描述

本發(fā)明涉及使用捕獲標(biāo)記物制備三磷酸修飾的寡核苷酸的方法。該方法可以以高產(chǎn)量和適用于藥物應(yīng)用的純度合成和純化三磷酸修飾的寡核苷酸。

發(fā)明背景

Schlee等，Immunity，2009，31，25-34描述了在一條鏈上攜帶5’-O-三磷酸酯部分的鈍端雙鏈RNA，通過(guò)結(jié)合RIG-I解螺旋酶，作為有效的免疫系統(tǒng)的刺激劑。因此，對(duì)提供簡(jiǎn)單且有效的用于制備適用于藥物應(yīng)用的高純度三磷酸修飾的寡核苷酸的方法存在需求。

三磷酸酯基團(tuán)或其類似物與核苷化合物的5’-OH基團(tuán)的偶聯(lián)是本領(lǐng)域公知的。Ludwig J.等，J.Org.Chem.1989，54，631-635公開(kāi)了使用2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷雜環(huán)己烷-4-酮作為亞磷酸化劑的用于制備核苷和類似物的5’-O-三磷酸酯的溶液三磷酸化方法。Gaur R.K.等，1992，Tetrahedron Letters，33，3301-3304描述了在固相上使用所述方法，用于合成2’-O-甲基核糖核苷5’-O-三磷酸酯及其P_α-硫代類似物。美國(guó)專利6,900,308B2公開(kāi)了作為潛在抗病毒化合物的修飾核苷5’-O-三磷酸酯的固相合成，而美國(guó)專利7,285,658、7,598,230和7,807,653公開(kāi)了在糖、核堿基和三磷酸酯部分中具有修飾的核苷三磷酸酯類似物。

WO96/40159描述了用于生產(chǎn)加帽的RNA或RNA類似物分子的方法，其中將RNA或RNA類似物寡核苷酸與亞磷酸化劑(如，2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷雜環(huán)己烷-4-酮或其環(huán)取代的衍生物)反應(yīng)。將所得到的中間體與磷酸酯或焦磷酸酯或其氧化的或水解的鹽反應(yīng)。通過(guò)與激活的m⁷G三-、二-或單磷酸酯或類似物反應(yīng)，將二-或三磷酸化RNA或RNA類似物加帽。

WO2009/060281描述了含有修飾的寡磷酸酯部分的免疫刺激寡核糖核苷酸類似物和用于制備這些化合物的方法。該方法包括在固體支持物上合成寡核苷酸，在合適的溶劑中，并且在堿的存在下，在寡核苷酸的5’-端，將核苷酸與亞磷酸化劑(如，2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷雜環(huán)己烷-4-酮)反應(yīng)，將亞磷酸化的寡核苷酸與焦磷酸酯或焦磷酸酯類似物反應(yīng)，用氧化劑氧化寡核苷酸，并且將寡核苷酸去保護(hù)，以產(chǎn)生三磷酸酯-或三磷酸酯類似物-修飾的寡核苷酸。

WO96/40159中使用的聚丙烯酰胺凝膠電泳只可用于小規(guī)模分離。用于較長(zhǎng)寡核糖核苷的5’-單-、二-、三磷酸化產(chǎn)品的離子交換色譜的分辨力受到限制。所需的變性條件使得分離是個(gè)冗長(zhǎng)乏味的任務(wù)(Sproat，1999；Zlatev，2010；WO2009/060281)，此外，產(chǎn)品通常受到正-1、正-2序列及其單-和二磷酸酯的污染，導(dǎo)致純度不足。已知對(duì)RIG-I配體的精確末端結(jié)構(gòu)的敏感性，這些純化方法對(duì)藥物應(yīng)用是次最佳的。

雙重靶向策略(siRNA和RIG配體)需要與純化方法無(wú)關(guān)的通用序列。

發(fā)明概述

大規(guī)模生產(chǎn)用于潛在臨床使用的5’-O-三磷酸化寡核苷酸及其類似物是高度理想的，并且方便的制備方法也是非常需要的。在本申請(qǐng)中，顯示了用捕獲標(biāo)記物(例如，癸胺)可以將固相結(jié)合的全保護(hù)寡核苷酸的5’-O-環(huán)三磷酸酯中間體(參見(jiàn)圖1)的環(huán)打開(kāi)，產(chǎn)生對(duì)RNA的去保護(hù)穩(wěn)定的P_γ標(biāo)記的物質(zhì)。標(biāo)記物的性質(zhì)使得捕獲標(biāo)記的三磷酸酯物質(zhì)特異性停留在捕獲標(biāo)記物特異性試劑上。如果需要，可以按序除去標(biāo)記物。該方法可以延伸至包括三磷酸酯部分的類似物，例如，含有替代氧原子的例如β,γ-亞甲基、氟代亞甲基、二氟亞甲基和亞氨基的類似物。

捕獲標(biāo)記方法的優(yōu)勢(shì)是所需物質(zhì)的簡(jiǎn)單純化和提高的回收，例如，在室溫下，通過(guò)RP-HPLC或親和性色譜，任選地緊接著在合適的條件下捕獲標(biāo)記物的切割。

優(yōu)選實(shí)施方案的詳述

本發(fā)明描述了含有捕獲標(biāo)記物的三磷酸寡核苷酸的合成和純化，包括其類似物。最廣泛使用的用于標(biāo)準(zhǔn)5’-OH寡核苷酸的HPLC純化的方法是三苯甲基-ON寡核苷酸的反相色譜。

