本發(fā)明是一種擴(kuò)展型熒光核苷類似物及其制備方法，兩個噻吩通過炔鍵與嘧啶環(huán)形成共軛結(jié)構(gòu)，使天然核苷顯示出良好的熒光特性，可作為熒光核苷探針，在生物化學(xué)及醫(yī)藥等領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)背景

核酸是生命體的重要遺傳物質(zhì)，在生長、遺傳、變異等一系列重大生命現(xiàn)象中，扮演著至關(guān)重要的角色，其研究早已成為分子生物學(xué)、生物化學(xué)等各個研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)。核苷類化合物在抗腫瘤、抗病毒和抗艾滋病藥物中占有重要的地位，是目前公認(rèn)有抗病毒潛能的一類藥物。

目前，核酸的研究工作，主要依賴于熒光光譜、電泳、核磁共振和X-射線單晶衍射等技術(shù)手段。其中，熒光光譜以其操作簡單、靈敏度高、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，受到眾多研究者的青睞，已廣泛用于核酸的構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程及其構(gòu)象動力學(xué)的研究中。

常見熒光探針結(jié)構(gòu)較大，且對生物活性有一定影響，在生物檢測等領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制。而熒光核苷類似物由于其特殊的結(jié)構(gòu)，使得它在細(xì)胞中比其它熒光探針具有更好的生物兼容性。因此，越來越多的化學(xué)工作者開始對天然核苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以增加其熒光強(qiáng)度。國外對熒光核苷的研究比較活躍，已開發(fā)了一系列衍生物，在單核苷的多態(tài)性(SNP)檢測及核酸結(jié)構(gòu)和功能的研究等方面應(yīng)用廣泛，而國內(nèi)發(fā)展則相對緩慢。核苷類似物的合成存在反應(yīng)步驟長，條件苛刻，后處理繁瑣且生成物的產(chǎn)率低等缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明通過選用2,2'-二噻吩與5-碘尿苷經(jīng)Sonogashira偶聯(lián)反應(yīng)得到具有熒光特性的核苷類似物。本發(fā)明與先合成修飾堿基再進(jìn)行糖苷化合成方法相比，具有反應(yīng)條件溫和、易控制和產(chǎn)率高等特點(diǎn)。

具體方法是第一步先將2,2'-二噻吩碘化；第二步將5-碘-2,2'-二噻吩與三甲基硅乙炔等進(jìn)行炔基化反應(yīng)；第三步則是將2,2'-二噻吩炔基化產(chǎn)物與5-碘尿苷在鈀催化劑下，進(jìn)行Sonogashira偶聯(lián)反應(yīng)，得到熒光核苷類似物。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種新型熒光核苷類似物及其制備方法，包括以下步驟：

1)以2,2'-二噻吩與N-碘代丁二酰亞胺為原料，在20～50℃條件下反應(yīng)得5-碘-2,2'-二噻吩。

2)5-碘-2,2'-二噻吩與三甲基硅乙炔為原料，在鈀催化劑、碘化亞銅、三乙胺作用下，50～70℃下攪拌一段時間后，用碳酸鉀反應(yīng)脫去三甲基甲硅烷基，得到2,2'-二噻吩炔化物，無需提純，直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。

3)將上述步驟得到的產(chǎn)物和5-碘尿苷加入含有N,N-二甲基甲酰胺的圓底燒瓶中，再分別加入一定量的鈀催化劑和碘化亞銅，65～70℃下反應(yīng)一段時間，過濾、洗滌、萃取和柱層析色譜得到最終產(chǎn)物。

上述方法中，2,2'-二噻吩與N-碘代丁二酰亞胺的反應(yīng)時間為5～8小時，得到白色固體。

上述方法中，2,2'-二噻吩炔基化的反應(yīng)時間為7～10小時，得到淺褐色固體。

上述方法中，2,2'-二噻吩炔基化產(chǎn)物和5-碘尿苷反應(yīng)時間為2～5小時，過濾、洗滌、萃取和柱層析色譜得淡黃色固體。

本發(fā)明是一種新型的熒光核苷類似物的制備方法，該產(chǎn)物具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，可作為熒光探針，在生物化學(xué)和醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

附圖說明

圖1 5-碘-2,2'-二噻吩的制備

圖2 2,2'-二噻吩炔化物的制備

圖3熒光核苷類似物的制備

具體實(shí)施方式

以下為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，具體合成路線分為三步。

第一步，制備5-碘-2,2'-二噻吩。以氯仿為溶劑，2,2'-二噻吩和N-碘代丁二酰亞胺在20～50℃下反應(yīng)5～8小時，其反應(yīng)表達(dá)式見圖1。

第二步，制備2,2'-二噻吩炔化物。將第一步得到的產(chǎn)物和三甲基硅乙炔加入含有N,N-二甲基甲酰胺的圓底燒瓶中，加入一定量的鈀催化劑、碘化亞銅和三乙胺，在50～70℃下反應(yīng)4～6小時，降至室溫后加入碳酸鉀，繼續(xù)反應(yīng)3～5小時，其反應(yīng)表達(dá)式見圖2。

第三步，制備核苷類似物，將2,2'-二噻吩炔化物和5-碘尿苷溶于N,N-二甲基甲酰胺，再加入一定量鈀催化劑、碘化亞銅和三乙胺，在65～70℃下反應(yīng)2～5小時，過濾、洗滌、萃取和柱層析色譜得到最終產(chǎn)物，其反應(yīng)表達(dá)式見圖3。

實(shí)例一：5-碘-2,2'-二噻吩的合成

在圓底燒瓶中分別加入0.499g(3mmol)2,2'-二噻吩，0.810g(3.6mmol)N-碘代丁二酰亞胺和30ml氯仿，然后攪拌升溫至20～50℃反應(yīng)7小時。冷卻至室溫，加入5ml去離子水析出雜質(zhì)，再用乙酸乙酯萃取(3×5ml)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得白色固體0.75g，產(chǎn)率為86％。

實(shí)例二：2,2'-二噻吩炔化物的合成

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在反應(yīng)管中分別加入上步反應(yīng)的產(chǎn)物5-碘-2,2'-二噻吩粗產(chǎn)品、25ml N,N-二甲基甲酰胺、0.46ml(3.6mmol)三甲基硅乙炔、0.08g(0.12mmol)雙三苯基磷二氯化鈀、0.11g(0.57mmol)碘化亞銅和1,7ml(12mmol)三乙胺，升溫至50～70℃反應(yīng)4小時。溫度降至室溫后加入1g(4.5mmol)碳酸鉀，常溫?cái)嚢?小時，溶液呈淺褐色。過濾、旋蒸后，加入10ml去離子水，用乙酸乙酯萃取(3×5ml)，合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，得淺褐色固體0.39g，產(chǎn)率為83％。

實(shí)例三：熒光核苷類似物的合成

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向反應(yīng)管中分別加入上步反應(yīng)得到的2,2'-二噻吩炔化物、0.37g(1mmol)5-碘尿苷、0.06g(0.05mmol)雙三苯基磷二氯化鈀、0.01g(0.07mmol)碘化亞銅、0.7ml(5.3mmol)三乙胺以及20ml N,N-二甲基甲酰胺，在65～70℃反應(yīng)4小時。過濾除去固體，濾液濃縮后加入10ml二氯甲烷稀釋，用飽和食鹽水洗三遍，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥過夜。過濾、旋蒸后，用甲醇/二氯甲烷混合溶劑過柱得核苷衍生物0.60g(淡黃色固體)，產(chǎn)率為70％。