本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種從骨髓中提取免疫細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
：骨髓是人重要的免疫器官，含有大量的免疫細(xì)胞，在臨床應(yīng)用過程中，常見的問題是很難保證提供足夠數(shù)量的免疫細(xì)胞。目前主要是利用低溫凍存技術(shù)保存免疫細(xì)胞，在需要時(shí)復(fù)蘇并誘導(dǎo)培養(yǎng)為各種免疫細(xì)胞。但在分離、凍存過程中，會(huì)對(duì)單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，甚至毒性，尤其是凍存過程中會(huì)顯著改變細(xì)胞的熱力學(xué)、化學(xué)和物理環(huán)境，同時(shí)伴隨生物性損傷的危險(xiǎn)。另一方面，骨髓中含有較多的脂肪，影響分離效果，不能獲得足夠的免疫細(xì)胞，再加上凍存過程中對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損傷，使免疫細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率不高。細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率通常在70％-90％之間。細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率可能會(huì)受到細(xì)胞采集、分離、凍存等過程的影響。因此，為提供足夠量的淋巴細(xì)胞，現(xiàn)有技術(shù)中細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率仍需進(jìn)一步提高，同時(shí)也應(yīng)避免回輸給患者時(shí)出現(xiàn)惡心、嘔吐或過敏等不良反應(yīng)，提高安全性。現(xiàn)有技術(shù)中，常規(guī)的ficoll400分離液對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性，不利于臨床應(yīng)用。因此，有必要提供一種能夠有效提高免疫細(xì)胞分離率和細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率、提高回輸?shù)交颊叩募?xì)胞的安全性的提取方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種從骨髓中提取免疫細(xì)胞的方法,該方法能夠有效提高免疫細(xì)胞分離率和細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率，提高回輸?shù)交颊叩募?xì)胞的安全性。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種從骨髓中提取免疫細(xì)胞的方法，包括如下步驟：（1）采集人骨髓，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%-14％胎牛血清的α-mem培養(yǎng)液稀釋2-4倍，200-400rpm轉(zhuǎn)速下離心2-4min，棄上清和脂肪層，得到骨髓細(xì)胞；（2）將人體外周血移入離心管中，500-700rpm轉(zhuǎn)速下離心5-9min，吸取上層血漿備用，下層細(xì)胞用于分離外周血淋巴細(xì)胞；所述骨髓細(xì)胞中加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%-14％所述上層血漿的α-mem培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液；（3）將分離液加入到離心管中；再將所述細(xì)胞懸液平鋪到所述分離液上，600-800rpm轉(zhuǎn)速下離心10-20min，吸取白膜層細(xì)胞獲得免疫細(xì)胞；（4）將免疫細(xì)胞等體積加入到免疫細(xì)胞凍存液中混合均勻，得到細(xì)胞重懸液，將細(xì)胞重懸液分裝入凍存袋中，再將凍存袋裝入凍存袋盒中，進(jìn)行程序降溫至-78～-82℃后轉(zhuǎn)至-196℃液氮罐凍存。優(yōu)選的，所述步驟（2）中，細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度為4×105-8×105個(gè)/ml。優(yōu)選的，所述步驟（3）中，分離液的制備方法為：將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐1-3重量份，海藻糖1-2重量份，超低粘度海藻酸鈉1-2重量份，泛影葡胺3-5重量份和聚二烯丙基二甲基氯化銨0.4-0.8重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經(jīng)過0.22μm濾膜過濾制得分離液。本發(fā)明采用的右旋糖酐是一種分支化的葡聚糖，其通過一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和變形鏈球菌。臨床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血漿代用品；海藻糖又稱漏蘆糖、蕈糖等，是一種安全、可靠的天然糖類；由兩個(gè)葡萄糖分子以1,1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，對(duì)多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用，對(duì)單個(gè)核細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用；超低粘度海藻酸鈉具有較低的粘度，較多的羥基有助于免疫細(xì)胞的分離；聚二烯丙基二甲基氯化銨為強(qiáng)陽離子聚電解質(zhì)有助于免疫細(xì)胞的分離；本發(fā)明的分離液中的各組分配比合理從而起到良好的分離效果。