本發(fā)明中所述的方法提供了實(shí)際的解決方法，對(duì)于5’-三磷酸化寡核苷酸具有相似的功效。

因此，本發(fā)明的主題是制備式(I)的寡核苷酸的方法，

其中V₁、V₃和V₅在每種情況中獨(dú)立地選自O(shè)、S和Se；

V₂、V₄和V₆在每種情況中獨(dú)立地選自O(shè)H、OR¹、SH、SR¹、F、NH₂、NHR¹、N(R¹)₂和BH₃^-M⁺，

W₁是O或S，

W₂是O、S、NH或NR²，

W₃是O、S、NH、NR²、CH₂、CHHal或C(Hal)₂，

R¹、R²和R³選自C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_2-6酰基或環(huán)基，各自任選被取代，

或其中兩個(gè)R¹可以和與其結(jié)合的N-原子一起形成環(huán)，

M⁺是陽(yáng)離子，

X是NH、NR³、O或S，

Z表示捕獲標(biāo)記物，

Y表示連接所述捕獲標(biāo)記物與X的鍵或連接物，和

ON表示包含至少4個(gè)核苷酸或核苷酸類似物結(jié)構(gòu)單元的寡核苷酸，

所述方法包括下列步驟：

(a)將式(IIa)的化合物與氧化劑反應(yīng)，

其中V₁、V₃、V₅、V₄、V₆、W₁、W₂、W₃和ON如上限定，以獲得式(IIb)的化合物

其中V₁、V₃、V₅、V₂、V₄、V₆、W₁、W₂、W₃和ON如上限定，

(b)將氧化的化合物與式(III)的捕獲標(biāo)記物試劑反應(yīng)，

Z-Y-XH (III)

其中X、Z和Y如上所述，以獲得包含式(I)的寡核苷酸的反應(yīng)產(chǎn)物，和

(c)在允許寡核苷酸(I)與所述反應(yīng)產(chǎn)物中所含的其他物質(zhì)分離的條件下，將步驟(b)的反應(yīng)產(chǎn)物與能夠與所述捕獲標(biāo)記物相互作用的試劑接觸。

任選地，該方法進(jìn)一步包括步驟(d)除去捕獲標(biāo)記物，以獲得式(IV)的寡核苷酸，

其中V₁、V₃、V₅、V₂、V₄、V₆、W₁、W₂、W₃和ON如上所述。

在不引起三磷酸酯部分降解的條件下進(jìn)行該步驟，例如，如以下詳細(xì)描述的條件。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，捕獲標(biāo)記物沒(méi)有除去或沒(méi)有完全除去。在這些實(shí)施方案中，如此標(biāo)記的寡核苷酸可以具有實(shí)用性，例如，作為藥劑的實(shí)用性。

在本申請(qǐng)內(nèi)容中的術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”包括含有多個(gè)(例如，至少4個(gè))核苷酸或核苷酸類似物結(jié)構(gòu)單元的化合物。優(yōu)選地，寡核苷酸包括6-100個(gè)，例如，20-40個(gè)結(jié)構(gòu)單元。核苷酸或核苷酸類似物結(jié)構(gòu)單元可以包括由亞基間連接連接的核苷酸或核苷酸類似物亞基。核苷酸亞基包括脫氧核糖核苷亞基、核糖核苷亞基和/或其類似物，特別是糖-和/或核堿基-修飾的核苷類似物。此外，寡核苷酸可以包含非核苷酸結(jié)構(gòu)單元和/或更多的末端和/或側(cè)鏈修飾。

在優(yōu)選的糖修飾亞基中，核糖核苷亞基的2’-OH被選自O(shè)R、R、鹵素、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂或CN的基團(tuán)取代，其中R是C_1-6烷基、C_2-6烯基或C_2-6炔基，并且鹵素是F、Cl、Br或I。在進(jìn)一步優(yōu)選的糖修飾亞基中，核糖可以是取代的，例如，被另一種糖取代，例如，戊糖，如阿拉伯糖。這種糖修飾可以結(jié)合如上所述的2’-OH修飾，如2’-氟代阿拉伯核苷亞基中的修飾。再進(jìn)一步優(yōu)選的糖修飾亞基包括鎖核苷(LNA)或2’,3’-斷-核苷(UNA)。在優(yōu)選的核堿基修飾的核苷結(jié)構(gòu)單元中，替代標(biāo)準(zhǔn)核堿基，使用非標(biāo)準(zhǔn)的，非天然產(chǎn)生的核堿基。非標(biāo)準(zhǔn)的核堿基的實(shí)例是5-位的尿嘧啶或胞嘧啶，例如，5-(2-氨基)丙基尿嘧啶或5-溴尿嘧啶；次黃嘌呤；2,6-二氨基嘌呤；8-位修飾的腺嘌呤或鳥(niǎo)嘌呤，例如，8-溴鳥(niǎo)嘌呤；去氮核苷，例如，7-去氮鳥(niǎo)嘌呤或7-去氮腺嘌呤；或O-和N-烷基化核堿基，例如，N⁶-甲基腺嘌呤，或N⁶,N⁶-二甲基腺嘌呤。更多合適的核堿基類似物可以選自通用核堿基類似物，如5-硝基吲哚。

亞基間連接可以是磷酸二酯連接或修飾的連接，例如，硫逐磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸甲酯、氨基磷酸酯、硼磷酸酯，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的另一種修飾的連接。

寡核苷酸可以選自脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和寡核苷酸類似物。脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的類似物可以包括至少一個(gè)脫氧核糖核苷或核糖核苷亞基和至少一個(gè)修飾的核苷亞基和/或至少一個(gè)修飾的亞基間連接，例如，如上所述的。寡核苷酸類似物還可以存在于它們完整的修飾核苷亞基中。

