀釋至終濃度1×10⁶cells/mL；向48孔培養(yǎng)板中分別加入梯度稀釋的多肽H溶液至終體積為200μl，多肽終濃度依次為64μmol/L、32μmol/L、16μmol/L、8μmol/L、4μmol/L、2μmol/L和1μmol/L；用PBS作為陰性對照，終濃度58μmol/L的氨芐青霉素(大腸桿菌、表皮葡萄球菌)或88μmol/L的卡那霉素(哈維氏弧菌、美人魚發(fā)光桿菌)分別作為陽性對照；在37℃或28℃條件下培養(yǎng)3h后，分別加入300μl新鮮LB或TSB培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)18h，測定每孔中細菌的OD600吸光值，計算細菌濃度。

結(jié)果表明，1-2μmol/L的合成多肽LBDv-1和LBDv-2都能夠有效抑制大腸桿菌、表皮葡萄球菌和哈維氏弧菌的生長，2-4μmol/L的合成多肽LBDv-1能夠有效抑制美人魚發(fā)光桿菌的生長，4-8μmol/L的合成多肽LBDv-2能夠有效抑制美人魚發(fā)光桿菌的生長，2-4μmol/L的合成多肽LBDv-3能夠有效抑制大腸桿菌、哈維氏弧菌和美人魚發(fā)光桿菌的生長，4-8μmol/L的合成多肽LBDv-3能夠有效抑制表皮葡萄球菌的生長。結(jié)果說明合成多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3具有顯著的抗革蘭氏陽性菌和陰性菌的活性。

合成多肽LBDv-1、LBDv-2、LBDv-3的發(fā)現(xiàn)及生物活性鑒定，在新型抗菌藥物的開發(fā)上具有重要的應(yīng)用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國科學院海洋研究所

<120> 三種改造環(huán)狀多肽及其應(yīng)用和抗菌制劑

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(22)

<223> 1位和22位的C的氨基被乙?；?、羧基被酰胺化

<400> 1

Cys Lys Leu Lys Val Lys Pro Lys Ile Lys Arg Phe Lys Leu Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gly Arg Met Trp Cys

20

<210> 2

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(22)

<223> 1位和22位的C的氨基被乙酰化、羧基被酰胺化

<400> 2

Cys Lys Leu Lys Val Lys Pro Lys Ile Lys Arg Phe Lys Leu Lys Phe

1 5 10 15

Lys Lys Arg Met Trp Cys

20

<210> 3

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(22)

<223> 1位和22位的C的氨基被乙酰化、羧基被酰胺化

<400> 3

Cys Lys Phe Lys Val Lys Pro Lys Phe Lys Arg Trp Lys Leu Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gly Arg Met Lys Cys

20

<210> 4

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(24)

<223> 2位和23為的氨基酸C的氨基被乙酰化、羧基被酰胺化

<400> 4

Tyr Cys Lys Phe Arg Val Lys Pro Lys Phe Lys Arg Trp Arg Leu Arg

1 5 10 15

Phe Lys Gly Arg Met Trp Cys Pro

20