本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及用于治療腫瘤的多肽。

背景技術(shù)：

鈣粘蛋白是一種同親型結(jié)合、Ca依賴的細(xì)胞粘著糖蛋白，對胚胎發(fā)育的細(xì)胞識(shí)別、遷移和組織分化以及成體組織器官構(gòu)成具有重要作用。不同細(xì)胞及其發(fā)育不同的階段其表面的鈣粘蛋白的種類與數(shù)量均有所不同。E-鈣粘著蛋白(E-cadherin)是屬于在表皮組織中的膜整合糖蛋白，E-鈣黏蛋白是哺乳動(dòng)物發(fā)育過程中第一個(gè)表達(dá)的鈣黏蛋白，當(dāng)裸鼠發(fā)育進(jìn)入8細(xì)胞胚胎時(shí)期，E-鈣黏蛋白的表達(dá)將松散聯(lián)系的分裂球細(xì)胞變成緊密黏合的細(xì)胞。若用E-鈣黏蛋白的抗體處理細(xì)胞則會(huì)阻止分裂球細(xì)胞間的緊密黏合。因此，在發(fā)育過程中通過調(diào)控E-鈣黏蛋白，可以決定胚胎細(xì)胞的黏著，影響細(xì)胞的分化，參與器官的形成等。

研究發(fā)現(xiàn)，多種人上皮來源的腫瘤中有E-cadherin功能喪失，如乳腺小葉癌、彌漫型胃癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、肝癌、食管癌、皮膚癌、腎癌和肺癌。越來越多的研究表明，在病理?xiàng)l件下E-cadherin也參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，且與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin的表達(dá)程度與多種惡性腫瘤的腫瘤臨床分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。缺乏E-cadherin的侵襲性腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)染E-cadherin基因后，其侵襲性喪失。許多癌組織中均出現(xiàn)E-cadherin的表達(dá)缺失或基因突變，E-cadherin表達(dá)降低可引起細(xì)胞與細(xì)胞之間粘附破壞，E-cadherin的過表達(dá)可引起細(xì)胞粘附性增加，如用單克隆抗體對E-cadherin受體進(jìn)行封閉，則能導(dǎo)致細(xì)胞的分離和表型改變。E-cadherin能與淋巴細(xì)胞樣增強(qiáng)因子1(LEF1)競爭性結(jié)合β-catenin，使后者不能轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，從而干擾啟動(dòng)細(xì)胞增殖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。既往認(rèn)為，大腸癌發(fā)生時(shí)，先是APC基因突變，然后是E-cadherin。新近發(fā)現(xiàn)大腸癌組織中APC，E-cadherin，β-catenin基因都是突變的，即它們可以同時(shí)發(fā)生突變。AJ的磷酸化使E-cadherin的功能喪失，β-catenin，γ-catenin和P120ctn的磷酸化均會(huì)影響E-cadherin功能。腫瘤細(xì)胞在體外重新培養(yǎng)后，E-cadherin重新表達(dá)，細(xì)胞也失去侵襲性。E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)粘附功能的喪失與腫瘤發(fā)生有關(guān)，如失去接觸抑制功能，可使細(xì)胞無限度地分裂增殖，也使癌細(xì)胞易于脫離原發(fā)位向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。一般來說，在分化較好的癌組織多表達(dá)E-cadherin，侵襲和轉(zhuǎn)移也少；而分化較差的癌組織則相反，傾向于侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，E-cadherin是調(diào)控腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要靶點(diǎn)。

發(fā)明人認(rèn)為如果找到一種靶向性的E-cadherinATF3激活劑，可以在機(jī)體內(nèi)提高E-cadherin表達(dá)的藥物，整體上恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)粘附功能，從而達(dá)到治療癌癥的目的。