寡核苷酸可以是單鏈分子或雙鏈分子。雙鏈寡核苷酸可以包括全部或部分互補(bǔ)鏈。雙鏈分子可以是鈍端的，或包含至少一個(gè)懸垂物，例如，5’-或3’-懸垂物。懸垂物如果存在，優(yōu)選位于分子的遠(yuǎn)端(相對(duì)于三磷酸酯/三磷酸酯類似物基團(tuán))。雙鏈寡核苷酸還可以包括發(fā)夾-結(jié)構(gòu)，其中在其遠(yuǎn)端(相對(duì)于三磷酸酯/三磷酸酯類似物基團(tuán))通過(guò)環(huán)閉合雙鏈。環(huán)可以包含核苷酸和/或非核苷酸結(jié)構(gòu)單元，例如，基于二醇的結(jié)構(gòu)單元，如乙二醇部分，例如，三(乙烯)醇或六(乙烯)醇；丙烷-1,3-二醇；十二烷-1,12-二醇；或3,12-二氧雜-7,8-二硫十四烷-1,14-二醇。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙鏈分子是鈍端的，特別是在其近端(相對(duì)于三磷酸酯/三磷酸酯類似物基團(tuán))。

寡核苷酸可以包括更多的末端和/或側(cè)鏈修飾，例如，與其共價(jià)連接的細(xì)胞特異性靶向?qū)嶓w。那些實(shí)體可以促進(jìn)細(xì)胞或細(xì)胞特異性吸收，并且包括，例如，脂質(zhì)、維生素、激素、肽、寡糖及其類似物。靶向?qū)嶓w可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法例如連接修飾的核堿基或非核苷酸結(jié)構(gòu)單元。

式(I)或(IV)的寡核苷酸包括三磷酸酯/三磷酸酯類似物基團(tuán)。在該基團(tuán)中，V₁、V₃和V₅獨(dú)立地選自O(shè)、S和Se。優(yōu)選地，V₁、V₃和V₅是O。V₂、V₄和V₆在每種情況中獨(dú)立地選自O(shè)H、OR¹、SH、SR¹、F、NH₂、NHR¹、N(R¹)₂和BH₃^-M⁺。優(yōu)選地，V₂、V₄和V₆是OH。R¹可以是C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_2-6?；颦h(huán)基，例如，C_3-8環(huán)(雜)烷基、C_3-8環(huán)(雜)烯基、苯基或C_5-6雜芳基基團(tuán)，其中雜原子選自N、O和S。此外，兩個(gè)R¹可以和與其結(jié)合的N-原子一起形成環(huán)，例如，5-或6-元環(huán)。R¹還可以包括取代基，如鹵素(例如，F(xiàn)、Cl、Br或I)、O(鹵素)C_1-2烷基，以及-在環(huán)基情況中-(鹵素)C_1-2烷基。M⁺可以是無(wú)機(jī)或有機(jī)陽(yáng)離子，例如，堿金屬陽(yáng)離子，或銨或胺陽(yáng)離子。

W₁可以是O或S。優(yōu)選地，W₁是O。W₂可以是O、S、NH或NR²。優(yōu)選地，W₂是O。W₃可以是O、S、NH、NR²、CH₂、CHHal或C(Hal)₂。優(yōu)選地，W₃是O、CH₂或CF₂。R²可以選自如以上對(duì)R¹所述的基團(tuán)。Hal可以是F、Cl、Br或I。

三磷酸酯/三磷酸酯類似物基團(tuán)優(yōu)選連接寡核苷酸的末端。優(yōu)選地，所述基團(tuán)與寡核苷酸的5’-端，特別是其5’-端糖的5’-OH-基團(tuán)連接。

本發(fā)明方法的步驟(a)包括式(IIa)的環(huán)狀P(V)-P(V)-P(III)物質(zhì)與氧化劑的反應(yīng)?？梢愿鶕?jù)Ludwig等，1989，上文和Gaur等，1992，上文中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)獲得式(IIa)的化合物，即，在合適的條件下，例如，在堿(吡啶或二異丙基甲胺)的存在下，在合適的溶劑(如二噁烷或二氯甲烷)中，通過(guò)將寡核苷酸的5’-端OH-基團(tuán)與三功能的亞磷酸化劑(例如，2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷雜環(huán)己烷-4-酮)反應(yīng)，并且隨后與焦磷酸酯(W₃＝O)或修飾的焦磷酸酯(W₃不同于O，例如，CH₂、CCl₂、NH或CF₂)反應(yīng)。優(yōu)選地，使用DMF中的焦磷酸酯或修飾的焦磷酸酯的三-正-丁銨鹽。然后在無(wú)水條件下，例如，使用過(guò)氧化物，如t-丁基氫過(guò)氧化物、枯烯氫過(guò)氧化物、(10-樟腦磺酰)啞嗪，來(lái)氧化所得到的環(huán)狀P(III)-P(V)中間體(IIa)?；蛘?，也可以分別使用苯乙酰基二硫化物(V₂＝S)或硼烷-二異丙基乙胺復(fù)合物(V₂＝BH₃)，來(lái)產(chǎn)生相應(yīng)的式(IIb)的環(huán)狀5’-三磷酸酯/三磷酸酯類似物。該內(nèi)容還可以參考WO96/40159或WO2009/060281，按應(yīng)用將其內(nèi)容并入本文中作為參考。

反應(yīng)步驟(a)可以使用溶液中的寡核苷酸或使用結(jié)合固相(例如，有機(jī)樹(shù)脂或玻璃，如CPG)的寡核苷酸來(lái)進(jìn)行。寡核苷酸可以進(jìn)一步包括保護(hù)基團(tuán)，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的糖-或核堿基保護(hù)基團(tuán)。保護(hù)基團(tuán)的優(yōu)選實(shí)例是用于核苷間磷酸二酯或硫逐磷酸酯的2-氰基乙基，用于核糖2’-羥基的叔-丁基二甲基甲硅烷基、三異丙基甲硅烷基氧甲基或雙(乙酰氧乙氧基)甲基，用于核堿基的環(huán)外氨基的4-叔-丁基苯氧基乙酰基或苯氧基乙?；?、乙?；?、異丁?；⒈郊柞；８鼉?yōu)選地，使用固相結(jié)合的寡核苷酸進(jìn)行步驟(a)。

