本發(fā)明涉及Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The十肽，涉及它的制備方法，涉及它治療缺血性中風(fēng)的活性，抗血栓活性和溶血栓活性。因而本發(fā)明涉及它在制備治療缺血性中風(fēng)，抗血栓和溶血栓藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
冠心病、腦卒中以及脈管炎等是非常常見的心腦血管疾病。隨著人們生活水平的不斷提高，心腦血管疾病的發(fā)病人數(shù)逐年遞增。心腦血管疾病危險因素流行，我國心腦血管疾病的患病率持續(xù)上升。據(jù)資料統(tǒng)計，每5個成年人中就有1個心血管病患者。血栓形成是心腦血管疾病的重要病因。缺血性腦卒中，具有很高的致死率和致殘率。溶栓治療是常見的重要的手段之一?，F(xiàn)有溶栓藥物存在出血、再栓塞、再灌注損傷等問題，因此尋找新型的抗缺血性腦卒中新藥具有重要的應(yīng)用價值。在3年的實驗研究中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The十肽具有這樣的活性。根據(jù)這個發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人提出了本發(fā)明。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一個內(nèi)容是提供Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The十肽。
本發(fā)明的第二個內(nèi)容是提供Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The的制備方法，該方法包括以下步驟：
(1)Boc-Asp(OMe)與Val-OBzl偶聯(lián)得到Boc-Asp(OMe)-Val-OBzl；
(2)Boc-Asp(OMe)-Val-OBzl在4N氯化氫的乙酸乙酯溶液中得到L-Asp(OMe)-Val-OBzl；
(3)Boc-Gly與L-Asp(OMe)-Val-OBzl偶聯(lián)得到Boc-Gly-Asp(OMe)-Val-OBzl；
(4)Boc-Gly-Asp(OMe)-Val-OBzl在4N氯化氫的乙酸乙酯溶液中得到L-Gly-Asp(OMe)-Val-OBzl；
(5)Boc-Arg(Tosh)與L-Gly-Asp(OMe)-Val-OBzl偶聯(lián)得到Boc-Arg(Tosh)-Gly-Asp(OMe)-Val-OBzl；
(6)Boc-Arg(Tosh)-Gly-Asp(OMe)-Val-OBzl在Pd/C和H2的作用下得到Boc-The- Arg(Tosh)-Gly-Asp(OMe)-Val；
(7)Boc-Ala與Lys(Z)-OBzl偶聯(lián)得到Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl；
(8)Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl在4N氯化氫的乙酸乙酯溶液中得到L-Ala-Lys(Z)-OBzl；
(9)Boc-Pro與L-Ala-Lys(Z)-OBzl偶聯(lián)得到Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl；
(10)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl在4N氯化氫的乙酸乙酯溶液中得到L-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl；
(11)Boc-Arg(NO2)與L-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl偶聯(lián)得到L-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl；
(12)Boc-Gly與L-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl偶聯(lián)得到Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl；
(13)Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl在2N NaOH溶液的作用下得到Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)；
(14)Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)與The-OBzl偶聯(lián)得到Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-The-OBzl；
(15)Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-The-OBzl在4N氯化氫的乙酸乙酯溶液中得到L-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-The-OBzl；
(16)Boc-Arg(Tosh)-Gly-Asp(OMe)-Val與L-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-The-OBzl偶聯(lián)得到Boc-Arg(Tosh)-Gly-Asp(OMe)-Val-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-The-OBzl；
(17)Boc-Arg(Tosh)-Gly-Asp(OMe)-Val-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-The-OBzl
在2N NaOH的甲醇溶液中得到Boc-Arg(Tosh)-Gly-Asp-Val-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-The；
(18)Boc-Arg(Tosh)-Gly-Asp-Val-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-The在三氟乙酸/三氟甲磺酸(4∶1)溶液中得到Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The.