優(yōu)選的，所述步驟（3）中，分離液的密度為1.050-1.070g/cm3，滲透壓為250-270smol/kg，ph為7-8，粘度為1.0-3.0cp。優(yōu)選的，所述步驟（4）中，免疫細(xì)胞凍存液包括如下組分：二甲基亞砜4-8ml右旋糖酐2-6ml細(xì)胞培養(yǎng)基10-30ml人血清白蛋白1-5ml人自體血漿60-100ml。所述二甲基亞砜為sigma型號(hào)為472301的二甲基亞砜。二甲基亞砜能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，降低溶液的冰點(diǎn)，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。右旋糖酐可以維持滲透壓和ph值，提供適宜細(xì)胞存活的介質(zhì)環(huán)境。本發(fā)明采用在免疫細(xì)胞凍存液中添加人血白蛋白作為細(xì)胞凍存穩(wěn)定劑使用，有利于在冷凍復(fù)蘇過程中調(diào)節(jié)滲透壓，對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用好，并且凍存液成本低，可進(jìn)一步提高凍存細(xì)胞的存儲(chǔ)穩(wěn)定性，避免由于細(xì)胞存儲(chǔ)供者血質(zhì)問題導(dǎo)致過程儲(chǔ)存活性不穩(wěn)定或細(xì)胞復(fù)蘇率下降。本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液通過采用上述原料，并嚴(yán)格控制各原料的重量配比，制得的免疫細(xì)胞凍存液能有效保護(hù)免疫細(xì)胞免受冷凍損傷，安全性高，對(duì)細(xì)胞的損傷小，可以提高免疫細(xì)胞的復(fù)蘇成活率，復(fù)蘇后的成活率可以達(dá)到96%以上，且復(fù)蘇后細(xì)胞活率高、細(xì)胞增殖數(shù)量大、細(xì)胞不易老化，并保證了免疫細(xì)胞復(fù)蘇后的生理功能和生物學(xué)特性，微生物檢測(cè)指標(biāo)符合要求，延長(zhǎng)了免疫細(xì)胞的存活期，減少了免疫細(xì)胞表面抗原的丟失。優(yōu)選的，所述細(xì)胞培養(yǎng)基為x-vivo15培養(yǎng)基、aim-v培養(yǎng)基、dmem/f12培養(yǎng)基、rpmi-1640培養(yǎng)基、gt-t551培養(yǎng)基、gt-t561培養(yǎng)基和stemspan培養(yǎng)基中的任意一種。所述細(xì)胞培養(yǎng)基的種類為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的細(xì)胞培養(yǎng)基即可，并無特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為x-vivo15培養(yǎng)基、aim-v培養(yǎng)基、dmem/f12培養(yǎng)基或rpmi-1640培養(yǎng)基。aim-v培養(yǎng)基購于美國invitrogen公司，其中主要含有l(wèi)-谷氨酰胺、硫酸鏈霉素和硫酸慶大霉素等，用以保持免疫細(xì)胞活性，使得免疫細(xì)胞復(fù)蘇后能夠維持其細(xì)胞活性，并延長(zhǎng)免疫細(xì)胞存活期。細(xì)胞培養(yǎng)基具有保持細(xì)胞滲透壓、酸堿平衡體系和提供營(yíng)養(yǎng)等作用。優(yōu)選的，所述人自體血漿的制備方法為：將人體外周血置于無菌離心管中，1500-2000rpm轉(zhuǎn)速下離心4-8min，取上層血漿在56-60℃溫度下滅活28-32min后，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，2500-3500rpm轉(zhuǎn)速下離心15-25min，吸取上清，即為凍存用人自體血漿。人自體血漿為營(yíng)養(yǎng)保護(hù)劑，其中包括血清蛋白、葡萄糖、無機(jī)鹽離子、胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素，類固醇激素等，不僅能夠?yàn)槊庖呒?xì)胞提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。本發(fā)明的細(xì)胞凍存液添加人自體血漿，人自體血漿與血清成分相似，亦含有免疫細(xì)胞生長(zhǎng)所需的各種細(xì)胞因子及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且屬于免疫細(xì)胞分離的副產(chǎn)物，方便獲取，不存在異源性，避免了外源血清存在的安全隱患。本發(fā)明中所述免疫細(xì)胞凍存液中含有的重組人白介素-2和人自體血漿具有顯著的協(xié)同作用，可以顯著提高免疫細(xì)胞的活性和復(fù)蘇后的存活率。本發(fā)明所述免疫細(xì)胞凍存液中采用人自體血漿作為血清替代物，不含有動(dòng)物血清，因此不會(huì)引入外源蛋白，降低了動(dòng)物病原污染的可能性，也不會(huì)對(duì)人體過繼免疫治療產(chǎn)生影響。優(yōu)選的，所述免疫細(xì)胞凍存液還包括糖類1-3g，所述糖類是由海藻糖、α-1,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:0.8-1.2：1.5-2.5：2-4組成的混合物。本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液通過采用海藻糖，可以減少二甲基亞砜的使用，保證細(xì)胞在接近冰點(diǎn)時(shí)胞內(nèi)的水分不會(huì)結(jié)晶，能有效的保護(hù)細(xì)胞，并有效降低細(xì)胞毒性。本發(fā)明添加α-1,4-葡聚糖能夠有效的降低凍存、復(fù)蘇中細(xì)胞的損傷，并能夠保證復(fù)蘇后細(xì)胞增殖的活力。本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液通過采用香菇多糖和葡萄糖，可以保證復(fù)蘇后細(xì)胞增殖活力不受影響。