根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(b)，將化合物(IIb)與式(III)的捕獲標(biāo)記物試劑反應(yīng)

Z-Y-XH (III)

其中X是選自NH、NR³、O或S的基團(tuán)。如以上對(duì)R¹所述的來(lái)限定R³。優(yōu)選地，X是NH或S。

以下通過(guò)一系列似是而非的實(shí)例來(lái)功能性地限定捕獲標(biāo)記物。一般規(guī)則為：

Z必須允許方便的純化，并且在適合pppRNA穩(wěn)定性要求的條件下應(yīng)當(dāng)可以去除。

Y表示化學(xué)鍵或連接物，例如，亞烷基，優(yōu)選地，C_1-6-亞烷基連接物，更優(yōu)選地，C_2-5亞烷基連接物，或芳亞烷基連接物，任選地包含雜原子或含雜原子基團(tuán)，如O、S、NH、C＝O或C＝S，和/或任選地包含C＝C或C≡C鍵。

在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，連接物是聚環(huán)氧烷連接物，優(yōu)選地，聚-C₂-C₆-環(huán)氧烷，更優(yōu)選聚-C₂-C₃-環(huán)氧烷。連接物的數(shù)量平均分子量在30-800g/mol的范圍內(nèi)，優(yōu)選40-450g/mol，更優(yōu)選40-250g/mol。連接物可以是[-CH₂CHR⁴-O-]_n，n＝1-10，優(yōu)選n＝1-7，更優(yōu)選n＝2-5，甚至更優(yōu)選n＝3。R⁴可以是H或C_1-6-烷基。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，R⁴是H。

在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，連接物具有式-CH₂-CH₂-[(O-CH₂CH₂)]₃-。

可以使用溶液中的寡核苷酸或使用結(jié)合固相(例如，有機(jī)樹(shù)脂或玻璃)的寡核苷酸來(lái)進(jìn)行反應(yīng)步驟(b)。寡核苷酸可以進(jìn)一步包含如上所述的保護(hù)基團(tuán)。更優(yōu)選地，使用固相結(jié)合的寡核苷酸來(lái)進(jìn)行步驟(b)。

根據(jù)本發(fā)明的捕獲標(biāo)記物Z是在允許分離包含捕獲標(biāo)記物的化合物(例如，寡核苷酸(I))與不含捕獲標(biāo)記物的其他物質(zhì)的條件下能夠與捕獲試劑非共價(jià)或共價(jià)相互作用的部分。優(yōu)選地，捕獲試劑是固定化試劑或能夠被固定化的試劑。

合適的捕獲標(biāo)記物例如是長(zhǎng)鏈(例如，C_8-24，優(yōu)選C_13-24)脂族烷基殘基，如癸基或十八烷基，或其他脂類/親脂性殘基，如，例如，膽固醇基或生育酚基。在這種情況中，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)反相色譜，例如，RP-HPLC，或通過(guò)疏水性相互作用色譜(HIC)，在固相上捕獲和純化標(biāo)記的三磷酸酯實(shí)體。捕獲標(biāo)記物還可以是全氟烷基實(shí)體，例如，4-(1H,1H,2H,2H-全氟癸基)芐基或3-(全氟辛基)丙基殘基，用于在Fluorous親和性支持物(如，從Fluorous Technologies，Inc.可購(gòu)得)上的修飾寡三磷酸酯的特異性捕獲。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲標(biāo)記物可以是非共價(jià)高親和性結(jié)合對(duì)的第一配偶體，如生物素，或生物素類似物，如脫硫生物素，半抗原或抗原，其對(duì)捕獲試劑具有高親和性(例如，10^-6l/mol或更低的結(jié)合常數(shù))，捕獲試劑是高親和性結(jié)合對(duì)的第二互補(bǔ)配偶體，例如，抗生物素蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白或抗體。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲標(biāo)記物可以是共價(jià)結(jié)合對(duì)的第一配偶體，其可以與捕獲試劑形成共價(jià)鍵，捕獲試劑是共價(jià)結(jié)合對(duì)的第二互補(bǔ)配偶體，其中共價(jià)鍵可以是可逆的或不可逆的鍵。在這個(gè)實(shí)施方案中，捕獲標(biāo)記物成分Z可以反應(yīng)性化學(xué)實(shí)體，在Husigen 3+2環(huán)加成反應(yīng)的情況中(所謂的Cu(I)催化的點(diǎn)擊反應(yīng)”或其變體，沒(méi)有Cu(I)通過(guò)劇烈的環(huán)鏈釋放進(jìn)行，例如在環(huán)辛炔衍生物中)，是能夠與含有互補(bǔ)反應(yīng)基(例如，分別為，炔基或疊氮部分)的捕獲試劑共價(jià)反應(yīng)的如疊氮化物或炔基基團(tuán)。在這種情況中，Z-Y-X的特異性實(shí)例是炔丙基氨基。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲標(biāo)記物成分可以是含有另外的親核性基團(tuán)(例如，NH₂-Y-XH型試劑中的第二氨基)的化學(xué)實(shí)體。然后可以使用各種合適的親電子Z試劑，如膽固醇、氯甲酸酯或生物素N-羥基琥珀酰亞胺活性酯來(lái)引入標(biāo)記基團(tuán)，同時(shí)將寡核苷酸與固相連接，由此顯著地延伸了標(biāo)記反應(yīng)的范圍。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，捕獲標(biāo)記物是長(zhǎng)鏈烷基殘基、全氟烷基實(shí)體、疊氮化物或炔基基團(tuán)。

