本發(fā)明是一種核苷衍生物及其制備方法，由于香豆素結(jié)構(gòu)的引入其顯示出很強(qiáng)的熒光特性，可作為熒光核苷探針，在生物化學(xué)及醫(yī)藥等領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)背景

核苷是生物系統(tǒng)的基本構(gòu)件，具有廣泛的生物活性。核苷類化合物在抗腫瘤、抗病毒和抗艾滋病藥物中占有重要的地位，是目前公認(rèn)有抗病毒潛能的一類藥物，例如5-氟尿嘧啶及6-巰基嘌呤等。

近年來熒光識別作為一種重要的手段在生物化學(xué)和生物學(xué)上有著越來越廣泛的應(yīng)用，熒光探針是其中重要的一種。天然的核苷由于其固有的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其熒光較弱很難直接作為探針來使用，熒光核苷類似物由于其特殊的結(jié)構(gòu)使得它在細(xì)胞中比其它結(jié)構(gòu)的熒光分子具有更好的生物兼容性。因此，越來越多的化學(xué)工作者開始對天然核苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以增加其熒光強(qiáng)度。國外對熒光核苷的研究比較活躍，已開發(fā)了一系列衍生物，應(yīng)用廣泛，而國內(nèi)發(fā)展則相對緩慢。核苷衍生物的合成存在反應(yīng)步驟長，條件苛刻，后處理繁瑣且生成物的產(chǎn)率低等缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明通過選用7-二乙胺基-4-甲基香豆素與5-碘尿苷經(jīng)Sonogashira偶聯(lián)反應(yīng)得到相應(yīng)的核苷衍生物。本發(fā)明與先合成修飾堿基再進(jìn)行糖苷化等合成方法相比，具有反應(yīng)條件易控制、產(chǎn)率高和后處理簡便等特點(diǎn)。另外，本發(fā)明在香豆素炔基化這一步，將原來兩步反應(yīng)改為一鍋法，進(jìn)一步提高了產(chǎn)率。

具體方法是第一步先將7-二乙胺基-4-甲基香豆素溴化；第二步將香豆素溴化物與三甲基硅乙炔等進(jìn)行炔基化反應(yīng)；第三步則是將香豆素炔基化產(chǎn)物與5-碘尿苷在鈀催化劑下，再進(jìn)行一次Sonogashira偶聯(lián)反應(yīng)，得到核苷衍生物。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種核苷衍生物的制備方法，包括以下步驟：

1)以7-二乙胺基-4-甲基香豆素與N-溴代丁二酰亞胺為原料，在30～40℃條件下反應(yīng)得3-溴-7-二乙胺基-4-甲基香豆素。

2)以香豆素溴化物與三甲基硅乙炔為原料，在鈀催化劑、碘化亞銅、三乙胺作用下，65～70℃下攪拌一段時間后，再與用碳酸鉀反應(yīng)脫去三甲基甲硅烷基，得到香豆素炔基化粗產(chǎn)品，直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。

3)將上述步驟得到的產(chǎn)物和5-碘尿苷加入含有N,N-二甲基甲酰胺的圓底燒瓶中，再分別加入一定量的鈀催化劑和碘化亞銅，65～70℃下反應(yīng)一段時間，過濾、洗滌、萃取和柱層析色譜得到最終產(chǎn)物。

上述方法中，7-二乙胺基-4-甲基香豆素與N-溴代丁二酰亞胺的反應(yīng)時間為5～8小時，得到黃色固體。

上述方法中，3-溴7-二乙胺基-4-甲基香豆素炔基化的反應(yīng)時間為7～10小時，得到淺褐色固體。

上述方法中，香豆素炔基化產(chǎn)物和5-碘尿苷反應(yīng)時間為2～5小時，過濾、洗滌、萃取和柱層析色譜得淡黃色固體。

本發(fā)明是一種新型的核苷衍生物的制備方法，該產(chǎn)物具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，可作為熒光探針，在生物化學(xué)和醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

附圖說明

圖1 3-溴-7-二乙胺基-4-甲基香豆素的制備

圖2香豆素炔化物的制備

圖3核苷衍生物的制備

具體實(shí)施方式

以下為本發(fā)明的具體實(shí)施方式。

下式為本發(fā)明的合成路線，如下式所示，合成分為三步進(jìn)行：

第一步，制備3-溴-7-二乙胺基-4-甲基香豆素。以乙腈為溶劑，7-二乙胺基-4-甲基香豆素和N-溴代丁二酰亞胺在30～40℃下反應(yīng)5～8小時。其反應(yīng)表達(dá)式為：

第二步，制備香豆素炔化物。將第一步得到的產(chǎn)物和三甲基硅乙炔加入含有N,N-二甲基甲酰胺的圓底燒瓶中，加入一定量的鈀催化劑、碘化亞銅和三乙胺，在65～70℃下反應(yīng)4～6小時，降至室溫后加入碳酸鉀，繼續(xù)反應(yīng)3～5小時。其反應(yīng)表達(dá)式為：

第三步，制備核苷衍生物，將香豆素炔化物和5-碘尿苷溶于N,N-二甲基甲酰胺，再加入一定量鈀催化劑、碘化亞銅和三乙胺，在65～70℃下反應(yīng)2～5小時，過濾、洗滌、萃取和柱層析色譜得到最終產(chǎn)物。其反應(yīng)表達(dá)式為：

實(shí)例一：3-溴-7-二乙胺基-4-甲基香豆素的合成

在圓底燒瓶中分別加入463mg(2mmol)7-二乙胺基-4-甲基香豆素，0.44g(2.5mmol)N-溴代丁二酰亞胺和10ml乙腈，然后攪拌升溫至30～40℃反應(yīng)7小時。冷卻至室溫，加入5ml去離子水析出雜質(zhì)，再用乙酸乙酯萃取(3×5ml)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得黃色固體0.5g，產(chǎn)率為80％。

實(shí)例二：香豆素炔化物的合成

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在反應(yīng)管中分別加入上步反應(yīng)的產(chǎn)物3-溴-7-二乙胺基-4-甲基香豆素粗產(chǎn)品、10ml N,N-二甲基甲酰胺、0.26ml(1.9mmol)三甲基硅乙炔、0.06g(0.07mmol)雙三苯基磷二氯化鈀、0.06g(0.32mmol)碘化亞銅和0.9ml(6.4mmol)三乙胺，升溫至65～70℃反應(yīng)4小時。溫度降至室溫后加入1g(4.5mmol)碳酸鉀，常溫攪拌3小時，溶液呈淺褐色。過濾、旋蒸后，加入10ml去離子水，用乙酸乙酯萃取(3×5ml)，合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，得淺褐色固體0.34g，產(chǎn)率為83％。

實(shí)例三：核苷衍生物的合成

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向反應(yīng)管中分別加入上步反應(yīng)得到的香豆素炔化物、0.24g(0.66mmol)5-碘尿苷、0.08g(0.08mmol)雙三苯基磷二氯化鈀、0.05g(0.27mmol)碘化亞銅、0.7ml(5.3mmol)三乙胺以及10ml N,N-二甲基甲酰胺，在65～70℃反應(yīng)4小時。過濾除去固體，濾液濃縮后加入10ml二氯甲烷稀釋，用飽和食鹽水洗三遍，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥過夜。過濾、旋蒸后，用甲醇/二氯甲烷混合溶劑過柱得核苷衍生物0.50g(淡黃色固體)，產(chǎn)率為76％。