優(yōu)選的，所述免疫細(xì)胞凍存液還包括非必須氨基酸0.2-0.6g和維生素c0.1-0.5g。所述非必須氨基酸為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的非必須氨基酸即可，并無特殊的限制，本發(fā)明優(yōu)選為多種非必需氨基酸組合而成，更優(yōu)選為購買自gibco試劑的非必須氨基酸。本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液通過采用非必須氨基酸和維生素c，可以保證復(fù)蘇后細(xì)胞增殖活力不受影響。優(yōu)選的，所述免疫細(xì)胞凍存液還包括丙二醇0.2-0.6ml和聚乙二醇0.4-0.8ml。本發(fā)明在免疫細(xì)胞凍存液中添加聚乙二醇和1,2-丙二醇，可以替代現(xiàn)用的二甲基亞砜為基礎(chǔ)的凍存液，減少二甲基亞砜的用量，有效降低其對(duì)細(xì)胞毒性，維持細(xì)胞穩(wěn)定性，提高復(fù)蘇后直接應(yīng)用的安全性，適合用于細(xì)胞凍存復(fù)蘇后直接應(yīng)用。優(yōu)選的，所述免疫細(xì)胞凍存液還包括重組人白介素4000-8000u。所述重組人白介素可以采用注射用重組人白介素-2。通常，外周血的t細(xì)胞、b細(xì)胞和nk細(xì)胞膜表面均存在白介素-2(il-2)受體，il-2與其受體結(jié)合后可以調(diào)節(jié)該細(xì)胞的增生，調(diào)節(jié)免疫球蛋白的生成；促進(jìn)t細(xì)胞、b細(xì)胞和nk細(xì)胞的增殖、分化并能提高nk細(xì)胞的殺傷活性。然而，目前主要是將il-2作為體外刺激培養(yǎng)物用于免疫細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)，而本發(fā)明采用將重組人白介素-2(il-2)添加到免疫細(xì)胞凍存液中，可大幅度提高所述免疫細(xì)胞的活性穩(wěn)定性，使其保持原有細(xì)胞高活性，從而使免疫細(xì)胞很好地保持了細(xì)胞復(fù)蘇后的生理功能和生物學(xué)特性，可有效解決細(xì)胞復(fù)蘇后直接應(yīng)用和進(jìn)一步擴(kuò)展的關(guān)鍵問題。本發(fā)明添加重組人白介素-2能夠有效維持細(xì)胞的活性，保證細(xì)胞復(fù)蘇后正常的生物學(xué)功能。優(yōu)選的，所述免疫細(xì)胞凍存液還包括白酒草皂苷r0.3-0.7g和勃脈力a0.8-1.2g。本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液通過采用白酒草皂苷r與二甲基亞砜結(jié)合制備免疫細(xì)胞的凍存液，可以降低二甲基亞砜的使用量，這種凍存液對(duì)凍存細(xì)胞有較好的保護(hù)作用，凍存細(xì)胞復(fù)蘇后依然保持良好的細(xì)胞活力，細(xì)胞回收率高。本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液通過采用勃脈力a，可以維持電解質(zhì)平衡，使細(xì)胞處于一種比較溫和的更接近于體內(nèi)環(huán)境的溶液中。優(yōu)選的，所述免疫細(xì)胞凍存液還包括青霉素-鏈霉素雙抗溶液0.1-0.5ml和氯化鈉0.4-0.8g。所述青霉素和鏈霉素雙抗溶液為gibco青霉素和鏈霉素雙抗溶液gibco青霉素和鏈霉素雙抗溶液每毫升包含10000單位青霉素（堿）和10000μg鏈霉素（堿），利用0.85%鹽液形式的青霉素g（鈉鹽）和硫酸鏈霉素，其抗菌譜包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌。青霉素和鏈霉素雙抗溶液可保證細(xì)胞儲(chǔ)存過程中處于無菌狀態(tài)，且對(duì)免疫細(xì)胞無不良影響，安全可靠。本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液通過采用氯化鈉，可以維持電解質(zhì)平衡，使細(xì)胞處于一種比較溫和的更接近于體內(nèi)環(huán)境的溶液中。優(yōu)選的，所述步驟（4）中，細(xì)胞重懸液的細(xì)胞密度為5×106-5×107個(gè)/ml。優(yōu)選的，所述步驟（4）中，程序降溫先以1-2℃/min的降溫速度降溫至-23～-27℃，再以5-7℃/min的降溫速度降溫至-78～-82℃。優(yōu)選的，所述步驟（4）之后還包括步驟（5）將液氮凍存的免疫細(xì)胞復(fù)蘇后，用cik細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，加入到已預(yù)先用抗cd3單抗和重組人纖維連接蛋白包被好的培養(yǎng)容器中，添加包裹有ifn-γ因子的緩釋微囊；然后置于溫度為36-38℃、co2濃度為4%-6%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18d。優(yōu)選的，所述抗cd3單抗培養(yǎng)前的終濃度為2-5μg/ml，重組人纖維連接蛋白培養(yǎng)前的終濃度為8-12μg/ml，添加ifn-γ因子的終濃度為500-900iu/ml。優(yōu)選的，所述緩釋微囊包括以下質(zhì)量百分比的組分：ifn-γ因子6-8%、肝素2-4%、海藻酸鈉8-12%、碳酸鋅0.4-0.8%，余量為生物相容性聚合物。海藻酸鈉為一種天然多糖，具良好的穩(wěn)定性、溶解性、粘性和安全性，可作為ifn-γ因子依附的載體，具有羧基，是β-d-甘露糖醛酸的醛基以苷鍵形成的高聚糖醛酸，親水性強(qiáng)，能形成非常粘稠的均勻的溶液。具有其他類似物難于獲得的柔軟性、均一性及其他優(yōu)良特性。ifn-γ是具有多種功能的活性蛋白質(zhì)在同種細(xì)胞上具有廣譜的抗病毒、影響細(xì)胞生長(zhǎng)，以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。肝素是一種抗凝劑，是由二種多糖交替連接而成的多聚體，可作為ifn-γ穩(wěn)定劑。