此外，Y可以任選含有二硫鍵，使得能夠收集修飾的三磷酸化寡核苷酸，所述寡核苷酸具有經(jīng)由連接物部分通過(guò)X連接γ-磷的游離巰基部分。

在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸可以在不同的位置，例如，在3’-端攜帶第二捕獲標(biāo)記物。優(yōu)選地選擇第一和第二捕獲標(biāo)記物，使得可以通過(guò)兩個(gè)正交方法來(lái)純化，使得能夠收集非常高純度的材料。例如，第一捕獲標(biāo)記物可以是親脂性基團(tuán)，其可以與合適的色譜支持物相互作用，而第二捕獲標(biāo)記物可以是生物素，其與抗生物素蛋白鏈菌素相互作用。

通過(guò)進(jìn)行使用用于寡核糖核苷酸合成的修飾CPG(受控玻璃支持物)的合成來(lái)方便地引入第二捕獲標(biāo)記物。

本發(fā)明方法的步驟(c)包括在允許含有捕獲標(biāo)記物的寡核苷酸(I)與反應(yīng)產(chǎn)物中所含的其他物質(zhì)分離的條件下將步驟(b)的反應(yīng)產(chǎn)物與能夠與所述捕獲標(biāo)記物Z相互作用的捕獲試劑接觸。在步驟(c)之前，將固相結(jié)合的寡核苷酸(I)與固相分離并且去保護(hù)，即，部分或全部去除保護(hù)基團(tuán)。捕獲試劑優(yōu)選固定在合適的支持物，例如，色譜支持物上。為了提供含有捕獲標(biāo)記物的寡核苷酸(I)與不含捕獲標(biāo)記物的物質(zhì)的分離，將步驟(b)的反應(yīng)產(chǎn)物與固相分離并且去保護(hù)，如果需要，并接受分離程序，優(yōu)選基于捕獲標(biāo)記物Z與捕獲試劑相互作用的色譜分離程序。在分離步驟的過(guò)程中，寡核苷酸(I)的純度(根據(jù)序列的長(zhǎng)度和復(fù)雜性，對(duì)于粗制材料，通常在25-70％范圍內(nèi))可以提高至90％、91％、92％、93％、94％、95％或更高。對(duì)于毒性研究，需要>85％的純度，而在后期臨床試驗(yàn)中，純度應(yīng)當(dāng)在至少90-95％的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明提供了一種獲得人臨床試驗(yàn)所需的高純度pppRNA的方法。

在步驟(c)中，捕獲標(biāo)記物和能夠與其相互作用的捕獲試劑優(yōu)選選自(i)疏水性或氟化的基團(tuán)和對(duì)疏水性或氟化的基團(tuán)具有親和性的色譜材料，例如，反相材料或氟親和性材料；(ii)非共價(jià)高親和性結(jié)合對(duì)的第一配偶體和非共價(jià)高親和性結(jié)合對(duì)的第二互補(bǔ)配偶體，(iii)共價(jià)結(jié)合對(duì)的第一配偶體和共價(jià)結(jié)合對(duì)的第二互補(bǔ)配偶體，其中第一和第二配偶體形成共價(jià)鍵。

在純化步驟(c)后，可以在步驟(d)中將捕獲標(biāo)記物Z與三磷酸修飾的寡核苷酸分離，形成未標(biāo)記的寡核苷酸(IV)。

步驟(d)必須適合三磷酸酯末端產(chǎn)物的穩(wěn)定性要求和核糖核苷酸間鍵的穩(wěn)定性要求。當(dāng)X是NH時(shí)，可以包括通過(guò)溫和的酸性條件的切割，當(dāng)X是S時(shí)，使用銀離子切割，當(dāng)Y-X-P含有-S-S-CH₂-CH₂-O-P時(shí)，通過(guò)硫醇(如二硫蘇糖醇)切割，導(dǎo)致環(huán)硫乙烷的消除。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，捕獲標(biāo)記物組完全或部分保留在三磷酸修飾的寡核苷酸上，特別是標(biāo)記的寡核苷酸適用于藥物應(yīng)用時(shí)。在這些實(shí)施方案中，試劑Z-Y-XH必須選自Z-殘基的亞組，其在功能上適合RIG-I傳感器的結(jié)構(gòu)要求。例如，已知Z＝癸基-十八烷基，Y＝連接，XH＝NH組合滿足這些要求。

由于其高純度，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的三磷酸酯/三磷酸酯類似物修飾的寡核苷酸特別適用于藥物應(yīng)用。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸(I)或(IV)是RIG-1解螺旋酶的激活劑。合適的RIG-1激活劑的特定實(shí)例公開(kāi)于Schlee等，2009，上文，按引用將其內(nèi)容并入本文中作為參考。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得的式(I)的寡核苷酸。

本發(fā)明的再另一個(gè)主題是用于制備式(I)的寡核苷酸的試劑盒的用途，

其中V₁、V₃、V₅、V₂、V₄、V₆、W₁、W₂、W₃、X、Y、Z和ON如上限定，

其中該試劑盒包含(a)式(III)的捕獲標(biāo)記物試劑

Z-Y-XH (III)

