本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種納米棒，具體來說是一種自組裝的多肽納米棒及其制備方法。

背景技術(shù)：
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納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺寸(0.1-100nm)或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料。納米材料由于獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特性，使其具有與宏觀物質(zhì)顯著不同的物理性質(zhì)，包括：表面與界面效應(yīng)，小尺寸效應(yīng)，量子尺寸效應(yīng)，以及宏觀量子隧道效應(yīng)。近年來，有機(jī)納米材料因具有獨(dú)特的表面效應(yīng)、量子效應(yīng)及局域場效應(yīng)，表現(xiàn)出新穎的光學(xué)、電學(xué)、催化、藥物、生物等方面的特殊性能，受到越來越多材料研究者的廣泛關(guān)注。因?yàn)橛袡C(jī)分子的多樣性，將納米材料從金屬和半導(dǎo)體擴(kuò)展到有機(jī)化合物，尤其是擴(kuò)展到一般的有機(jī)分子已成為一個(gè)必然的趨勢。發(fā)展高效的有機(jī)納米材料的制備方法至關(guān)重要，微乳液法、激光輻射法、再沉淀法等被用于有機(jī)納米材料的合成。

近年來，國際納米材料，主要研究控制形成過程幾個(gè)方面：一通過改性納米表面物質(zhì)和異性沉積層表面，來改變表面電子狀態(tài)、表面結(jié)構(gòu)和粗糙度；二是納米顆粒在多空隙基體中分布狀況進(jìn)行控制量子尺寸效果和滲流效果；三是通過設(shè)計(jì)納米絲、棒、管等陣列系統(tǒng)獲得必要的特性。

回顧過去的三十年，無機(jī)納米材料獲得了突飛猛進(jìn)，相比之下，生物納米材料的發(fā)展相形見絀。原因是多方面的。首先，生物材料的可操作性比無機(jī)材料更加脆弱。生物材料一般是由蛋白質(zhì)，核酸，或者糖類等分子組成的，這些材料抵抗極端條件的能力較弱。其次，生物材料在合成上更加困難。因此，要得到足夠多的質(zhì)量進(jìn)行性質(zhì)的研究十分困難。第三，生物材料的活性保持往往與特定的條件相關(guān)，而且條件的改變會(huì)引起結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致性質(zhì)發(fā)生改變。

由于以上原因，間接導(dǎo)致了生物納米材料的研究停滯不前。但是，生物納米材料具有完全不同于無機(jī)材料的性質(zhì)。生物納米材料具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，獨(dú)特的電學(xué)和光學(xué)性質(zhì)，以及良好的生物兼容性以及可降解性能，使得生物納米材料在光催化，電學(xué)，生物醫(yī)學(xué)，仿生材料，以及生命科學(xué)等眾多領(lǐng)域大展身手。

在常見的生物納米材料里面，以多肽為代表的材料最受重視。多肽是一類由氨基酸通過酰胺鍵連接的生物分子。由于氨基酸的豐富性，以及多肽修飾的多樣性，使得多肽的組成形式異常豐富。多肽分子中往往包含豐富的氫鍵的供體和受體，以及側(cè)鏈中包含共軛電子體系，同時(shí)，酸和氨基形成的鹽橋，使得多肽分子自發(fā)的組裝成超分子的形式相當(dāng)普遍。這類體系包括兩親性多肽，beta折疊類多肽，D,L交替的多肽，螺旋組成的collagen體系，以及基于二肽FF等。目前，這類多肽自組裝納米材料已經(jīng)在上述領(lǐng)域中取得了廣泛的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種自組裝的多肽納米棒及其制備方法，所述的這種自組裝的多肽納米棒及其制備方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中采用生物學(xué)的方法制備納米棒的方法困難、納米棒的性狀不穩(wěn)定的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了一種自組裝的多肽納米棒，其結(jié)構(gòu)式為

或者

其中，Y₁、Y₂選自任意一種天然氨基酸、或者經(jīng)過修飾的非天然氨基酸的側(cè)鏈；Y₃為Fmoc基團(tuán)、Boc基團(tuán)、2-chloro-z基團(tuán)、Acetyl基團(tuán)、H或者自由的氨基；X為

或者基團(tuán)中的任意一個(gè)。

本發(fā)明還提供了上述的一種自組裝的多肽納米棒的制備方法，包括如下步驟：1)一個(gè)合成-Fmoc保護(hù)的側(cè)鏈2位碳R手性的非天然氨基酸的步驟，所述的