碳酸鋅可促進(jìn)分化淋巴細(xì)胞和細(xì)胞免疫功能，并可與肝素，提高ifn-γ穩(wěn)定性。本發(fā)明將ifn-γ因子加入緩釋微囊制備液中，利用其緩釋特性使ifn-γ因子在培養(yǎng)基中能夠持續(xù)平穩(wěn)釋放，提高工作效率、降低成本使免疫細(xì)胞平穩(wěn)擴(kuò)增，可5-7天添加一次。傳統(tǒng)方法將ifn-γ因子直接添加到培養(yǎng)基中，ifn-γ因子濃度減少過快，濃度差異大，需頻繁添加，且工作效率低，影響細(xì)胞增殖速率和細(xì)胞性狀的穩(wěn)定性。用于制作微囊的囊材包括海藻酸鹽、多聚賴氨酸、殼聚糖、2-甲基丙烯酸、羥乙基甲基丙烯酸酯、甲基丙二酸鹽、瓊脂糖，聚丙烯胺及羥甲基纖維素等；在本發(fā)明中，優(yōu)先采用殼聚糖或海藻酸鹽-聚賴氨酸制作微囊，這兩種材料不僅來源方便，而且無生物毒性及免疫原性，制作而成的微囊的膜具有良好的生物相容性、通透性，以及較強(qiáng)的機(jī)械穩(wěn)定性，為免疫細(xì)胞提供一個(gè)穩(wěn)定的三維附著空間，此外，在細(xì)胞經(jīng)凍存-復(fù)蘇后，可起到免疫隔離屏障的作用，能夠降低免疫細(xì)胞移植引起的免疫排斥反應(yīng)。本發(fā)明將免疫細(xì)胞包裹于囊材中形成直徑數(shù)十微米至數(shù)百微米的微囊，由于免疫細(xì)胞的貼壁性，因此微囊為免疫細(xì)胞提供了一個(gè)良好的附著基質(zhì)，使免疫細(xì)胞相互接觸形成一種三維結(jié)構(gòu)；此外，該微囊能夠防止生物大分子和細(xì)胞從微囊中逸出，而小分子物質(zhì)、培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、細(xì)胞凍存液及代謝物可以自由出入微囊，達(dá)到培養(yǎng)和凍存的目的等。所述生物相容性聚合物為聚乳酸（pla）、聚己內(nèi)酯（pcl）、聚羥基乙酸（plga）、聚乳酸-聚乙二醇（pla-peg）或聚羥基乙酸-聚乙二醇（plga-peg）中的一種或幾種。上述組分為生物相容性材料，具有環(huán)境友好性和良好的緩釋效果。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明可以使用外周血的自體血漿用于骨髓免疫細(xì)胞的分離、凍存，外周血的下層細(xì)胞也可以用來分離淋巴細(xì)胞用于提高患者免疫力；本發(fā)明從預(yù)處理到分離再到凍存均選用符合靜注級(jí)原料藥標(biāo)準(zhǔn)的原料，原料不確定性小，安全性高；本發(fā)明使用外周血的上層血漿用于骨髓細(xì)胞的懸浮液制備，并作為凍存液的一部分，有效減少回輸過程的免疫排斥應(yīng)；本發(fā)明的分離液對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行離心處理后，免疫細(xì)胞在分離介質(zhì)和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細(xì)胞條帶。本發(fā)明的方法能夠有效提高免疫細(xì)胞分離率和細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率，提高回輸?shù)交颊叩募?xì)胞的安全性。具體實(shí)施方式為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，實(shí)施方式提及的內(nèi)容并非對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例1一種從骨髓中提取免疫細(xì)胞的方法，包括如下步驟：（1）采集人骨髓，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的α-mem培養(yǎng)液稀釋2倍，200rpm轉(zhuǎn)速下離心4min，棄上清和脂肪層，得到骨髓細(xì)胞；（2）將人體外周血移入離心管中，500rpm轉(zhuǎn)速下離心9min，吸取上層血漿備用，下層細(xì)胞用于分離外周血淋巴細(xì)胞；所述骨髓細(xì)胞中加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%所述上層血漿的α-mem培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液；（3）將分離液加入到離心管中；再將所述細(xì)胞懸液平鋪到所述分離液上，600rpm轉(zhuǎn)速下離心20min，吸取白膜層細(xì)胞獲得免疫細(xì)胞；（4）將免疫細(xì)胞等體積加入到免疫細(xì)胞凍存液中混合均勻，得到細(xì)胞重懸液，將細(xì)胞重懸液分裝入凍存袋中，再將凍存袋裝入凍存袋盒中，進(jìn)行程序降溫至-78℃后轉(zhuǎn)至-196℃液氮罐凍存。所述步驟（2）中，細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度為4×105個(gè)/ml。所述步驟（3）中，分離液的制備方法為：將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐1重量份，海藻糖1重量份，超低粘度海藻酸鈉1重量份，泛影葡胺3重量份和聚二烯丙基二甲基氯化銨0.4重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經(jīng)過0.22μm濾膜過濾制得分離液。所述步驟（3）中，分離液的密度為1.050g/cm3，滲透壓為250smol/kg，ph為7，粘度為1.0cp。所述步驟（4）中，免疫細(xì)胞凍存液包括如下組分：二甲基亞砜4ml右旋糖酐2ml細(xì)胞培養(yǎng)基10ml人血清白蛋白1-ml人自體血漿60ml。所述步驟（4）中，細(xì)胞重懸液的細(xì)胞密度為5×106個(gè)/ml。所述步驟（4）中，程序降溫先以1℃/min的降溫速度降溫至-23℃，再以5℃/min的降溫速度降溫至-78℃。