本發(fā)明是一種喹唑啉類核苷衍生物的制備方法，喹唑啉類核苷衍生物可插入細(xì)胞中作為熒光探針，在生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域都有著很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)背景

熒光光譜學(xué)以其廣泛的應(yīng)用性、多功能性和高靈敏性等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于核酸、核酸-蛋白質(zhì)配合物和核酸-小分子復(fù)合物構(gòu)象轉(zhuǎn)化的途徑及其動(dòng)力學(xué)的研究。熒光核苷衍生物，其光物理性質(zhì)能夠隨著微環(huán)境條件的變化而發(fā)生規(guī)律性的改變，因而被廣泛應(yīng)用于核酸的結(jié)構(gòu)與功能的研究中。

同構(gòu)核苷酸衍生物的主要特征之一就是對(duì)所插入的寡聚核酸的低擾動(dòng)性，基于喹唑啉熒光核苷衍生物有小芳香生色團(tuán)卻具有較高的發(fā)射能量，在研究和探索核酸結(jié)構(gòu)，動(dòng)力學(xué)和識(shí)別中有廣泛的應(yīng)用。這些核苷衍生物具有跨越155nm的熒光發(fā)射波長(zhǎng)從335到490納米，每個(gè)核苷在其微環(huán)境的變化中有獨(dú)具特色的響應(yīng)。這些不同的特性被用于多種生物測(cè)定法，如熒光共振能量轉(zhuǎn)移研究。喹唑啉類核苷衍生物可充當(dāng)供體熒光團(tuán)用于RNA-蛋白質(zhì)相互作用的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

以鄰氨基苯甲酸衍生物為原料，通過環(huán)化反應(yīng)，經(jīng)三步反應(yīng)得到具有不同取代基的目標(biāo)產(chǎn)物，合成工藝簡(jiǎn)單條件溫和，可為后續(xù)的新型熒光核苷類似物的合成研究提供借鑒。

具體方法是第一步先將冰醋酸和2-氨基-6-取代苯甲酸反應(yīng)生成5-取代-2,4-喹唑啉二酮；第二步將5-取代-2,4-喹唑啉二酮和1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-1-β-D-呋喃核糖反應(yīng)，得到喹唑啉核苷衍生物粗產(chǎn)物；第三步是第二步得到的產(chǎn)物與甲醇的氨溶液反應(yīng)，得到喹唑啉類核苷衍生物。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

喹唑啉類核苷衍生物的制備方法，包括以下步驟：

1)以冰醋酸和2-氨基-6-取代苯甲酸為原料，將氰酸鉀溶于水中，滴加到上述混合液中，回流反應(yīng)。濃鹽酸調(diào)PH，過濾，水洗，真空干燥，得到5-取代-2,4-喹唑啉二酮，反應(yīng)時(shí)間為3-5小時(shí)，溫度80-90℃，產(chǎn)率79-89％。

2)將上述步驟得到的產(chǎn)物加入燒瓶?jī)?nèi)，以乙腈為溶劑，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，逐滴加入NO-BSA，再加入1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-1-β-D-呋喃核糖和TMSOTf，升溫至50-60℃，反應(yīng)20-24h，。旋蒸除去溶劑，飽和NaHCO₃和飽和NaCl水溶液洗滌。經(jīng)柱層析色譜得到喹唑啉核苷衍生物粗產(chǎn)品。

3)將上述步驟得到的產(chǎn)物和甲醇加入到的高壓反應(yīng)管中，通氨氣，溶解。60-80℃下反應(yīng)20-24h。旋干溶劑，柱層析分離提純產(chǎn)物。

上述方法中，冰醋酸和2-氨基-6-取代苯甲酸反應(yīng)時(shí)間為3-5小時(shí)，得到白(黃)色固體。

上述方法中，5-取代-2,4-喹唑啉二酮和1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-1-β-D-呋喃核糖的反應(yīng)時(shí)間為20-24小時(shí)，得到固體。

上述方法中，第二步的粗產(chǎn)品在甲醇的氨氣溶液下反應(yīng)時(shí)間為20-24h，得到固體。

本發(fā)明是一種新型的核苷衍生物的制備方法，此類產(chǎn)物具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，可作為熒光探針，在生物化學(xué)和醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

附圖說明

圖1 5-取代-2,4-喹唑啉二酮的制備

圖2 5-取代-2,4-喹唑啉二酮尿苷粗產(chǎn)品的制備

圖3 5-取代-2,4-喹唑啉二酮尿苷的制備

具體實(shí)施方式

以下為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，具體合成路線分為三步。

第一步，制備5-取代-2,4-喹唑啉二酮。以冰醋酸和2-氨基-6-取代苯甲酸為原料，將氰酸鉀溶于水中，反應(yīng)時(shí)間為3-5小時(shí)，溫度80-90℃，其反應(yīng)式見圖1。