其中以上所使用的液相方法是本領(lǐng)域的常規(guī)并公開的技術(shù)。Pd/C是鈀/碳，TFA是三氟乙酸，TFMSA是三氟甲磺酸，HCl/EtOAc是氯化氫的乙酸乙酯溶液。
本發(fā)明的第三個內(nèi)容是評價Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The治療缺血性中風(fēng)的活性。
本發(fā)明的第四個內(nèi)容是評價Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The的抗血栓活性。
本發(fā)明的第五個內(nèi)容是評價Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The的溶血栓 活性。
附圖說明
圖1 Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The的合成路線.i)HOBt，DCC，NMM，THF；ii)4N HCl/EtOAc；iii)Pd/C，H2；iv)2N NaOH，甲醇；v)TFA，TFMS。
具體實施方式
為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。
實施例1 制備Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl(1)
將2.08g(11mmol)Boc-Ala溶于20mL無水四氫呋喃(THF)，冰浴下加入1.35g(10mmol)1-羥基苯并三唑(HOBt)和用無水THF溶解的2.47g(12mmol)二環(huán)己基羰二亞胺(DCC)，攪拌0.5小時，得反應(yīng)液A。30分鐘后，將4.07g(10mmol)HCl·Lys(Z)-OBzl用15mL THF溶解，并用N-甲基嗎啉先調(diào)節(jié)pH至9，加入到反應(yīng)液A中，室溫下攪拌12小時，TLC(展開劑CHCl3∶MeOH＝30∶1)顯示HCl·Lys(Z)-OBzl消失。過濾除去反應(yīng)液中的二環(huán)己基脲(DCU)，反應(yīng)液減壓濃縮至干，殘留物用100mL乙酸乙酯溶解，濾除不溶物。濾液依次用飽和碳酸氫鈉水溶液洗3次，5％硫酸氫鉀水溶液洗3次，飽和氯化鈉水溶液洗3次，分出的乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥12h，過濾，濾液減壓濃縮得到的淡黃色色固體通過硅膠柱柱層析(CH2Cl2∶CH3OH＝90∶1)純化，得到4.0g(74％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：542[M+H]+。
實施例2 制備HCl·Ala-Lys(Z)-OBzl(2)
將2.0g(3.7mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于少量干燥乙酸乙酯中，冰鹽浴下加入20mL 4N氯化氫-乙酸乙酯溶液，冰浴下反應(yīng)4小時，TLC(CHCl3∶MeOH，30∶1)顯示原料點消失，反應(yīng)完全。反應(yīng)液減壓濃縮，殘留物用乙酸乙酯溶解并減壓濃縮。該操作重復(fù)3次，除凈游離的氯化氫，殘留物再用無水乙醚磨洗3次，得到1.6g(90％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：442[M+H]+。
實施例3 制備Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl(3)
采用實施例1的方法從731mg(3.4mmol)Boc-Pro和1.8g(3.3mmol)HCl·Ala-Lys(Z)-OBzl得到1.7g(78％)標(biāo)題化合物，為微黃色油狀物。ESI-MS(m/z)：639[M+H]+。
實施例4 制備HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl(4)
采用實施例2的方法從1.7g(2.5mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl得到1.4g(92％)標(biāo)題化合物，為微黃色油狀物。ESI-MS(m/z)：539[M+H]+。
實施例5 制備Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl(5)
采用實施例1的方法從798mg(2.5mmol)Boc-Arg(NO2)和1.6g(2.4mmol)HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl得到1.5g(71％)標(biāo)題化合物，為白色固體。ESI-MS(m/z)：840[M+H]+。