所述步驟（4）之后還包括步驟（5）將液氮凍存的免疫細(xì)胞復(fù)蘇后，用cik細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，加入到已預(yù)先用抗cd3單抗和重組人纖維連接蛋白包被好的培養(yǎng)容器中，添加包裹有ifn-γ因子的緩釋微囊；然后置于溫度為36℃、co2濃度為4%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16d。所述抗cd3單抗培養(yǎng)前的終濃度為2μg/ml，重組人纖維連接蛋白培養(yǎng)前的終濃度為8μg/ml，添加ifn-γ因子的終濃度為500iu/ml。所述緩釋微囊包括以下質(zhì)量百分比的組分：ifn-γ因子6%、肝素2%、海藻酸鈉8%、碳酸鋅0.4%，余量為生物相容性聚合物。實(shí)施例2一種從骨髓中提取免疫細(xì)胞的方法，包括如下步驟：（1）采集人骨髓，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11％胎牛血清的α-mem培養(yǎng)液稀釋2.5倍，250rpm轉(zhuǎn)速下離心3.5min，棄上清和脂肪層，得到骨髓細(xì)胞；（2）將人體外周血移入離心管中，550rpm轉(zhuǎn)速下離心8min，吸取上層血漿備用，下層細(xì)胞用于分離外周血淋巴細(xì)胞；所述骨髓細(xì)胞中加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11％所述上層血漿的α-mem培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液；（3）將分離液加入到離心管中；再將所述細(xì)胞懸液平鋪到所述分離液上，650rpm轉(zhuǎn)速下離心18min，吸取白膜層細(xì)胞獲得免疫細(xì)胞；（4）將免疫細(xì)胞等體積加入到免疫細(xì)胞凍存液中混合均勻，得到細(xì)胞重懸液，將細(xì)胞重懸液分裝入凍存袋中，再將凍存袋裝入凍存袋盒中，進(jìn)行程序降溫至-79℃后轉(zhuǎn)至-196℃液氮罐凍存。所述步驟（2）中，細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml。所述步驟（3）中，分離液的制備方法為：將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐1.5重量份，海藻糖1.2重量份，超低粘度海藻酸鈉1.2重量份，泛影葡胺3.5重量份和聚二烯丙基二甲基氯化銨0.5重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經(jīng)過0.22μm濾膜過濾制得分離液。所述步驟（3）中，分離液的密度為1.055g/cm3，滲透壓為255smol/kg，ph為7.5，粘度為1.5cp。所述步驟（4）中，免疫細(xì)胞凍存液包括如下組分：二甲基亞砜5ml右旋糖酐3ml細(xì)胞培養(yǎng)基15ml人血清白蛋白2ml人自體血漿70ml。所述步驟（4）中，細(xì)胞重懸液的細(xì)胞密度為8×106個(gè)/ml。所述步驟（4）中，程序降溫先以1.5℃/min的降溫速度降溫至-24℃，再以6℃/min的降溫速度降溫至-79℃。所述步驟（4）之后還包括步驟（5）將液氮凍存的免疫細(xì)胞復(fù)蘇后，用cik細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，加入到已預(yù)先用抗cd3單抗和重組人纖維連接蛋白包被好的培養(yǎng)容器中，添加包裹有ifn-γ因子的緩釋微囊；然后置于溫度為37℃、co2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)17d。所述抗cd3單抗培養(yǎng)前的終濃度為3μg/ml，重組人纖維連接蛋白培養(yǎng)前的終濃度為9μg/ml，添加ifn-γ因子的終濃度為600iu/ml。所述緩釋微囊包括以下質(zhì)量百分比的組分：ifn-γ因子6.5%、肝素2.5%、海藻酸鈉9%、碳酸鋅0.5%，余量為生物相容性聚合物。實(shí)施例3一種從骨髓中提取免疫細(xì)胞的方法，包括如下步驟：（1）采集人骨髓，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12％胎牛血清的α-mem培養(yǎng)液稀釋3倍，300rpm轉(zhuǎn)速下離心3min，棄上清和脂肪層，得到骨髓細(xì)胞；（2）將人體外周血移入離心管中，600rpm轉(zhuǎn)速下離心7min，吸取上層血漿備用，下層細(xì)胞用于分離外周血淋巴細(xì)胞；所述骨髓細(xì)胞中加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12％所述上層血漿的α-mem培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液；（3）將分離液加入到離心管中；再將所述細(xì)胞懸液平鋪到所述分離液上，700rpm轉(zhuǎn)速下離心15min，吸取白膜層細(xì)胞獲得免疫細(xì)胞；（4）將免疫細(xì)胞等體積加入到免疫細(xì)胞凍存液中混合均勻，得到細(xì)胞重懸液，將細(xì)胞重懸液分裝入凍存袋中，再將凍存袋裝入凍存袋盒中，進(jìn)行程序降溫至-80℃后轉(zhuǎn)至-196℃液氮罐凍存。所述步驟（2）中，細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度為6×105個(gè)/ml。所述步驟（3）中，分離液的制備方法為：將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐2重量份，海藻糖1.5重量份，超低粘度海藻酸鈉1.5重量份，泛影葡胺4重量份和聚二烯丙基二甲基氯化銨0.6重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經(jīng)過0.22μm濾膜過濾制得分離液。所述步驟（3）中，分離液的密度為1.060g/cm3，滲透壓為260smol/kg，ph為7.5，粘度為2.0cp。所述步驟（4）中，免疫細(xì)胞凍存液包括如下組分：二甲基亞砜6ml右旋糖酐4ml細(xì)胞培養(yǎng)基20ml人血清白蛋白3ml人自體血漿80ml。