第二步，制備喹唑啉類核苷衍生物粗產(chǎn)品。將第一步反應(yīng)制得的5-取代-2,4-喹唑啉二酮和1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-1-β-D-呋喃核糖加入圓底燒瓶中，再加入NO-BSA，溶劑為乙腈，在50-60℃反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為20-24小時(shí)，其反應(yīng)式見圖2。

第三步，第二步制備的喹唑啉類核苷衍生物粗產(chǎn)品在甲醇加入到高壓反應(yīng)管中，通氨氣，溶解后繼續(xù)通氨氣一個(gè)小時(shí)。封閉反應(yīng)管，60-80℃下反應(yīng)20-24h。旋干溶劑，柱層析分離提純產(chǎn)物，其反應(yīng)式見圖3。

實(shí)例一：5-甲基-2,4-喹唑啉二酮的制備

燒瓶中，加入10mmol 2-氨基-6-甲基苯甲酸，60mL水和1.2mL冰醋酸，混合物變?yōu)閼腋∫?。?.03g(25mmol)氰酸鉀溶于7mL水中，滴加到上述混合液中，80-90℃下回流反應(yīng)1-2h。冷至室溫，1.6g(40mmol)氫氧化鈉加入到懸浮液中，80-90℃下反應(yīng)3-5h。沉淀生成，過濾，水洗，干燥，得到淡白色固體，產(chǎn)率為89％。

實(shí)例二：5-氯-2,4-喹唑啉二酮的制備

燒瓶中，加入12mmol 2-氨基-6-氯苯甲酸，65mL水和1.5mL冰醋酸，混合物變?yōu)閼腋∫?。?.36g(28mmol)氰酸鉀溶于10mL水中，滴加到上述混合液中，80-90℃下回流反應(yīng)1-2h。冷至室溫，2.0g(50mmol)氫氧化鈉加入到懸浮液中，80-90℃下反應(yīng)3-5h。沉淀生成，過濾，水洗，干燥，得到黃色固體，產(chǎn)率為79％。

實(shí)例三：5-甲基-2,4-喹唑啉二酮尿苷粗產(chǎn)品的制備

0.5mmol 5-甲基-2,4-喹唑啉二酮加入到20mL無水乙腈中，N₂保護(hù)下，逐滴加入0.80mL(3.2mmol)NO-BSA,于25℃下反應(yīng)2h。0.27g(0.5mmol)1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-1-β-D-呋喃核糖和0.14mL(0.8mmol)TMSOTf同時(shí)加入到上述溶液中，升溫至50-60℃，反應(yīng)20-24h。旋蒸除去溶劑，飽和NaHCO₃和飽和NaCl水溶液洗滌次。硅膠旋干，柱層析分離法提純產(chǎn)物。產(chǎn)物為白色固體。

實(shí)例四：5-甲基-2,4-喹唑啉二酮尿苷的制備

取實(shí)例三產(chǎn)物和40mL甲醇加入到高壓反應(yīng)管中，通氨氣，溶解后繼續(xù)通1h。封閉反應(yīng)管，60-80℃下反應(yīng)20-24h。旋干溶劑，柱層析分離提純產(chǎn)物。目標(biāo)產(chǎn)物為白色固體0.125g，實(shí)例三和實(shí)例四兩步產(chǎn)率為83％。

實(shí)例五：5-氯-2,4-喹唑啉二酮粗產(chǎn)品的制備

0.5mmol 5-氯-2,4-喹唑啉二酮加入到20mL無水乙腈中，N₂保護(hù)下，逐滴加入1.0mL(4mmol)NO-BSA,于25℃下反應(yīng)2h。0.30g(0.55mmol)1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-1-β-D-呋喃核糖和0.2mL(1.1mmol)TMSOTf同時(shí)加入到上述溶液中，升溫至50-60℃，反應(yīng)20-24h。旋蒸除去溶劑，飽和NaHCO₃和飽和NaCl水溶液洗滌次。硅膠旋干，柱層析分離法提純產(chǎn)物。產(chǎn)物為淺黃色固體。

實(shí)例六：5-氯-2,4-喹唑啉二酮尿苷的制備

取實(shí)例五產(chǎn)物和50mL甲醇加入到高壓反應(yīng)管中，通氨氣，溶解后繼續(xù)通1h。封閉反應(yīng)管，60-80℃下反應(yīng)20-24h。旋干溶劑，柱層析分離提純產(chǎn)物。淺黃色固體0.122g，實(shí)例五和實(shí)例六兩步產(chǎn)率為75％。