本發(fā)明涉及重組基因技術(shù)領域，尤其是涉及一種表面展示多肽的病毒樣顆粒、其制備方法及其應用。

背景技術(shù)：

多肽已被用于疾病的診斷及治療領域。多肽作為抗原可以用于病毒、細菌、支原體、螺旋體等微生物的檢測，用其制備的檢測試劑檢測抗體的假陰性率和本底反應都很低，易于臨床應用。此外，多肽已被用于多種疾病的治療，如戈那瑞林為人工合成的促性腺激素釋放素，屬肽類化合物，為十肽，可用作促排卵藥。

多肽的不穩(wěn)定及制備成本高的問題大大限制了其在臨床及研究中的應用?，F(xiàn)在，提高多肽穩(wěn)定性的方法主要有：化學修飾、轉(zhuǎn)換氨基酸構(gòu)型等。這些方法在一定程度上解決了多肽不穩(wěn)定的問題，但是仍不能解決多肽生產(chǎn)成本高的問題。研究表明，用噬菌體作為載體展示多肽能有效解決多肽不穩(wěn)定及生產(chǎn)成本高的問題。

噬菌體展示肽庫技術(shù)的發(fā)展則為發(fā)現(xiàn)和表征新的配體及對應受體提供了有力的工具，不僅有望實現(xiàn)臨床應用于腫瘤的靶向治療，也有助于解釋疾病發(fā)生機制的理論研究。傳統(tǒng)的噬菌體展示技術(shù)選用dna噬菌體作為載體，通過將特定目的基因片段插入噬菌體基因組中而實現(xiàn)將特定的多肽或蛋白展示在噬菌體表面的目的。但是，在噬菌體展示技術(shù)中使用的噬菌體仍保留了其完整的基因組，所以應用該技術(shù)制備的噬菌體樣顆粒安全性影響了其在臨床中的應用。

研究表明，rna噬菌體同樣可以用于展示多肽，且僅將多肽編碼序列插入到其衣殼蛋白基因中即可實現(xiàn)多肽的展示，且不影響噬菌體樣顆粒的組裝。與以dna噬菌體樣顆粒相比較，以rna噬菌體作為載體時，僅選用噬菌體的衣殼蛋白基因，而不是整個基因組，所以不存在整合到人基因組中的可能，安全性更高。

peabody等發(fā)現(xiàn)，rna噬菌體━pp7噬菌體衣殼蛋白可用于展示任意氨基酸構(gòu)成的八肽或十肽。但是，在實際應用過程中，pp7噬菌體衣殼蛋白并不能展示所有任意氨基酸構(gòu)成(小于50個氨基酸)的多肽。對此，我們基于欲展示多肽的特點，通過對多肽進行修飾實現(xiàn)了任意氨基酸構(gòu)成(小于50個氨基酸)的多肽展示。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)不足，提出一種生產(chǎn)成本低，穩(wěn)定性好，產(chǎn)量高的表面展示多肽的病毒樣顆粒。

為達到上述技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種表面展示多肽的病毒樣顆粒，包括噬菌體病毒樣顆粒、多肽和修飾序列，所述多肽展示在所述噬菌體病毒樣顆粒上，所述修飾序列是對所述多肽進行修飾的氨基酸序列，修飾后的多肽為(gan)n(nnn)m(gan)n，其中，所述(gan)n(nnn)m(gan)n的合計等電點<5，所述n為a、t、c或g，終止密碼子除外。

n為個數(shù)，該個數(shù)主要與插入多肽的等電點有關(guān)，當(gan)n(nnn)m(gan)n合計等電點<5時，即可被該展示載體展示出來，并且插入多肽的等電點與病毒樣顆粒的產(chǎn)量之間有一定關(guān)系。

作為一種改進，所述多肽插入在所述噬菌體病毒樣顆粒的衣殼蛋白二聚體的第二個衣殼蛋白編碼序列的限制性酶切位點kpni之后。(見圖1)

作為一種改進，所述噬菌體病毒樣顆粒為pp7噬菌體病毒樣顆粒。所述噬菌體病毒樣顆粒還可以是其他噬菌體，如ms2，r17，fr，ga，qβ，sp，m11，mx1，f4，cb5，cb12r，cb23r，7s，f2等。

作為一種改進，1≤m≤50。所述噬菌體病毒樣顆?？梢哉故镜亩嚯牡陌被釘?shù)量為1-50個(不含修飾多肽的氨基酸數(shù)量)。

作為一種改進，所述多肽為tat多肽、a6多肽、戈那瑞林、atn-161多肽、pep2-klak多肽或pap114-128多肽。

一種表面展示多肽的病毒樣顆粒的制備方法，包括以下步驟：

(1)檢測多肽的等電點，在所述多肽的兩端分別添加酸性氨基酸以對所述多肽進行修飾，使修飾后的多肽的等電點<5；

(2)將修飾后的多肽的編碼序列通過重疊pcr技術(shù)插入到噬菌體病毒樣顆粒的衣殼蛋白二聚體的第二個衣殼蛋白編碼序列的限制性酶切位點kpni之后，得pcr產(chǎn)物；