所述步驟（4）中，細(xì)胞重懸液的細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml。所述步驟（4）中，程序降溫先以1.5℃/min的降溫速度降溫至-25℃，再以6℃/min的降溫速度降溫至-80℃。所述步驟（4）之后還包括步驟（5）將液氮凍存的免疫細(xì)胞復(fù)蘇后，用cik細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，加入到已預(yù)先用抗cd3單抗和重組人纖維連接蛋白包被好的培養(yǎng)容器中，添加包裹有ifn-γ因子的緩釋微囊；然后置于溫度為37℃、co2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)17d。所述抗cd3單抗培養(yǎng)前的終濃度為3.5μg/ml，重組人纖維連接蛋白培養(yǎng)前的終濃度為10μg/ml，添加ifn-γ因子的終濃度為700iu/ml。所述緩釋微囊包括以下質(zhì)量百分比的組分：ifn-γ因子7%、肝素3%、海藻酸鈉10%、碳酸鋅0.6%，余量為生物相容性聚合物。實(shí)施例4一種從骨髓中提取免疫細(xì)胞的方法，包括如下步驟：（1）采集人骨髓，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13％胎牛血清的α-mem培養(yǎng)液稀釋3.5倍，350rpm轉(zhuǎn)速下離心2.5min，棄上清和脂肪層，得到骨髓細(xì)胞；（2）將人體外周血移入離心管中，650rpm轉(zhuǎn)速下離心6min，吸取上層血漿備用，下層細(xì)胞用于分離外周血淋巴細(xì)胞；所述骨髓細(xì)胞中加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13％所述上層血漿的α-mem培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液；（3）將分離液加入到離心管中；再將所述細(xì)胞懸液平鋪到所述分離液上，750rpm轉(zhuǎn)速下離心12min，吸取白膜層細(xì)胞獲得免疫細(xì)胞；（4）將免疫細(xì)胞等體積加入到免疫細(xì)胞凍存液中混合均勻，得到細(xì)胞重懸液，將細(xì)胞重懸液分裝入凍存袋中，再將凍存袋裝入凍存袋盒中，進(jìn)行程序降溫至-81℃后轉(zhuǎn)至-196℃液氮罐凍存。所述步驟（2）中，細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度為7×105個(gè)/ml。所述步驟（3）中，分離液的制備方法為：將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐2.5重量份，海藻糖1.8重量份，超低粘度海藻酸鈉1.8重量份，泛影葡胺4.5重量份和聚二烯丙基二甲基氯化銨0.7重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經(jīng)過0.22μm濾膜過濾制得分離液。所述步驟（3）中，分離液的密度為1.065g/cm3，滲透壓為265smol/kg，ph為7.5，粘度為2.5cp。所述步驟（4）中，免疫細(xì)胞凍存液包括如下組分：二甲基亞砜7ml右旋糖酐5ml細(xì)胞培養(yǎng)基25ml人血清白蛋白4ml人自體血漿90ml。所述步驟（4）中，細(xì)胞重懸液的細(xì)胞密度為3×107個(gè)/ml。所述步驟（4）中，程序降溫先以1.5℃/min的降溫速度降溫至-26℃，再以6℃/min的降溫速度降溫至-81℃。所述步驟（4）之后還包括步驟（5）將液氮凍存的免疫細(xì)胞復(fù)蘇后，用cik細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，加入到已預(yù)先用抗cd3單抗和重組人纖維連接蛋白包被好的培養(yǎng)容器中，添加包裹有ifn-γ因子的緩釋微囊；然后置于溫度為37℃、co2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)17d。所述抗cd3單抗培養(yǎng)前的終濃度為4μg/ml，重組人纖維連接蛋白培養(yǎng)前的終濃度為11μg/ml，添加ifn-γ因子的終濃度為800iu/ml。所述緩釋微囊包括以下質(zhì)量百分比的組分：ifn-γ因子7.5%、肝素3.5%、海藻酸鈉11%、碳酸鋅0.7%，余量為生物相容性聚合物。實(shí)施例5一種從骨髓中提取免疫細(xì)胞的方法，包括如下步驟：（1）采集人骨髓，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14％胎牛血清的α-mem培養(yǎng)液稀釋4倍，400rpm轉(zhuǎn)速下離心2min，棄上清和脂肪層，得到骨髓細(xì)胞；（2）將人體外周血移入離心管中，700rpm轉(zhuǎn)速下離心5min，吸取上層血漿備用，下層細(xì)胞用于分離外周血淋巴細(xì)胞；所述骨髓細(xì)胞中加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14％所述上層血漿的α-mem培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液；（3）將分離液加入到離心管中；再將所述細(xì)胞懸液平鋪到所述分離液上，800rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，吸取白膜層細(xì)胞獲得免疫細(xì)胞；（4）將免疫細(xì)胞等體積加入到免疫細(xì)胞凍存液中混合均勻，得到細(xì)胞重懸液，將細(xì)胞重懸液分裝入凍存袋中，再將凍存袋裝入凍存袋盒中，進(jìn)行程序降溫至-82℃后轉(zhuǎn)至-196℃液氮罐凍存。所述步驟（2）中，細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度為8×105個(gè)/ml。