實施例6 制備HCl·Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl(6)
采用實施例2的方法從1.5g(1.8mmol)Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl得到1.2g(86％)標(biāo)題化合物，為白色粉末。ESI-MS(m/z)：740[M+H]+
實施例7 制備Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl(7)
采用實施例1的方法從403mg(2.3mmol)Boc-Gly和1.4g(2.2mmol)HCl·Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl得到1.4g(68％)標(biāo)題化合物，為白色固體。ESI-MS(m/z)：897[M+H]+。
實施例8 制備Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)(8)
將1.4g(1.5mmol)Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于5mL甲醇中，冰浴下加入2N NaOH水溶液使PH保持在12，反應(yīng)6小時，TLC顯示原料點消失。用飽和硫酸氫鉀調(diào)pH為7，減壓除去甲醇，用飽和硫酸氫鉀調(diào)PH為2，用乙酸乙酯(30mL×3)反復(fù)萃取溶液3遍，合并乙酸乙酯層，用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，得1.0g(79％)標(biāo)題化合物，為白色固體。ESI-MS(m/z)：805[M-H]+。
實施例9 制備Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-The-OBzl(9)
采用實施例1的方法從3.0g(3.7mmol)Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)和1.1g(3.5mmol)HCl·The-OBzl得到2.8g(72.70％)標(biāo)題化合物，為白色固體。ESI-MS(m/z)：1052[M+H]+。
實施例10 制備HCl·Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-The-OBzl(10)
采用實施例2的方法從1.0g(0.95mmol)Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-The-OBzl得到900mg(96％)標(biāo)題化合物，為白色固體。ESI-MS(m/z)：952[M+H]+。
實施例11 制備Boc-Asp(OMe)-Val-OBzl(11)
采用實施例1的方法從2.7g(11mmol)Boc-Asp(OMe)和3.79g(10mmol)Tosh·Val-OBzl得到4.0g(92％)標(biāo)題化合物，為白色固體。ESI-MS(m/z)：437[M+H]+。
實施例12 制備HCl·Asp(OMe)-Val-OBzl(12)
采用實施例2的方法從4.0g(9.2mmol)Boc-Asp(OMe)-Val-OBzl得到3.0g(88％)標(biāo)題化合物，為微黃色油狀物。ESI-MS(m/z)：337[M+H]+。
實施例13 制備Boc-Gly-Asp(OMe)-Val-OBzl(13)
采用實施例1的方法從1.42g(8.1mmol)Boc-Gly和3.0g(8.0mmol)HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl得到2.9g(73％)標(biāo)題化合物，為白色固體。ESI-MS(m/z)：494[M+H]+。
實施例14 制備HCl·Gly-Asp(OMe)-Val-OBzl(14)
采用實施例2的方法從2.9g(5.8mmol)Boc-Gly-Asp(OMe)-Val-OBzl得到2.4g(95％)標(biāo)題化合物，為白色固體。ESI-MS(m/z)：394[M+H]+。
實施例15 制備Boc-Arg(Tosh)-Gly-Asp(OMe)-Val-OBzl(15)
采用實施例1的方法從2.8g(6.4mmol)Boc-Arg(Tosh)和2.7g(6.3mmol)HCl·Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到3.5g(70％)標(biāo)題化合物，為白色固體。ESI-MS(m/z)：803[M+H]+。
實施例16 制備Boc-Arg(Tosh)-Gly-Asp(OMe)-Val(16)