盡管如此，并沒有成熟開發(fā)的E-鈣粘蛋白激動(dòng)制劑，尤其是E-鈣粘蛋白蛋白激動(dòng)多肽被開發(fā)，臨床上用于治療腫瘤。

本發(fā)明人設(shè)計(jì)出E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽，用于治療腫瘤患者，為腫瘤患者的治療找到了新的突破口。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明目的是針對現(xiàn)有腫瘤患者治療的藥物特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一種E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽，能有效治療腫瘤。

技術(shù)方案

一種E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽，其序列為SEQ ID NO1。所述多肽的治療腫瘤的應(yīng)用。其用途可通過多種給藥方式治療腫瘤，包括皮下或肌肉注射，靜脈注射或者靜脈滴注等實(shí)現(xiàn)。所述E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽用于促進(jìn)E-鈣粘蛋白的活性。

有益結(jié)果：

本發(fā)明中的E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽序列SEQ ID NO1，可以靶向促進(jìn)E-鈣粘蛋白功能恢復(fù)，達(dá)到治療腫瘤的效果。試驗(yàn)結(jié)果表明：E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽能夠抑制體外的多種腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的活性，抑制腫瘤模型裸鼠的腫瘤生長，提高荷瘤小鼠生存率。達(dá)到治療腫瘤的效果。

具體實(shí)施方式

E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽由上海生工吉爾合成。

實(shí)施例1

E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽對體外培養(yǎng)人黑色素瘤細(xì)胞的生長和存活I(lǐng)C50。

采用MTT比色法。將對數(shù)生長的人黑色素瘤細(xì)胞，以1.0×105加入96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h，實(shí)驗(yàn)孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽(上海生工合成)和陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設(shè)五個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h，分別在0h、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min，在酶標(biāo)儀620nm處測定吸光度A值，按公式人黑色素瘤細(xì)胞生長抑制率＝(1-實(shí)驗(yàn)組吸光值/對照組吸光值)×100％。計(jì)算出實(shí)驗(yàn)藥物的IC50為8.50μM。

實(shí)施例2

E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽對體外培養(yǎng)人肝癌干細(xì)胞的生長和存活I(lǐng)C50。

采用MTT比色法。將對數(shù)生長的人肝癌干細(xì)胞，以1.0×105加入96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h，實(shí)驗(yàn)孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽(上海生工合成)和陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設(shè)五個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h，分別在0h、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min，在酶標(biāo)儀620nm處測定吸光度A值，按公式人肝癌干細(xì)胞生長抑制率＝(1-實(shí)驗(yàn)組吸光值/對照組吸光值)×100％。計(jì)算出實(shí)驗(yàn)藥物的IC50為12.03μM。

實(shí)施例3

E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽乳腺癌細(xì)胞MCF-7遷移的作用。

采用劃痕實(shí)驗(yàn)。先用marker筆在24孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每隔0.5～1cm一道，橫穿過孔。每孔穿過3條線；將成對數(shù)生長的MCF-7細(xì)胞，以1.0×10⁵加入24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h。第二天用10μl槍頭比著直尺，垂直于背后的橫線劃痕，以劃痕和背后橫線的交叉點(diǎn)為固定觀察位點(diǎn)；實(shí)驗(yàn)孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽(上海生工合成)和陽性對照藥物長春新堿；空白組加入相同體積的溶劑，每孔設(shè)五個(gè)復(fù)孔；放入37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0，6，12，24，36小時(shí)，拍照；測量0，6，12，24，36h劃痕寬度。以不同的時(shí)間點(diǎn)，記錄每孔三個(gè)固定位置處劃痕寬度的變化，即為細(xì)胞遷移距離。按照公式計(jì)算遷移率(migration rate，MR)：遷移率(MR)＝(實(shí)驗(yàn)第n小時(shí)的劃痕寬度－實(shí)驗(yàn)第0小時(shí)的劃痕寬度)×100％/實(shí)驗(yàn)第0小時(shí)的劃痕寬度。結(jié)果，隨E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽濃度增加，遷移抑制率逐漸下降，說明E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽能夠抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7遷移，抑制率為85.3％。

