本發(fā)明屬于生物、醫(yī)藥及其制備和應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種20-羥膽固醇-Biotin分子探針及其制備、以及其在鑒定20-羥膽固醇結(jié)合蛋白過程中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
20-羥膽固醇作為一種重要的膽固醇衍生物，可以通過結(jié)合smoothened蛋白激活hedgehog通路。hedgehog通路的異常激活經(jīng)常導(dǎo)致腫瘤等疾病的發(fā)生，而異常沉默又會導(dǎo)致發(fā)育障礙等疾病。研究20-羥膽固醇和smoothened蛋白的結(jié)合，對研究hedgehog通路相關(guān)疾病具有重要意義，并且鑒定新的20-羥膽固醇結(jié)合蛋白也具有重要的科研和臨床價(jià)值。但由于20-羥膽固醇分子的雙極性分子特征，一直沒有好的鑒定20-羥膽固醇結(jié)合蛋白的方法報(bào)道。本發(fā)明開發(fā)的20-羥膽固醇-Biotin探針用來鑒定20-羥膽固醇結(jié)合蛋白是一條可行路線，并且具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種可以模擬正常20-羥膽固醇的活性、可用于鑒定20-羥膽固醇結(jié)合蛋白的20-羥膽固醇分子探針。
本發(fā)明提出的20-羥膽固醇-生物素分子探針(20-羥膽固醇-Biotin分子探針)，其結(jié)構(gòu)式如式(1)所示，
本發(fā)明還提出了所述式(1)20-羥膽固醇-Biotin分子探針的制備方法，以式(a)20-羥膽固醇(20(S)-amine)為原料，在有機(jī)溶劑中，在三乙胺(Et3N)的存在下，與式(b)(+)-生物素-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Biotin-OSu)縮合反應(yīng)后，得到如式(1)所示的20-羥膽固醇-Biotin分子探針；所述制備方法的反應(yīng)過程如路線(I)所示：
路線(I)
具體地，所述方法包括：將式(a)20-羥膽固醇和式(b)Biotin-OSu溶于無水DMF中，加入三乙胺Et3N，進(jìn)行縮合反應(yīng)。
其中，所述有機(jī)溶劑為無水DMF。
其中，三乙胺的作用為縮合劑。
所述式(a)20-羥膽固醇、式(b)Biotin-OSu、三乙胺的摩爾比為1：1.5：2。
優(yōu)選地，所述縮合反應(yīng)在N2保護(hù)下進(jìn)行。
所述縮合反應(yīng)的溫度為為室溫25℃。
所述縮合反應(yīng)優(yōu)選地為，攪拌12小時(shí)。
本發(fā)明制備方法中所涉及的20-羥膽固醇(20(S)-amine)是參考文獻(xiàn)eLife，2013，10,(DOI:10.7554/eLife.01340)所述的方法制備。以上反應(yīng)通常用薄板層析法來跟蹤測定反應(yīng)的完成程度，反應(yīng)完畢后采用的后處理方法包括濃縮、萃取、柱層析分離等，最終產(chǎn)物通過核磁共振譜來驗(yàn)證。
本發(fā)明還提出了由所述制備方法制備得到的20-羥膽固醇-Biotin分子探針，其結(jié)構(gòu)如式(1)所示。
本發(fā)明還提出了所述式(1)膽固醇-Biotin分子探針在鑒定20-羥膽固醇結(jié)合蛋白中的應(yīng)用；
所述式(1)膽固醇-Biotin分子探針在鑒定20-羥膽固醇結(jié)合蛋白中的應(yīng)用，包括以下步驟：
i)包被的Avidin beads
式(1)20-羥膽固醇-Biotin分子探針和Avidin beads孵育，得到式(1)20-羥膽固醇-Biotin分子探針包被的Avidin beads。
ii)結(jié)合蛋白：
蛋白和式(1)20-羥膽固醇-Biotin分子探針包被的Avidin beads結(jié)合，得到式(1)20-羥膽固醇-Biotin分子探針結(jié)合蛋白。
其中，步驟i)中，
所述孵育的溫度為4℃。
所述孵育的時(shí)間為3～6小時(shí)；優(yōu)選地，為4小時(shí)。
其中，步驟ii)中，
所述蛋白和式(1)20-羥膽固醇-Biotin分子探針包被的Avidin beads結(jié)合的條件為4℃，孵育6小時(shí)。
其中，結(jié)合蛋白步驟前還可以包括濃縮蛋白的步驟：
在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染蛋白后，對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后，培養(yǎng)后收集細(xì)胞，對收集的細(xì)胞進(jìn)行裂解，然后采用特異性免疫沉淀法沉淀蛋白，并特異性洗脫蛋白，得到濃縮的Smoothened蛋白。
向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染蛋白的方法為用opti-MEM分別稀釋質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑PEI，兩者用量比為1:3。將兩者混合后，混勻，室溫放置15min，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。由于轉(zhuǎn)染試劑PEI對細(xì)胞有輕微毒性，所以轉(zhuǎn)染后6小時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)液。
所述細(xì)胞包括但不限于真核表達(dá)純化蛋白常用的人腎上皮細(xì)胞系；優(yōu)選地，為293T細(xì)胞。
所述蛋白為任何已知的20-羥膽固醇結(jié)合蛋白，如Smoothened蛋白。
所述培養(yǎng)細(xì)胞的條件為：37℃條件下培養(yǎng)48小時(shí)。
所述裂解細(xì)胞的條件為：用10mM HEPES pH＝7.5，300mM NaCl和1.3％(質(zhì)量/體積)n-dodecyl-β-d-maltopyranoside(DDM,Anatrace)裂解細(xì)胞。