將2.0g(2.5mmol)Boc-Arg(Tosh)-Gly-Asp(OMe)-Val-OBzl溶于10mL甲醇中，再加入100mg Pd/C(5％)，減壓排出反應(yīng)瓶中的空氣，通入氫氣置換，反復(fù)置換5次后，通氫氣室溫攪拌12小時，TLC(展開劑二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)顯示原料點消失，反應(yīng)完全，停止反應(yīng)。濾除Pd/C，濾液減壓濃縮除去溶劑，乙醚磨洗，得到1.6g(90％)標(biāo)題化合物，為白色固體。ESI-MS(m/z)：711[M-H]-。
實施例17制備
Boc-Arg(Tosh)-Gly-Asp(OMe)-Val-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-The-OBzl(17)
采用實施例1的方法從720mg(1.0mmol)Boc-Arg(Tosh)-Gly-Asp(OMe)-Val和900mg(0.91mmol)HCl·Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-The-OBzl得到800mg(53％)標(biāo)題化合物，為白色固體。ESI-MS(m/z)：1647[M+H]+。
實施例18 制備Boc-Arg(Tosh)-Gly-Asp-Val-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-The(18)
200mg(0.12mmol)Boc-Arg(Tosh)-Gly-Asp(OMe)-Val-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-The-OBzl溶于20mL甲醇中，冰浴下加入2N NaOH水溶液使pH保持在12，反應(yīng)6小時，TLC(展開劑二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)顯示原料點消失。用飽和硫酸氫鉀調(diào)pH至7，減壓除去甲醇，得到180mg(97％)標(biāo)題化合物，為白色固體，ESI-MS(m/z)：1543[M+H]+。
實施例19 Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The的合成(19)
將180mg上一步產(chǎn)品Boc-Arg(Tosh)-Gly-Asp-Val-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-The加入茄瓶中，冰鹽浴下加入1mL TFA和0.25mL TFMSA，1小時后TLC(正丁醇∶水∶冰醋酸＝1∶1∶1)顯示原料點消失，停止反應(yīng)，用無水乙醚反復(fù)洗滌，減壓抽干，然后用水溶解，用25％氨水調(diào)pH值至7，用Sephadex G10除鹽，C18柱純化，凍干，得到30mg(22％)標(biāo)題化合物，為白色粉末。Mp：195-199℃；[α]20D＝-109.09(c＝0.11，H2O).IR(KBr)：vR-CH3＝2962，2873，1450，1381；vR-CH2-R＝2930，1257；vCO-NH＝1680，3387；vNH2＝3400，600.ESI-MS(m/e)：1111[M+H]+1H NMR(800MHz，D2O)δ/ppm＝0.8917(d，J＝6.32Hz，3H)，0.8833(d，J＝6.32Hz，3H)，1.0249(t，J＝7.28Hz，3H)，1.3328(d，J＝7.20Hz，3H)，1.3917(m，2H)，1.6042(m，2H)，1.6316(m，2H)，1.6397(m，2H)，1.6884(m，2H)，1.7724(m，2H)，1.8738(m，2H)，1.9007(m，2H)，1.9518(m，2H)，1.9521(dq，J1＝6.80Hz，J2＝5.84Hz，1H)，2.0427(ddt，J＝6.4Hz，J＝13.36Hz，J＝5.12Hz，1H)，2.1486(ddt，J＝6.40Hz，J＝13.36Hz，J＝5.12Hz，1H)，2.2621(m，1H)，2.8394(m，2H)，2.9308(t，J＝7.44Hz，2H)，3.1147(dd，J＝6.24Hz，J＝13.04Hz，2H)，3.1518(m，2H)，3.1807(dd，J＝6.80Hz，J＝6.88Hz，2H)，3.5514(dt，J＝7.52Hz，J＝16.82Hz，1H)，3.7600(dt，J＝7.52Hz，J＝16.82Hz，1H)，3.8745(d，2H)，3.9968(d，2H)，4.0249(dd，J1＝6.32Hz，J2＝11.52Hz，1H)，4.0741(d，J＝6.64Hz，1H)，4.2167(d，J＝7.12Hz，1H)，4.2259(t，J＝7.12Hz，1H)，4.2355(t，J＝7.12Hz，1H)，4.3038(q，J＝4.40Hz，1H)，4.3567(t，J＝6.80Hz，1H)，4.5876(dd，J1＝5.36Hz，J2＝7.28Hz，1H)。