所述步驟（3）中，分離液的制備方法為：將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐3重量份，海藻糖2重量份，超低粘度海藻酸鈉2重量份，泛影葡胺5重量份和聚二烯丙基二甲基氯化銨0.8重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經(jīng)過0.22μm濾膜過濾制得分離液。所述步驟（3）中，分離液的密度為1.070g/cm3，滲透壓為270smol/kg，ph為8，粘度為3.0cp。所述步驟（4）中，免疫細(xì)胞凍存液包括如下組分：二甲基亞砜8ml右旋糖酐6ml細(xì)胞培養(yǎng)基30ml人血清白蛋白5ml人自體血漿100ml。所述步驟（4）中，細(xì)胞重懸液的細(xì)胞密度為5×107個(gè)/ml。所述步驟（4）中，程序降溫先以2℃/min的降溫速度降溫至-27℃，再以7℃/min的降溫速度降溫至-82℃。所述步驟（4）之后還包括步驟（5）將液氮凍存的免疫細(xì)胞復(fù)蘇后，用cik細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，加入到已預(yù)先用抗cd3單抗和重組人纖維連接蛋白包被好的培養(yǎng)容器中，添加包裹有ifn-γ因子的緩釋微囊；然后置于溫度為38℃、co2濃度為6%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18d。所述抗cd3單抗培養(yǎng)前的終濃度為5μg/ml，重組人纖維連接蛋白培養(yǎng)前的終濃度為12μg/ml，添加ifn-γ因子的終濃度為900iu/ml。所述緩釋微囊包括以下質(zhì)量百分比的組分：ifn-γ因子8%、肝素4%、海藻酸鈉12%、碳酸鋅0.8%，余量為生物相容性聚合物。實(shí)施例6本實(shí)施例與上述實(shí)施例1的不同之處在于：所述細(xì)胞培養(yǎng)基為x-vivo15培養(yǎng)基。所述人自體血漿的制備方法為：將人體外周血置于無菌離心管中，1500rpm轉(zhuǎn)速下離心8min，取上層血漿在56℃溫度下滅活32min后，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，2500rpm轉(zhuǎn)速下離心15min，吸取上清，即為凍存用人自體血漿。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括糖類1g，所述糖類是由海藻糖、α-1,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:0.8：1.5：2組成的混合物。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括非必須氨基酸0.2g和維生素c0.1g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括丙二醇0.2ml和聚乙二醇0.4ml。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括重組人白介素4000u。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括白酒草皂苷r0.3g和勃脈力a0.8g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括青霉素-鏈霉素雙抗溶液0.1ml和氯化鈉0.4g。實(shí)施例7本實(shí)施例與上述實(shí)施例2的不同之處在于：所述細(xì)胞培養(yǎng)基為aim-v培養(yǎng)基。所述人自體血漿的制備方法為：將人體外周血置于無菌離心管中，1600rpm轉(zhuǎn)速下離心7min，取上層血漿在57℃溫度下滅活31min后，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，2800rpm轉(zhuǎn)速下離心22min，吸取上清，即為凍存用人自體血漿。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括糖類1.5g，所述糖類是由海藻糖、α-1,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:0.9：1.8：2.5組成的混合物。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括非必須氨基酸0.3g和維生素c0.2g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括丙二醇0.2-0.6ml和聚乙二醇0.4-0.8ml。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括重組人白介素5000u。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括白酒草皂苷r0.4g和勃脈力a0.9g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括青霉素-鏈霉素雙抗溶液0.2ml和氯化鈉0.5g。實(shí)施例8本實(shí)施例與上述實(shí)施例3的不同之處在于：所述細(xì)胞培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基。所述人自體血漿的制備方法為：將人體外周血置于無菌離心管中，1800rpm轉(zhuǎn)速下離心6min，取上層血漿在58℃溫度下滅活30min后，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，3000rpm轉(zhuǎn)速下離心20min，吸取上清，即為凍存用人自體血漿。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括糖類2g，所述糖類是由海藻糖、α-1,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:1：2：3組成的混合物。