實(shí)施例4

E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽對人卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3T侵襲的影響：將10mg/ml Matrigel用無血清的OVCAR-3T培養(yǎng)液以1:2稀釋，涂布于Transwell小室膜上，室溫風(fēng)干。將培養(yǎng)到對數(shù)生長期的OVCAR-3T細(xì)胞用胰蛋白酶消化，收集，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，于顯微鏡下計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整到1×10⁵個(gè)/ml。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組、E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽各劑量(5、10、20mg/ml)組。將細(xì)胞接種到Transwell小室中，每孔100μl，并將各組試驗(yàn)用液加入小室中。24孔板中加入0.6ml含5％胎牛血清和1％VEGF RPMI 1640培養(yǎng)液刺激細(xì)胞侵襲，于5％CO₂，37℃孵育24h。24h后棄去孔中培液，用無水乙醇常溫固定30min，0.1％結(jié)晶紫常溫染色10min，清水漂凈，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，顯微鏡下觀察并隨機(jī)選擇四個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)。按照公式計(jì)算遷移抑制率(migration inhibition,MI)：MI(％)＝(1-N_test/N_control)×100％，其中N_test為測試組的細(xì)胞遷移數(shù)，N_control為空白對照組的細(xì)胞遷移數(shù)。

E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽對OVCAR-3T細(xì)胞侵襲的結(jié)果顯示：E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽能顯著抑制OVCAR-3T細(xì)胞的侵襲，在劑量為20mg/ml時(shí)抑制作用最強(qiáng)，抑制率為61.39％?？梢姡珽-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽可以抑制人卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3T的侵襲。

實(shí)施例5

用腫瘤模型檢測E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽的體內(nèi)抑瘤作用。將處于對數(shù)生長期的OVCAR-3T細(xì)胞用胰蛋白酶于37℃消化后，收集培養(yǎng)液，生理鹽水清洗2～3次。用生理鹽水將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×10⁷個(gè)/mL，接種于C57BL/6裸鼠右前肢腋部皮下，每只0.1mL。1w～2w后裸鼠腫瘤體積長到100～200mm³，剖取其瘤組織在無菌條件下碾磨，制備成1×10⁷個(gè)/mL細(xì)胞懸液，接種于C57BL/6裸鼠右前肢腋部皮下，每只0.1mL。1w～2w后裸鼠腫瘤體積長到70～100mm³后，裸鼠隨機(jī)分成4組，每組10只。(1)空白組；(2)E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽低劑量組；(3)E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽中劑量組；(4)E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽高劑量組。建立卵巢癌腫瘤模型，方案為：空白組加入相同體積的溶劑，實(shí)驗(yàn)組E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽(上海生工吉爾合成)設(shè)3個(gè)劑量：5、10、20mg/Kg，在腫瘤周圍多點(diǎn)注射。連續(xù)給藥21天后，處死裸鼠，手術(shù)剝?nèi)×鰤K稱重。

表1 E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽對OVCAR-3的增殖作用

*P<0.05，**P<0.01與對照組相比。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，與陰性對照組比較，給藥組瘤重都明顯小于陰性組(P<0.01)，分別為1.08±0.49g、0.65±0.28g、0.48±0.18g，陰性組的瘤重為4.47±0.84g。在劑量為20mg/ml時(shí)抑瘤作用最強(qiáng)，抑制率為89.2％?？梢?，E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽對人卵巢腫瘤具有抑瘤作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 羅瑞雪

<120> E-鈣粘蛋白激動(dòng)多肽及其應(yīng)用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Thr Asp Ala Asp Asp Asp Val Asn Thr Tyr Asn Ala Ala Ile Ala

1 5 10 15

Tyr Thr Ile Leu Ser Gln Asp Pro Glu Leu Pro Asp Lys Asn Ser Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Ala

35