-Fmoc保護(hù)的側(cè)鏈2位碳R手性的非天然氨基酸的結(jié)構(gòu)式如下所示，

其中X為

或者基團(tuán)中的任意一個(gè)。

2)采用固相合成多肽的方法，先將步驟1)的非天然氨基酸與樹脂連接，然后繼續(xù)接上任意的兩個(gè)天然氨基酸，再接上半胱氨酸，并將多肽的氨基端用乙?；忾]；

3)將步驟2)的產(chǎn)物脫除半胱氨酸巰基上的保護(hù)基，再經(jīng)過分子內(nèi)巰基-烯反應(yīng)獲得側(cè)鏈2位碳手性修飾的多肽化合物，該碳手性側(cè)鏈偶聯(lián)氨基酸的位置為i/i+3；

4)將多肽從樹脂上剪切下來，用高效液相色譜進(jìn)行純化；

5)將純化后的多肽樣品在凍干機(jī)上凍干，得到白色粉末狀固體；

6)將白色粉末狀的多肽樣品用超純水分散，置于超聲儀中超聲，得到自組裝的多肽納米棒。

上述制備方法中，步驟2)、步驟3)和步驟4)的反應(yīng)方程式如下所示：

本發(fā)明形成納米棒的基本單元多肽為具有穩(wěn)定螺旋結(jié)構(gòu)的多肽，使用穩(wěn)定的訂書機(jī)多肽作為單體，通過多肽側(cè)鏈精準(zhǔn)的手性中心的調(diào)控，通過固相合成方法合成側(cè)鏈具有碳端非天然氨基酸γ位的四肽，將多肽用超純水分散(2mg/ml)，置于超聲儀中超聲10分鐘，簡單高效的得到了大小均一，結(jié)構(gòu)特殊的多肽納米棒，溶液相的多肽納米棒可以進(jìn)一步通過凍干，空氣中揮發(fā)等方式去除溶劑，得到所需的多肽納米棒固體粉末。

本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進(jìn)步是顯著的。本發(fā)明的納米棒的顯著特征是組成納米棒的基本單元是螺旋結(jié)構(gòu)。該多肽螺旋是通過側(cè)鏈精準(zhǔn)的手性中心的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的納米棒在生物醫(yī)學(xué)上的體外診斷和體內(nèi)治療，以及在傳感器及光學(xué)元件等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明：

圖1為實(shí)施例2得到的多肽在掃描電子顯微鏡下的形貌圖。

圖2為實(shí)施例2得到的多肽納米材料的圓二色譜數(shù)據(jù)。

圖3為實(shí)施例2得到的多肽納米棒的原子力顯微鏡形貌圖。

圖4為實(shí)施例2得到的多肽納米棒的紅外表征數(shù)據(jù)。

圖5為實(shí)施例2得到的多肽納米棒的固體粉末衍射數(shù)據(jù)。

圖6為實(shí)施例2得到的多肽納米棒的共聚焦熒光顯微鏡成像圖。

圖7為實(shí)施例2得到的多肽納米棒的熒光光譜吸收和發(fā)射圖。

圖8為實(shí)施例2得到的多肽納米棒的交流阻抗譜。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。

實(shí)施例1

本發(fā)明提供了一種自組裝的多肽納米棒的制備方法，包括以下步驟：

(ⅰ)合成-Fmoc保護(hù)的側(cè)鏈2位碳R手性的非天然氨基酸；本發(fā)明的非天然氨基酸可以采用常規(guī)的技術(shù)合成((a)Y.N.Belokon,V.I.Tararov,V.I.Maleev,T.F.Savel'eva,M.G.Ryzhov.Tetrahedron:Asymmetry,1998,9,4249-4252.(b)B.Aillard,N.S.Robertson,A.R.Baldwin,S.Robins and A.G.Jamieson,Org.Biomol.Chem.,2014,12,8775-8782.(c)V.A.Soloshonok,X.Tang,V.J.Hruby and L.V.Meervelt,Org.Lett.,2001,3,341-343.(d)W.Qiu,V.A.Soloshonok,C.Cai,X.Tang and V.J.Hruby,Tetrahedron,2000,56,2577-2582.(e)X.Tang,V.A.Soloshonok,V.J.Hruby.Tetrahedron:Asymmetry,2000,11,2917-2925.)，在此不再贅述。

結(jié)構(gòu)式如下所示：

其中X為

或者基團(tuán)中的任意一個(gè)。

(ⅱ)用固相合成多肽的方法，將非天然氨基酸連接到樹脂上，繼續(xù)接上2個(gè)天然氨基酸再接上半胱氨酸并將多肽的氨基端用乙?；忾]；

乙酰化封閉試劑由乙酸酐、N,N-二異丙基乙胺(DIEA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)組成，乙酸酐：N,N-二異丙基乙胺(DIEA)：N-甲基吡咯烷酮(NMP)的質(zhì)量百分之比為4.25％：15.75％：80％；