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括非必須氨基酸0.4g和維生素c0.3g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括丙二醇0.4ml和聚乙二醇0.6ml。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括重組人白介素6000u。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括白酒草皂苷r0.5g和勃脈力a1g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括青霉素-鏈霉素雙抗溶液0.3ml和氯化鈉0.6g。實(shí)施例9本實(shí)施例與上述實(shí)施例4的不同之處在于：所述細(xì)胞培養(yǎng)基為rpmi-1640培養(yǎng)基、gt-t551培養(yǎng)基或gt-t561培養(yǎng)基。所述人自體血漿的制備方法為：將人體外周血置于無菌離心管中，1900rpm轉(zhuǎn)速下離心5min，取上層血漿在59℃溫度下滅活29min后，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，3200rpm轉(zhuǎn)速下離心18min，吸取上清，即為凍存用人自體血漿。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括糖類2.5g，所述糖類是由海藻糖、α-1,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:1.1：2.2：3.5組成的混合物。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括非必須氨基酸0.4g和維生素c0.3g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括丙二醇0.4ml和聚乙二醇0.6ml。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括重組人白介素6000u。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括白酒草皂苷r0.3-0.7g和勃脈力a0.8-1.2g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括青霉素-鏈霉素雙抗溶液0.3ml和氯化鈉0.6g。實(shí)施例10本實(shí)施例與上述實(shí)施例5的不同之處在于：所述細(xì)胞培養(yǎng)基為stemspan培養(yǎng)基。所述人自體血漿的制備方法為：將人體外周血置于無菌離心管中，2000rpm轉(zhuǎn)速下離心4min，取上層血漿在60℃溫度下滅活28min后，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，3500rpm轉(zhuǎn)速下離心15min，吸取上清，即為凍存用人自體血漿。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括糖類3g，所述糖類是由海藻糖、α-1,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:1.2：2.5：4組成的混合物。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括非必須氨基酸0.6g和維生素c0.5g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括丙二醇0.6ml和聚乙二醇0.8ml。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括重組人白介素8000u。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括白酒草皂苷r0.7g和勃脈力a1.2g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括青霉素-鏈霉素雙抗溶液0.5ml和氯化鈉0.8g。將實(shí)施例1-5的方法從骨髓中提取免疫細(xì)胞，經(jīng)1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月凍存后依次取出復(fù)蘇，檢測(cè)免疫細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示：細(xì)胞存活率實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例4實(shí)施例5實(shí)施例6實(shí)施例7實(shí)施例8實(shí)施例9實(shí)施例101個(gè)月（%）97.1897.2197.3297.2697.2297.2397.2697.3797.3197.273個(gè)月（%）96.8596.9297.0596.9496.8896.9096.9797.1096.9996.936個(gè)月（%）96.4296.4896.5396.5196.4596.4796.5396.5896.5696.5012個(gè)月（%）96.0196.0496.1296.0896.0696.0696.0996.1796.1396.11從上表可以看出，本發(fā)明的方法能夠有效提高免疫細(xì)胞分離率和細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率，提高回輸?shù)交颊叩募?xì)胞的安全性。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)現(xiàn)方案，除此之外，本發(fā)明還可以其它方式實(shí)現(xiàn)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下任何顯而易見的替換均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12