其中X、Y和Z如上限定，和

(b)能夠與所述捕獲標(biāo)記物相互作用的捕獲試劑。

本發(fā)明的再另一個(gè)主題是修飾的式(I)寡核苷酸

其中

X是NH、O、R-O-[P(V₁)V_2-W₁]_n或R-O-P(V₃)V₄-W₂-P-(V₁)V₂-W₁

n是1-12，優(yōu)選1或2，

Y是鍵，

Z是C₁₃-C₂₄烷基、Q或QNHC₂-C₂₄烷基，

Q選自H、氨基酸、氨基酸類似物、C₁-C₂₄烷基(優(yōu)選C₁₂-C₂₄烷基)、肽和脂質(zhì)，

R是C₁-C₂₄烷基、C₂-C₂₄烯基、C₂-C₂₄炔基和脂質(zhì)，

R是C₁-C₂₄烷基、C₂-C₂₄烯基、C₂-C₂₄炔基、C₂-C₂₄?；颦h(huán)基，并且任選地被取代，

和V₁、V₂、V₃、V₄、V₅、V₆、W₁、W₂、W₃和ON如權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)中限定，其中V₁、V₂、V₃、V₄、V₅、V₆、W₁、W₂和W₃優(yōu)選地是O。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，修飾的式(I)寡核苷酸具有是NH的X。該實(shí)施方案優(yōu)選具有是Q的Z或是QNHC₂-C₂₄烷基的Z，其中在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，C₂-C₂₄烷基是C₂烷基和/或Q是H。根據(jù)本發(fā)明鑒定的寡核苷酸的特別優(yōu)選的實(shí)施方案顯示于圖8中。

此外，將通過(guò)以下附圖和實(shí)施例來(lái)更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。

圖1顯示了使用癸基殘基作為捕獲標(biāo)記物Z的本發(fā)明方法的示意圖。

圖2顯示了經(jīng)由正-癸基-NH-pppRNA中間體的pppRNA的RP-HPLC純化

(A)含有65％正-癸基-NH-pppRNA的粗反應(yīng)混合物(峰值在14分鐘)；

(B)分離的正-癸基-NH-pppRNA；

(C)pppRNA；pH＝3.8，來(lái)自B的60分鐘水解產(chǎn)物

在圖2中，x-軸表示時(shí)間[分鐘]，而y-軸表示260nm處的吸光值[mAu]。

A中10分鐘停留時(shí)間時(shí)的寬峰含有非磷酸化24-mer、較短的合成失敗序列、少量pppRNA水解產(chǎn)物和24-mer的5’-H-磷酸酯衍生物。插入物顯示了該系統(tǒng)中pppRNA和5’-OH RNA的位置。

柱：Hamilton PRP-1 4.1×250mm，10μm

梯度：18分鐘中1-100％B，A＝0.05M TEAB；B＝80％甲醇0.05M TEAB

圖3顯示了分別對(duì)應(yīng)于圖2中的HPLC蹤跡A、B和C的MALDI-TOF譜(x-軸：質(zhì)量[Da])。

(A)從脫鹽后的粗反應(yīng)混合物記錄的譜，顯示了正-癸基-NH-pppRNA(24d)、pppRNA(24c)、5’-H-磷酸RNA(24b)和5’-OH-RNA(24a)以及較短的合成失敗序列的存在，如峰12-23所示；

(B)從HPLC分離的正-癸基-NHpppRNA(B)記錄的譜；

(C)從正-癸基-NH-pppRNA的pH3.8水解產(chǎn)物的直接EtOH沉淀獲得的純pppRNA的譜

圖4顯示了解釋副產(chǎn)物24a-c產(chǎn)生的反應(yīng)圖解。

圖5顯示了正-癸基-NH-pppRNA經(jīng)由氨基硫酸酯鍵酸水解轉(zhuǎn)化成pppRNA的時(shí)間過(guò)程。

圖6顯示了除去捕獲標(biāo)記物并作為Na+鹽EtOH沉淀后獲得的21-mer、24-mer和27-mer pppRNA產(chǎn)物的典型MALDI譜(x-軸：質(zhì)量[Da])。在m/z 6911.6(A)、m/z 7828(B)、m/z 8808.1(C)觀察到正確的質(zhì)量峰，而m/z 3462(A)、m/z 3918(B)、4408(C)的峰分別是由于雙倍帶電pppRNA引起的。在使用在15-42mer范圍中含有核苷類似物和3’修飾的各種序列的超過(guò)50個(gè)實(shí)例中獲得了相似品質(zhì)的譜。

圖7A顯示了在7mm Hamilton PRP-1柱上的癸基-NHpppRNA 21mer的1μmol規(guī)模反應(yīng)的半制備性規(guī)模反相HPLC純化

柱：Hamilton PRP-1 7×250mm，10μm流速3mL/分鐘。

梯度：50分鐘中1-80％B，A＝0.1M TEAB；B＝80％甲醇0.1M TEAB

圖7B和圖7C顯示了半制備性規(guī)模反相HPLC純化，特別顯示了本發(fā)明的方法能夠處理次最佳合成和/或5’-磷酸化條件。

在所有圖中，x-軸是體積[ml]，而y-軸是260nm處的吸光值[mAu]。

圖8顯示了特別優(yōu)選的式(I)的修飾寡核苷酸。

圖9顯示了化合物F-TAG-pppRNA和N3-TAG-pppRNA的合成(A)和使用N3-TAG RNA的可逆共價(jià)固定的策略(B)。

圖10顯示了F-TAG-pppRNA(A)N3-TAG-pppRNA(B)的MALDI譜。

圖11顯示了pppRNA和使用烷基殘基增加鏈長(zhǎng)的正-烷基-NH-pppRNA的RP-HPLC分析：

A.pppRNA，RT＝9.3分鐘

B.正-癸基-NH-pppRNA，RT＝13.8分鐘

C.正-十二烷基-NH-pppRNA，RT＝15.5分鐘

D.正-十四烷基-NH-pppRNA，RT＝17.3分鐘

E.正-十八烷基-NH-pppRNA，RT＝19.7分鐘

實(shí)施例1

使用癸基胺捕獲標(biāo)記物純化步驟制備5’-三磷酸修飾的寡核苷酸

實(shí)施例1中所述的反應(yīng)流程的概括顯示于圖1中。

步驟1：在氬下將203mg(1mmol)2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷雜環(huán)己烷-4-酮溶解于10mL樣品瓶(septum vial)中的1mL干二噁烷中。