(ⅲ)將步驟(ⅱ)的產(chǎn)物脫除半胱氨酸上巰基的保護(hù)基，再經(jīng)過分子內(nèi)巰基-烯反應(yīng)獲得側(cè)鏈2位碳手性修飾的多肽化合物，該碳手性側(cè)鏈偶聯(lián)氨基酸的位置為i/i+4；反應(yīng)過程如下所示：

Y₁、Y₂、Y₃包括20種天然氨基酸以及經(jīng)過修飾的非天然氨基酸的側(cè)鏈。

脫除半胱氨酸上巰基保護(hù)基的條件為：3％三氟乙酸(TFA),5％三異丙基硅烷(TIS)和92％DCM(二氯甲烷)。

分子內(nèi)巰基-烯反應(yīng)條件為：對甲氧基苯乙酮(MAP)(1.0eq),2-羥基-4'-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮(MNP)(1.0eq)，以無水二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑在紫外光365nm條件下反應(yīng)3h。

(ⅳ)將多肽從樹脂上剪切下來，用高效液相色譜進(jìn)行純化。

(v)將純化后的多肽樣品在凍干機(jī)上凍干，得到白色粉末狀固體。

(vi)將白色粉末狀的多肽樣品用超純水分散(2mg/ml)，置于超聲儀中超聲10分鐘，得到自組裝的多肽納米棒。

實(shí)施例2

訂書機(jī)環(huán)肽Ac-cyclo(1,4)-CAAS₅(2-phenyl)-NH₂自組裝形成的多肽納米棒的制備方法，

R構(gòu)型Fmoc保護(hù)的非天然氨基酸S₅(2-phenyl)的結(jié)構(gòu)式為：

首先是以Fmoc固相多肽合成法合成NH₂-CAAS₅(2-phenyl)-MBHA樹脂，具體路線如下：

具體操作為：

1.接第一個(gè)氨基酸：稱取1.0g MBHA樹脂于100ml接肽管中，加入20ml N-甲基吡咯烷酮(NMP)鼓氮?dú)馊苊?0min；濾掉溶劑加入體積比為25％嗎啡啉的NMP溶液,鼓氮?dú)?0min，洗滌；連接反應(yīng)：加入Fmoc-S5(2-phenyl)-OH(0.4M in NMP)溶液，HCUT(0.38M in NMP),DIEA按5.0ml/5.0ml/0.71ml混勻加入樹脂中鼓氮?dú)?20min，濾掉反應(yīng)液。洗滌：將接肽管中的溶劑抽干，將樹脂用NMP(10ml*3)洗滌三次，每次一分鐘；

2.接第二個(gè)氨基酸：脫保護(hù)：加入體積比為25％嗎啡啉的NMP溶液,鼓氮?dú)?0min，洗滌；連接反應(yīng)：將配制好的Fmoc-Ala-OH(0.4M in NMP)溶液，6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCUT)(0.38M in NMP),DIEA按7.5ml/7.5ml/1ml混勻加入樹脂中鼓氮?dú)?0min；濾掉反應(yīng)液，洗滌然后進(jìn)行下一步操作。

3.接第三個(gè)氨基酸：操作同2接第三個(gè)Ala。

4.接第四個(gè)氨基酸：接第四個(gè)氨基酸Cys：脫保護(hù)：加入體積比為25％嗎啡啉的NMP溶液,鼓氮?dú)?0min，洗滌；連接反應(yīng)：將配制好的Fmoc-Cys(Trt)-OH(0.4M in NMP)溶液，6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCUT)(0.38M in NMP),DIEA按7.5ml/7.5ml/1ml混勻加入樹脂中鼓氮?dú)?0min；濾掉反應(yīng)液，洗滌然后進(jìn)行下一步操作。

6.N端乙?；忾]：脫保護(hù)：加入體積比為25％嗎啡啉的NMP溶液,鼓氮?dú)?0min，洗滌；N端乙?；忾]：將配好的乙?；忾]試劑(乙酸酐：DIEA：NMP＝4.25％：15.7％：80％)混勻加入樹脂中鼓氮?dú)?20min；濾掉反應(yīng)液，洗滌然后進(jìn)行下一步操作。