(3)選用質(zhì)粒載體，對所述pcr產(chǎn)物和所述質(zhì)粒載體分別進行雙酶切，得pcr酶切產(chǎn)物和質(zhì)粒酶切載體，將所述pcr酶切產(chǎn)物和質(zhì)粒酶切載體進行于16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入dh5α感受態(tài)細胞，得到重組表達質(zhì)粒；

(4)將所述重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌bl21(de3)中，挑取單克隆菌落接種于lb培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm條件下進行搖床培養(yǎng)12h，得到一級培養(yǎng)液，再將所述一級培養(yǎng)液接種于lb培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm條件下進行搖床培養(yǎng)至a600達到0.7～0.8，加入誘導劑，在37℃下誘導反應8h，驗證，再用凝膠過濾層析純化，即得。

作為一種改進，所述誘導劑為1mmol/l的異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷。

作為一種改進，所述質(zhì)粒載體為petduet-1。

本發(fā)明的另一目的在于：提供一種疫苗，所述疫苗的活性成分為所述的表面展示多肽的病毒樣顆粒。

本發(fā)明提供的表面展示多肽的病毒樣顆粒，其成本低廉，制備周期較短，操作方便，其展示的多肽較好的保留其原有的生物學活性，且穩(wěn)定性好，由此制備出的病毒樣顆粒產(chǎn)量高，且產(chǎn)品性質(zhì)均一、穩(wěn)定。

附圖說明

圖1是攜帶有多肽的pp7噬菌體衣殼蛋白二聚體編碼基因構(gòu)成；

圖2是菌落pcr篩選攜帶petduet-2pp7-tat-modi質(zhì)粒的陽性菌落結(jié)果；

圖3是tat多肽修飾前后的測序結(jié)果；

圖4和圖5是sds-page結(jié)果驗證攜帶不同多肽的pp7噬菌體樣顆粒的表達情況；

圖6是透射電鏡驗證2pp7-tat-modivlps和2pp7-pep2-klak-modivlps的組裝情況；；

圖7是激光共聚焦顯微鏡驗證2pp7-tat-modivlps的穿膜效果。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實施例1

tat多肽編碼序列：

修飾前：tatggtcgtaaaaaacgccgacagcgtcgccga。

修飾后：gaggacggtgaagatggcgaggactatggtcgtaaaaaacgccgacagcgtcgccgagacgagggggacgat。

實施例2

a6多肽編碼序列

修飾前：aaacctagctcgcctccggaagag。

修飾后：gaagacaaacctagctcgcctccggaagag。

實施例3

戈那瑞林編碼序列

修飾前：gaacactggtcgtacggcctgcgtccgggt。

修飾后：gaggatgaacactggtcgtacggcctgcgtccgggtgaggat。

實施例4

atn-161多肽編碼序列

修飾前：ccgcactcgtgcaac。

修飾后：gaagacccgcactcgtgcaacgaagac。

實施例5

pep2-klak多肽編碼序列

修飾前：catctctatgttagtccttggggcggtaaactcgccaaacttgctaaaaagcttgccaaactcgctaaa。

修飾后：gaggatgaagacgaagatcatctctatgttagtccttggggcggtaaactcgccaaacttgctaaaaagcttgccaaactcgctaaagatgac。

實施例6

pap114-128多肽編碼序列

修飾前：atgagcgccatgaccaatctcgctgccctttttcctcctgaaggc。

修飾后：gagatgagcgccatgaccaatctcgctgccctttttcctcctgaaggcgaa。

實施例7

表面展示tat多肽的pp7病毒樣顆粒

材料：大腸桿菌菌株[top10和bl21(de3)]均購自北京天根生物技術(shù)公司；pp7噬菌體衣殼蛋白基因(petduet-1pp7)和質(zhì)粒petduet-2pp7由濰坊醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學系保存；kpni、xhoi、primerstarhsdna聚合酶、dntp、t4dna連接酶、dna膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自大連takara公司；bio-gela-1.5m凝膠購自bio-rad公司；reddye購自英濰捷基公司；fitc購自美國sigma公司；dapi購自碧云天公司。

(1)tat多肽的修飾(修飾結(jié)果見實施例1)

(2)引物設計與合成根據(jù)pp7衣殼蛋白基因序列以及原核表達載體petduet-1的特性，設計引物的合成見表1：

表1引物序列及功能

(3)pp7-tat和pp7-tat-modi片段的pcr擴增

以petduet-pp7質(zhì)粒為模板，以2pp7-tat或2pp7-tat-modi為上游引物，以pp7-r為下游引物，以primerstarhs為dna聚合酶進行pcr，將獲得的pcr片段用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用dna膠回收試劑盒回收。