實驗例1 評價Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The(十肽)的抗血栓活性
將SD雄性大鼠(180-220g)，隨機(jī)分組，每組15只，靜悉飼養(yǎng)一天，停止喂養(yǎng)過夜。經(jīng)灌胃給予Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The(十肽)的生理鹽水溶液(劑量為100nmol/kg)或阿司匹林的生理鹽水溶液(劑量為167μmol/kg)或生理鹽水(劑量為10ml/kg)30min之后，大鼠用20％烏來糖的生理鹽水溶液麻醉，之后手術(shù)。分離大鼠的右頸動脈和左頸靜脈，將準(zhǔn)確稱重的絲線置于旁路插管，管的一端插入左靜脈，另一端管插入右側(cè)動脈并注射0.2mL肝素鈉抗凝。使得血流從右側(cè)動脈流經(jīng)旁路插管進(jìn)入左側(cè)靜脈，15min之后取出附有血栓的絲線稱量，計算血液循環(huán)前后絲線的重量，得到的血栓重以表示并代表抗血栓活性，作t檢驗。數(shù)據(jù)列入表1。結(jié)果表明口服100nmol/kg化合物Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The(十肽)能有效地抑制血栓形成。
表1 100nmol/kg Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The(十肽)的抗栓活性
n＝10，阿司匹林劑量167μmol/kg，口服給藥，十肽給藥劑量為100nmol/kg；a)表示與NS相比，p＜0.01，b)與阿司匹林比，p＞0.05。
實驗結(jié)果表明：對濃度為100nmol/kg，十肽的血栓濕重為13.29±3.00mg，與生理鹽水相比有顯著性差異(28.56±4.12mg，p＜0.01)，十肽具有一定的抗栓活性。與陽性對照阿司匹林比較，p＞0.05，無差異，活性相當(dāng)，陽性對照的血栓濕重為12.97±2.48mg。
實驗例2 評價Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The(十肽)的溶血栓活性
SD大鼠(雄性，200±20g)按1200mg/kg的劑量腹腔注射烏拉坦生理鹽水溶液進(jìn)行麻醉。麻醉大鼠后將其仰臥位固定，分離其右頸總動脈，近心端處夾住動脈夾，將近心端及遠(yuǎn)心端分別穿入手術(shù)線，遠(yuǎn)心端的手術(shù)線結(jié)扎，遠(yuǎn)心端插管，將動脈夾松開，取出約1mL動脈血，置于1mL離心管中。往垂直固定的橡膠管(長15mm，內(nèi)徑2.5mm，外徑5.0mm，管底用膠塞密封，para膜封緊)內(nèi)注入0.1ml大鼠動脈血，隨后在管內(nèi)迅速插入一支不銹鋼材質(zhì)的血栓的固定螺栓(血栓固定螺旋用直徑為0.2mm的不銹鋼絲繞成，螺旋部分長10mm，內(nèi)含15個螺圈，螺圈的直徑為1.0mm，托柄與螺旋相連，長約7.0mm，呈問號型)。血液凝固45min后，從玻璃管中小心取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精確稱其重量。
旁路插管由三部分構(gòu)成，中間段為長60.0mm，內(nèi)徑3.5mm的聚乙烯膠管；兩端均為長100.0mm，內(nèi)徑1.0mm，外徑2.0mm的相同的聚乙烯管，該管一端拉成尖管，長約10.0mm(用于插入大鼠頸動脈及靜脈)，外徑為1.0mm，其另一端的外部套一段長為7.0mm，外徑為3.5mm的聚乙烯管(用于插入中段的聚乙烯膠管內(nèi))，3段管的內(nèi)壁均需要硅烷化(1％的硅油乙醚溶液)。將血栓包裹的血栓固定螺旋置于中段聚乙烯膠管內(nèi)，膠管的另外兩端分別與兩根聚乙烯的加粗端相套，保證在循環(huán)的過程中不會漏血。用注射器通過尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液(50IU/kg)，排除氣泡，備用。
分離大鼠的左頸外靜脈，近心端和遠(yuǎn)心端分別穿入手術(shù)線，結(jié)扎遠(yuǎn)心端的血管，在暴露的左頸外靜脈上剪一小口，將上述制備好的旁路管道尖管由小口插入左頸外靜脈開口處，同時遠(yuǎn)離旁路管中段(含精確稱量的血栓固定螺旋)內(nèi)血栓固定螺旋。用注 射器通過另一端的尖管注入準(zhǔn)確量的肝素鈉的生理鹽水溶液(50IU/kg)，此時注射器不要撤離聚乙烯管，用動脈夾夾住注射器與聚乙烯管之間的軟管。在右頸總動脈的近心端用動脈夾止血，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，在離動脈夾不遠(yuǎn)處將右頸總動脈剪一小口，從聚乙烯管的尖部拔出注射器，將聚乙烯管的尖部插入動脈斜口的近心端。旁路管道的兩端均用4號手術(shù)縫線將動靜脈固定。