7.脫除半胱氨酸上巰基的-Trt保護(hù)基：將配好的脫除-Trt基團(tuán)的試劑(3％TFA,5％TIS和92％DCM)混勻加入樹脂中鼓氮?dú)?0min后，濾掉反應(yīng)液，洗滌，再次加入脫除-Trt基團(tuán)的試劑鼓氮?dú)?0min，濾掉反應(yīng)液，洗滌，然后進(jìn)行下一步操作。

8.濾掉反應(yīng)液，將樹脂依次用NMP(10ml)，二氯甲烷(DCM)(10ml)，甲醇(MeOH)(10ml)交替洗滌，抽干保存或用于下一步反應(yīng)。

通過thiol-ene反應(yīng)(巰基-烯反應(yīng))來完成側(cè)鏈構(gòu)建。

具體操作為：稱取1.0g AcHN-CAAS₅(2-phenyl)-MBHA樹脂于100ml燒瓶中,依次加入70mg MAP,105mg MNP和50ml DMF；用氬氣換氣三次除掉溶劑中的氧；將該燒瓶置于光反應(yīng)器中攪拌下反應(yīng)3h；然后將反應(yīng)樹脂轉(zhuǎn)入接肽管中，濾除反應(yīng)液，用DMF(10ml)，DCM(10ml)，交替洗滌，抽干得Ac-cyclo(1,4)-CAAS₅(2-phenyl)-NH₂樹脂。

使用剪切液(三氟乙酸:三異丙基硅烷:水＝95：2.5：2.5)把多肽從樹脂上剪切下來，濾掉樹脂，用N₂把剪切液吹干，用冷卻的(乙醚：正己烷＝1：1)沉淀，沉淀加水和乙腈溶解后用HPLC純化，460nm*2.5mm C18反相色譜，A液：0.1％三氟乙酸/水,B液：0.1％三氟乙酸/乙腈；溶劑梯度：0-10min 5-15％；10-30min 15-55％；Rt＝26.00min。MS檢測后至于凍干機(jī)上凍干，得到白色粉末狀固體。

將凍干的白色粉末狀的多肽樣品用超純水分散(2mg/ml)，置于超聲儀中超聲10分鐘，得到自組裝的多肽納米棒。

將多肽納米棒吸出，均勻地涂抹在硅片上，放置在通風(fēng)良好的環(huán)境下，待溶劑揮發(fā)完畢，多肽納米管在硅片上形成均勻地薄膜層。

使用掃描電子顯微鏡或者上面提到的技術(shù)手段對多肽納米棒的形貌進(jìn)行表征。

本發(fā)明利用穩(wěn)定的訂書機(jī)多肽制得的新型多肽納米棒具有特定的結(jié)構(gòu)和潛在的生物醫(yī)學(xué)以及納米光電方面的應(yīng)用，經(jīng)掃描電子顯微鏡(SEM),對納米棒結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)的表征。圖1為多肽納米棒在掃面電子顯微鏡下面的形貌，如圖所示，多肽納米棒為立方體長條形結(jié)構(gòu)。通過圓二色譜表征說明多肽具有beta轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)(圖2和圖3)。紅外數(shù)據(jù)表明，形成納米棒是通過單個(gè)多肽之間形成beta折疊而組裝(圖5)。原子力顯微鏡說明多肽納米棒的高度約為200nm(圖4)。熒光顯微鏡以及熒光光譜說明多肽納米管具有量子限制效應(yīng)，并表現(xiàn)出來二維量子材料的特性(圖6和圖7)。最后，交流阻抗譜說明多肽具有良好的導(dǎo)電性(圖8)。

本發(fā)明的納米棒由于結(jié)構(gòu)均一，組成成分特殊，在以下幾個(gè)方面具有重要的應(yīng)用前景：1)該生物納米棒具有較大的比表面積，可以作為金屬納米線的制作模板，制作結(jié)構(gòu)均勻，尺寸較小的金屬納米線。2)多肽納米線是由右手螺旋組成的，因此，該納米線在手性分離方面具有優(yōu)勢。3)多肽納米線內(nèi)部具有金屬螯合位點(diǎn)，可以制作結(jié)構(gòu)精密的金屬有機(jī)結(jié)構(gòu)，在電催化，金屬催化領(lǐng)域具有廣闊的前景。4)多肽納米線具有良好的導(dǎo)電性，可以在柔性器件，電學(xué)，以及生物傳感器等領(lǐng)域大展身手。5)多肽納米棒可以作為藥物輸運(yùn)的載體，將小分子藥物，核酸，蛋白等藥物輸運(yùn)到細(xì)胞中。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對本發(fā)明任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制，應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更動(dòng)、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時(shí)，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對上述實(shí)施例所作的任何等同變化的更動(dòng)、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。