(4)petduet-2pp7-tat和petduet-2pp7-tat-modi表達載體的構(gòu)建與鑒定

按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取petduet-2pp7質(zhì)粒，然后用kpni和xhoi對膠回收獲得的pcr產(chǎn)物和petduet-2pp7載體分別進行雙酶切，酶切產(chǎn)物分別進行膠回收，然后用t4dna連接酶將酶切的pcr產(chǎn)物和petduet-2pp7質(zhì)粒于16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入e.colidh5α感受態(tài)細胞。挑取單克隆接種入含100μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)6h，然后進行菌落pcr鑒定，將pcr擴增為陽性的菌落進行測序。

為驗證pp7衣殼蛋白單鏈二聚體基因片段是否和載體連接成功，首先用pcr篩選出含petduet-2pp7-tat或petduet-2pp7-tat-modi質(zhì)粒的陽性菌落(圖2)。圖2中，m是指dl2000dnamarker；1～5是指含petduet-2pp7-tat-modi質(zhì)粒的不同菌落的pcr鑒定結(jié)果；6～10是指含petduet-2pp7-tat質(zhì)粒的不同菌落的pcr鑒定結(jié)果。

接著用測序法驗證petduet-2pp7-tat-modi質(zhì)粒中插入的tat-modi片段的準確性，其結(jié)果見圖3，圖3中a是指修飾前的tat多肽編碼序列測序結(jié)果；b是指修飾后的tat多肽編碼序列測序結(jié)果，結(jié)果表明兩種質(zhì)粒均構(gòu)建成功。

(5)pp7vlp的表達及鑒定

將測序正確的petduet-2pp7-tat和petduet-2pp7-tat-modi質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入e.colibl21(de3)，挑取單克隆菌落接種于5ml含100μg/ml氨芐青霉素的液體lb培養(yǎng)基中，37℃、200rpm搖床培養(yǎng)12h。取5ml接種到500ml含100μg/ml氨芐青霉素的液體lb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至a600值為0.7～0.8時，加入終濃度為1mmol/liptg于37℃誘導8h，4℃、12000rpm離心2min。收集沉淀，將其用超聲緩沖液重懸，用超聲破碎儀裂解，然后于4℃、12000rpm離心10min，收集上清后行sds-page驗證。接著用bio-gela-1.5m凝膠過濾層析純化獲得純的2pp7-tatvlp和2pp7-tat-modivlp，并用透射電鏡進行鑒定。

將重組表達質(zhì)粒petduet-2pp7-tat和petduet-2pp7-tat-modi分別導入e.colibl21(de3)誘導表達，sds-page后進行考馬斯亮藍染色。結(jié)果顯示，在37℃、1mmol/liptg誘導6h，在相對分子質(zhì)量35kda左右有一明顯的外源蛋白條帶(見圖4和圖5)。圖4中，1.tat修飾前；2.tat修飾后；3.pep2-klak修飾后；4.pep2-klak修飾前；5.a6多肽修飾前；6.a6多肽修飾后；7.戈那瑞林多肽修飾后；8.戈那瑞林多肽修飾前；m.蛋白marker。圖5中，1.atn-161修飾前；2.atn-161修飾后；3.pap114-128修飾前；4.pap114-128修飾后；m.蛋白marker。結(jié)果顯示，在tat修飾前組和pep2-klak修飾前組均未見到明顯的目的條帶；而在其相對應的修飾后組均有明顯的條帶出現(xiàn)；對于a6、戈那瑞林、atn-161這4種多肽而言，修飾后比修飾前蛋白表達量明顯上升；對于pap114-128多肽來說，修飾前后蛋白表達量無明顯差異性，原因是pap114-128修飾前的等電點已經(jīng)小于5。

同時，透射電鏡結(jié)果顯示，攜帶修飾的tat和pep-klak多肽的pp7衣殼蛋白二聚體均能組裝成直徑約為30nm的vlps(見圖6)。

(6)2pp7-tat-modivlps穿膜實驗

根據(jù)sigma公司的異硫氰酸酯(fitc)說明書，將透析袋置于含0.1mg/mlfitc的ph9.0的新鮮配制的碳酸鹽緩沖液中，4℃攪拌過夜。然后用bio-gela-1.5m凝膠過濾層析純化獲得純的fitc標記的2pp7-tat-modivlps，并對其熒光效率進行檢測。取10nmfitc標記的2pp7-tat-modivlps加入到小鼠前列腺癌細胞系rm-1中，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,用熒光共聚焦顯微鏡觀察細胞中的熒光(見圖7)。在24h后，細胞質(zhì)及細胞核中均能看到比較明顯的綠色熒光，說明2pp7-tat-modivlps有較高的穿膜效率，進一步表明2pp7-tat-modivlps表面展示的tat保留了其原有的穿膜功能。

以上所述本發(fā)明的具體實施方式，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護范圍的限定。任何根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思所做出的各種其他相應的改變與變形，均應包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。