采用Flag beads特異性免疫沉淀Smoothened蛋白，4℃3小時(shí)，再用150μg/ml的3xFlag多肽特異性洗脫Smoothened蛋白，最后用10K的濃縮柱對上述洗脫上清進(jìn)行濃縮，得到濃縮的蛋白。
所述Avidin Beads蛋白是指購自Thermo公司的NeutrAvidinTMAgarose，貨號：29204。
本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明制備式(1)20-羥膽固醇-Biotin分子探針的方法，具有反應(yīng)條件溫和，方法簡單易操作，收率較高(80-90％)的特點(diǎn)。本發(fā)明制備的式(1)20-羥膽固醇分子探針可以模擬正常20-羥膽固醇活性，在體外結(jié)合20-羥膽固醇結(jié)合蛋白，并且可以進(jìn)行特異性富集，可以用來鑒定20-羥膽固醇結(jié)合蛋白。對于開發(fā)一種20-羥膽固醇探針用來鑒定20-羥膽固醇結(jié)合蛋白將是一條可行路線，并且具有重要意義。
附圖說明
圖1為20-羥膽固醇-Biotin分子探針結(jié)合smoothened蛋白的Western Blot圖；Smo-3xFlag代表：C端3xFlag tag融合的Smoothened蛋白。1、2分別代表Western Blot的不同泳道。
具體實(shí)施方式
結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施本發(fā)明的過程、條件、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。
下述實(shí)施例中，化合物結(jié)構(gòu)由核磁共振儀測定；試劑主要由上海國藥化學(xué)試劑公司提供；產(chǎn)品純化主要通過柱色譜，硅膠(200-300)由青島海洋化工廠生產(chǎn)。
實(shí)施例1：化合物式(1)20-羥膽固醇-Biotin分子探針的制備
將20-羥膽固醇(20(S)-amine)(200mg，0.53mmol)和Biotin-OSu(280mg,0.8mmol)溶于無水DMF(10ml)中，加入三乙胺(107mg,1.06mmol)，N2保護(hù)下室溫?cái)嚢?2小時(shí)。TLC檢測反應(yīng)完全后，加水、乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，大量水洗，飽和氯化鈉溶液(30mL×3)洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮。硅膠柱層析(DCM:MeOH＝10:1)得到白色固體(280mg,88％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.72(t,J＝5.0Hz,1H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),5.25(d,J＝5.0Hz,1H),4.58(d,J＝5Hz,1H),4.32–4.28(m,1H),4.15–4.10(m,1H),3.71(s,1H),3.29–3.20(m,1H),3.09(m,1H),2.92-2.99(m,2H),2.83–2.92(m,1H),2.57(d,J＝15.0Hz,1H),2.19–2.06(m,2H),2.06–1.98(m,3H),1.93–1.85(m,1H),1.81–1.71(m,2H),1.70–1.57(m,2H),1.57–1.44(m,7H),1.42–1.15(m,11H),1.11(s,3H),1.07–0.94(m,3H),0.93(s,3H),0.84(m,1H),0.78(s,3H)。
實(shí)施例2：20-羥膽固醇-Biotin分子探針在鑒定20-羥膽固醇結(jié)合蛋白過程中的應(yīng)用。
Smoothened蛋白可以在其N端的半胱氨酸富集區(qū)域結(jié)合20-羥膽固醇分子。首先，在4℃條件下，將實(shí)施例1制備的式(1)20-羥膽固醇-Biotin分子探針和Avidin beads孵育4小時(shí)，將20-羥膽固醇-Biotin分子探針包被在Avidin beads上。再將游離的20-羥膽固醇-Biotin分子探針洗干凈，得到被20-羥膽固醇-Biotin分子探針包被的Avidin beads。在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Smoothened蛋白后，在37℃條件下培養(yǎng)48小時(shí)，收集細(xì)胞，用10mM HEPES pH＝7.5，300mM NaCl和1.3％(質(zhì)量/體積)n-dodecyl-β-d-maltopyranoside(DDM,Anatrace)裂解細(xì)胞，采用Flag beads特異性免疫沉淀Smoothened蛋白，4攝氏度3小時(shí)，再用150μg/ml的3xFlag多肽特異性洗脫Smoothened蛋白，最后用10K的濃縮柱對上述洗脫上清進(jìn)行濃縮。濃縮后的Smoothened蛋白在體外和式(1)20-羥膽固醇-Biotin分子探針包被的Avidin beads結(jié)合，對照組用20-羥膽固醇競爭其結(jié)合。結(jié)果如圖1所示，Smoothened蛋白可以結(jié)合20-羥膽固醇-Biotin分子探針包被的avidin beads，并且20-羥膽固醇可以競爭其結(jié)合。
證明采用上述實(shí)驗(yàn)條件，結(jié)合20-羥膽固醇-Biotin分子探針可以用來鑒定膽固醇結(jié)合蛋白。式(1)20-羥膽固醇-Biotin分子探針即具有正常20-羥膽固醇的結(jié)構(gòu)，又有可以進(jìn)行免疫沉淀的biotin結(jié)構(gòu)，彌補(bǔ)了正常20-羥膽固醇不能用抗體富集和純化的不足。
本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以上實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。