步驟2：在真空下將含有完全保護(hù)的RNA的合成柱干燥12小時(shí)，所述RNA已經(jīng)去三苯甲基，并且用乙腈徹底洗滌。通過(guò)在氬氣氛中，重復(fù)吸入和排出2mL 3:1(v/v)的無(wú)水二噁烷/吡啶溶液來(lái)徹底洗滌柱內(nèi)容物。

步驟3：首先將2mL 3:1v/v的吡啶/二噁烷，接著將100μL干二噁烷中的1M 2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷雜環(huán)己烷-4-酮溶液加入小瓶中，以獲得50mM的亞磷酸化試劑溶液，例如，3:1(v/v)的二噁烷/吡啶中的2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷雜環(huán)己烷-2-酮。通過(guò)溫和振蕩將溶液均質(zhì)。通過(guò)合成柱從小瓶吸取2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷雜環(huán)己烷-4-酮溶液來(lái)開(kāi)始反應(yīng)。

在反應(yīng)過(guò)程中，從合成柱重復(fù)吸入和排出含有2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷雜環(huán)己烷-4-酮的溶液，使得與固相支持的RNA充分接觸和良好混合。30分鐘的反應(yīng)時(shí)間通常獲得20-40nt范圍中的結(jié)合支持物的寡聚物的游離5’-OH基團(tuán)的近定量反應(yīng)。

步驟4：30分鐘的反應(yīng)時(shí)間后，將含有過(guò)量亞磷酸化劑的二噁烷/吡啶溶液排入廢液容器中，給新的注射器裝滿1mL干DMF中的0.5M(Bu₃NH)₂焦磷酸酯和238μL(1mmol)干Bu₃N，以獲得0.5M(Bu₃N)₄焦磷酸酯溶液。推動(dòng)該溶液通過(guò)柱子，由此與二噁烷/吡啶溶液反應(yīng)。大的過(guò)量的焦磷酸酯溶液確保中間體定量轉(zhuǎn)化成P(III)-P(V)環(huán)酐IIa。

步驟5：用3mL CH₃CN洗滌柱子，以除去DMF和過(guò)量PP_i，并且給柱反應(yīng)器裝滿干CH₃CN。

步驟6：將300μL的t-BuOOH(癸烷的5.5M溶液，Sigma-Aldrich)溶解于2mL無(wú)水CH₃CN中，以獲得大約0.7M的均勻溶液。將合成支持物接觸該溶液15分鐘，以獲得氧化的P(V)環(huán)酐IIb。

步驟7：用3mL干CH₃CN洗滌柱子，以除去過(guò)量過(guò)氧化物，并將其裝滿干CH₃CN。

步驟8：在氬下將300μL干癸胺溶解于1mL的干CH₃CN中，并使溶液接觸柱子中的支持物。癸胺溶液通過(guò)支持物移動(dòng)。CPG與胺溶液的接觸時(shí)間應(yīng)當(dāng)為3分鐘。

步驟9：用9mL乙腈徹底洗滌柱子，然后通過(guò)將氬快速通過(guò)其來(lái)干燥柱子內(nèi)含物。

步驟10-去保護(hù)的第一階段：將1mL去保護(hù)溶液(40％含水甲胺/含水濃氨1:1v/v。AMA試劑)通過(guò)支持物2-3次。接觸30分鐘后，將溶液轉(zhuǎn)移至新的小瓶中。用相同體積的AMA去保護(hù)溶液洗滌支持物，并合并洗滌液。將合并的溶液和洗滌液在65℃下加熱10分鐘。在冰上冷卻后，將溶液濃縮至300-500μL的體積，然后蒸發(fā)至干。

步驟11-2’-O-TBDMS保護(hù)基團(tuán)的去除：通過(guò)添加和共同蒸發(fā)300μL的干EtOH來(lái)干燥殘余物，加入1mL THF中的干1M TBAF(四-正-丁基氟化銨)，緊密密封，并置于搖床上16h。用1mL無(wú)菌含水1M TEAB(三乙基碳酸氫銨)淬滅反應(yīng)，并將其在NAP^TM-25(Nucleic Acid Purification)柱上脫鹽，使用無(wú)菌水作為洗脫劑。在該步驟中，需要通過(guò)無(wú)菌2μm濾器過(guò)濾。合并并將UV-吸收部分蒸發(fā)至150μL的體積，加入100mL 1M TEAB pH8，并且將溶液在-20℃下冷凍存儲(chǔ)，直至可以進(jìn)行HPLC純化。癸基-NHpppRNA產(chǎn)物在pH7-8下在-20℃下穩(wěn)定數(shù)周。

步驟12-HPLC純化：將來(lái)自步驟11的1μmol規(guī)模反應(yīng)混合物的反應(yīng)產(chǎn)物裝載至7×25mm PRP-1柱(Hamilton)中。使用3mL/分鐘流速的50分鐘內(nèi)0至80％的線性梯度緩沖液B進(jìn)行了純化。緩沖液A是100mMTEAB，而緩沖液B是甲醇/水8:2v/v中的100mM TEAB。27-mer純化的典型實(shí)例顯示于圖7A中。