用頭皮針將生理鹽水(3mL/kg)，尿激酶的生理鹽水溶液(20 000IU/kg)或The-Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys(十肽)的生理鹽水溶液(劑量為100nmol/kg)通過旁路管的中段(含精確稱重的血栓固定螺旋)，刺入遠(yuǎn)離血栓固定螺旋的近靜脈處，打開動脈夾，使血流通過旁路管道從動脈流向靜脈。將注射器中的溶液緩慢注入血液，通過血液循環(huán)，按靜脈-心臟-動脈的順序作用于螺旋的血栓上。血液循環(huán)1h之后，從旁路管道中取出固定血栓的螺旋，精確稱量。計算每只大鼠旁路管道中固定血栓的螺旋血液循環(huán)前后血栓的重量差，以均值表示并代表溶血栓活性，作t檢驗。數(shù)據(jù)列入表2。結(jié)果表明100nmol/kg Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The(十肽)能有效地溶解形成的血栓。
表2 100nmol/kg Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The(十肽)溶栓活性
n＝10，尿激酶劑量為20000IU/kg；化合物給藥劑量為1nmol/kg，a)與生理鹽水相比，p＜0.01，b)與尿激酶比，p＞0.05。
實驗結(jié)果表明：對濃度為100nmol/kg的十肽的血栓減重為34.69±6.36mg，與生理鹽水比較有顯著性差異(27.40±3.20mg，p＜0.01)，與陽性對照尿激酶比較，p＞0.05無差異，活性相當(dāng)，陽性對照尿激酶的血栓減重為40.14±5.43mg。
實驗例3 評價Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The(十肽)對缺血性中風(fēng)大鼠的治療作用
在雄性SD大鼠(體重300±20g)的頸部正中部豎直開約2cm長切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)緣分離出右頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈。用無創(chuàng)動脈夾分別夾閉頸內(nèi)動脈開口處和頸總動脈近心端，結(jié)扎頸外動脈的遠(yuǎn)心端，在頸外動脈剪一小口，松開頸總動脈近心端的動脈夾，取10μL血，之后再用無創(chuàng)動脈夾夾閉頸總動脈的近心端。
將取得的10μL血放置在1mL EP管中常溫放置30分鐘使血液凝固，然后轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱中放置1小時，使血液凝塊結(jié)實。大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量為400mg/kg。取出血液凝塊，加入1mL生理鹽水，用鋼鏟把血液凝塊搗成大小均一的細(xì)小血栓塊，制備細(xì)小血栓的懸液并轉(zhuǎn)移至1mL注射器內(nèi)。松開頸總動脈近心端的動脈夾，將1mL血栓混懸液緩慢從大鼠頸外動脈向近心端經(jīng)過頸內(nèi)動脈注入大鼠的大腦，然后結(jié)扎頸外動脈近心端，打開頸內(nèi)動脈和頸總動脈處得動脈夾，恢復(fù)血流。等待蘇醒。大鼠蘇醒24小時后按Zealonga方法評定神經(jīng)功能缺損程度。0分表示無任何神經(jīng)功能缺失體征、1分表示未損傷側(cè)前肢不能伸展、2分表示向未損傷側(cè)行走、3分表示向未損傷側(cè)轉(zhuǎn)圈成追尾狀行走、4分表示意識障礙無自主行走、5分表示死亡。大鼠經(jīng)尾靜脈每天注射1次Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The(十肽)，劑量為100nmol/kg。連續(xù)注射6天，每天評分。結(jié)果列入表3。數(shù)據(jù)表明Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The(十肽)連續(xù)治療6天除可使2只腦缺血24小時的大鼠神經(jīng)生物學(xué)評分為0分，還可將8只腦缺血24小時神經(jīng)生物學(xué)評分為2分和3分的大鼠改善為1分，因為不像已經(jīng)公開的化合物首次劑量需要5μmol/kg，后5次維持劑量需要2μmol/kg，Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The(十肽)6次劑量均為100nmol/kg。這樣一來，首次劑量和維持劑量分別降低了50倍和20倍。
表3 Arg-Gly-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The(十肽)連續(xù)治療6天對腦缺血24小時大鼠神經(jīng)生物學(xué)評分的影響
n＝10。