收集級(jí)分5和6，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)，并且通過(guò)使用干甲醇的幾次共同蒸發(fā)來(lái)脫鹽。將殘余物(大約200-250nmol的癸基-NHpppRNA)溶解于水中，并轉(zhuǎn)移至帶螺帽的Eppendorf小瓶中。

步驟13-癸胺標(biāo)記物的去除：將100nmol的癸基-NHpppRNA溶解于2mL Eppendorf管中的400μL pH3.8的去保護(hù)緩沖液中，并將密封管在60℃下加熱70分鐘。這些條件導(dǎo)致氨基磷酸酯鍵的定量切割，三磷酸酯部分沒(méi)有降解。然后將反應(yīng)混合物在冰上冷卻，并且加入25μL無(wú)菌5M NaCl溶液和1.2mL絕對(duì)EtOH。徹底混合后，將溶液保持在-20℃過(guò)夜，以沉淀pppRNA。通過(guò)離心收集沉淀物，并用冷乙醇洗滌，在SpeedVac上干燥，然后溶解于500mL無(wú)菌水中，并在-20℃下冷凍存儲(chǔ)。

表1：用于引入5’-端癸基-NHppp-殘基的反應(yīng)條件的概述

含有結(jié)合支持物的去三苯甲基RNA的1μmol規(guī)模合成柱

試劑的雙向移動(dòng)

→單向洗滌步驟

以類似的方式，還使用十八烷基或膽固醇基捕獲標(biāo)記物合成和純化了5’-三磷酸修飾的寡核苷酸。

實(shí)施例2

使用非親脂性捕獲標(biāo)記物制備三磷酸寡核苷酸(F-TAG-pppRNA和N₃-TAG-pppRNA)

為了證明基于非親脂性相互作用的純化策略的實(shí)用性，制備了pppRNA衍生物F-TAG-RNA和N3-TAG-RNA(參見(jiàn)圖9)。所有合成步驟與實(shí)施例1中所述的程序相同，除了在圖1的步驟8中，將2mL無(wú)水乙腈中的0.1M 4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,11-十七氟十一胺溶液用于結(jié)合固相的環(huán)三磷酸酯的開(kāi)環(huán)，使用增加3小時(shí)的反應(yīng)，以獲得F-TAG-RNA；和2mL干乙腈中的0.1M 11-疊氮-3,6,9-三氧雜十一-1-胺溶液，持續(xù)3小時(shí)，用于獲得N₃-TAG-pppRNA。以下的去保護(hù)步驟與實(shí)施例1中對(duì)于DecNHpppRNA詳述的那些相同。

F-TAG-RNA和N3-TAG-RNA分析數(shù)據(jù)(參見(jiàn)圖10)：

(這些實(shí)施例中的RNA序列是5’-GACGCUGACCCUGAAGUUCAUCUU)

*20分鐘內(nèi)PRP-1柱0-100％B(A＝100mM三乙基碳酸氫銨(TEAB)，B＝100mM TEAB 80％MeOH)

可以使用商業(yè)“氟”筒或氟HPLC柱來(lái)純化含有氟標(biāo)記物的pppRNA寡核苷酸(F-TAG-pppRNA)，所述“氟”筒或氟HPLC柱能夠利用全氟化烷基鏈之間的強(qiáng)烈非共價(jià)相互作用。γ-疊氮化物修飾的pppRNA衍生物(N3-TAG-pppRNA)通過(guò)銅(I)-催化的-炔烴-疊氮化物環(huán)加成反應(yīng)(點(diǎn)擊化學(xué))的RNA相適形式可以共價(jià)結(jié)合可購(gòu)得的丙炔修飾的固相。這種程序能夠純化高度結(jié)構(gòu)化的pppRNA序列，因?yàn)樵跇?shù)脂結(jié)合形式中，可以應(yīng)用變性條件來(lái)除去非三磷酸化副產(chǎn)物。

在酸水解F-TAG-RNA和N3-TAG-RNA時(shí)，釋放pppRNA終產(chǎn)物，與圖5中所述的簡(jiǎn)單P-N烷基酰胺具有相當(dāng)?shù)膭?dòng)力學(xué)。

實(shí)施例3

通過(guò)增加鏈長(zhǎng)的正-烷基捕獲標(biāo)記物的標(biāo)記物-pppRNA的RP-HPLC洗脫位置的變化

除了實(shí)施例1中所述的正-癸基-標(biāo)記物以外，具有較長(zhǎng)鏈(C₁₂、C₁₄、C₁₈)的脂族正-烷基殘基可以用于增加標(biāo)記物-pppRNA產(chǎn)物在RP-HPLC純化過(guò)程中的停留時(shí)間，使得能與不含標(biāo)記物的雜質(zhì)有效分離。通過(guò)改變步驟8：制備正-烷基胺(正-十二烷基胺、正-十四烷基胺或正-十八烷基胺)在干CH₂Cl₂中的0.1M溶液并且使2mL溶液接觸柱子中的支持物，按照實(shí)施例1中所述的程序，可以制備正-十二烷基-NH-pppRNA、正-十四烷基-NH-pppRNA和正-十八烷基-NH-pppRNA。推動(dòng)烷基胺溶液反復(fù)通過(guò)支持物。3小時(shí)的接觸時(shí)間后，需要用2mL CH₂Cl₂的再一個(gè)洗滌步驟，接著繼續(xù)下一個(gè)工作步驟。

分析數(shù)據(jù)：

*20分鐘內(nèi)PRP-1柱0-100％B(A＝100mM三乙基碳酸氫銨，B＝100mM TEAB 80％MeOH)

圖11顯示了pppRNA和具有增加鏈長(zhǎng)的烷基殘基的正-烷基-NH-pppRNA的RP-HPLC分析。