本發(fā)明涉及一種永生化雞胚胎肝細(xì)胞系及其制備方法和用途，屬于生物學(xué)領(lǐng)域，具體的屬于生物工程及獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

自2013年以來，i型禽腺病毒在我國禽養(yǎng)殖場大量傳播，引發(fā)了嚴(yán)重疫情，對養(yǎng)殖場造成重大經(jīng)濟(jì)損失。

對于這一病毒，目前我國采用的主要防治手段是使用禽腺病毒相關(guān)疫苗?，F(xiàn)有技術(shù)我們通常采用spf雞胚或原代雞胚肝臟細(xì)胞進(jìn)行禽腺病毒增殖，從而獲得相關(guān)疫苗。

但是，這兩種方式都具有一定的缺陷。譬如，spf雞胚的使用會(huì)產(chǎn)生大量的病毒污染生產(chǎn)廢棄物，而原代雞胚肝臟細(xì)胞的獲得同樣需要使用spf雞胚，并且原代細(xì)胞的制備操作又極為費(fèi)時(shí)費(fèi)力、易污染。因此，現(xiàn)有的禽腺病毒疫苗制備工藝落后，生產(chǎn)效能低下，無法滿足禽養(yǎng)殖場的實(shí)際免疫需求。

細(xì)胞永生化技術(shù)可以使得目標(biāo)細(xì)胞獲得在體外連續(xù)傳代增殖的能力。如果能夠?qū)υu胚胎肝臟細(xì)胞進(jìn)行永生化改造，獲得永生化原代雞胚胎肝臟細(xì)胞系，就可以實(shí)現(xiàn)i型禽腺病毒在連續(xù)傳代細(xì)胞系中進(jìn)行增殖。從而免去每次制備原代細(xì)胞的繁瑣操作，提高病毒抗原的制備效率。解決目前禽腺病毒相關(guān)疫苗生產(chǎn)中的實(shí)際問題。

更為重要的是避免了spf雞胚的使用，避免污染。

但是，對于原代細(xì)胞永生化的機(jī)理仍不完全明了，一般認(rèn)為是原代細(xì)胞在若干傳代或基因工程操作后發(fā)生了細(xì)胞染色體的不穩(wěn)定重排而導(dǎo)致了細(xì)胞永生化，從而具備了體外連續(xù)傳代增殖的能力。目前，原代細(xì)胞永生化的改造方法包括自發(fā)永生化馴化、外源病毒感染導(dǎo)致永生化、重組表達(dá)外源病毒蛋白導(dǎo)致永生化這三種。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要目的是提供一種永生化雞胚胎細(xì)胞系及其制備方法。該永生化雞胚胎細(xì)胞系具有原代雞胚胎細(xì)胞的主要功能，并且能夠在體外連續(xù)傳代。

為了實(shí)現(xiàn)這一目的，我們公開了一種永生化雞胚胎肝細(xì)胞系，該永生化雞胚胎肝細(xì)胞系cel-hmrp18s-2于2016年12月7日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡稱為cgmcc），保藏編號為cgmccno.13290.保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。

這一永生化雞胚胎肝細(xì)胞系是通過真核表達(dá)載體pcag-hmrp18s-2向原代雞胚胎肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染hmrp18s-2基因，以g418藥物經(jīng)兩輪篩選后連續(xù)傳代擴(kuò)增而得。

具體地，這一制備方法可以描述為：

1）使用帶有kpni和noti酶切位點(diǎn)的上下游引物從含有hmrp18s-2編碼序列的puc-hmrp18s-2質(zhì)粒上擴(kuò)增該片段，經(jīng)雙酶切后克隆至同等雙酶切的真核表達(dá)載體中，構(gòu)建成hmrp18s-2（人線粒體核糖體蛋白18s-2）的真核表達(dá)載體pcag-hmrp18s-2，用于轉(zhuǎn)染操作。

該真核表達(dá)載體中cag啟動(dòng)子中有部分雞β-actin的啟動(dòng)子序列，應(yīng)用在禽來源的細(xì)胞中具有較強(qiáng)的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性。

2）將pcag-hmrp18s-2轉(zhuǎn)染至原代雞胚胎肝細(xì)胞后，以g418藥物兩輪篩選，得到對g418藥物具有抗性，可穩(wěn)定表達(dá)hmrp18s-2蛋白的重組雞胚胎肝細(xì)胞。

3）收集重組雞胚胎肝細(xì)胞并實(shí)施連續(xù)傳代擴(kuò)增，得到永生化雞胚胎肝細(xì)胞系cel-hmrp18s-2。

本發(fā)明的發(fā)明人對于這一細(xì)胞系連續(xù)傳代擴(kuò)增培養(yǎng)100代，并按照不同的代次分別凍存細(xì)胞，進(jìn)行功能和特征檢測表明傳代100代后，仍能夠保留原雞胚胎肝細(xì)胞的主要特征和主要功能。

其中，優(yōu)選地，步驟1）中人線粒體核糖體蛋白18s-2的核酸編碼序列是根據(jù)禽源密碼子偏嗜性進(jìn)行優(yōu)化的重組核苷酸序列，如seqidno.1所示。

并且，作為另一優(yōu)選，步驟2）中g(shù)418藥物的2輪篩選是指分別使用濃度為200ug/ml和400ug/ml的g418藥物溶液，并且在不同濃度下均進(jìn)行20代連續(xù)篩選。

同時(shí)本發(fā)明還進(jìn)一步公開了這一永生化雞胚胎肝細(xì)胞系在i型禽腺病毒增殖中的應(yīng)用。

具體來說，其應(yīng)用方式為：

1）連續(xù)傳代擴(kuò)增cel-hmrp18s-2細(xì)胞并建庫。

該細(xì)胞具有貼壁生長的特性，置于37℃，5%co2的培養(yǎng)環(huán)境下，細(xì)胞生長匯合度達(dá)到90%即可進(jìn)行禽腺病毒接毒操作。

2）按照moi為0.1接種i型禽腺病毒于cel-hmrp18s-2細(xì)胞中，接毒后3～5天細(xì)胞即可出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變。

3）在cel-hmrp18s-2細(xì)胞中連續(xù)盲傳i型禽腺病毒20代均能夠檢出病毒有效增殖，病毒增殖效價(jià)可達(dá)到10^8.5tcid50/ml。

進(jìn)而，本發(fā)明還進(jìn)一步請求保護(hù)這一永生化雞胚胎肝細(xì)胞系在制備i型禽腺病毒病疫苗中的應(yīng)用。

采用本發(fā)明所獲得的永生化雞胚胎肝細(xì)胞保留了原代雞胚胎肝細(xì)胞的主要特征和主要功能。并且該細(xì)胞可以在體外無限制的擴(kuò)增培養(yǎng)，該細(xì)胞系在體外傳代100代仍具有較好的活力，保持分裂增殖，不發(fā)生衰老和凋亡。將其應(yīng)用于i型禽腺病毒的增殖可以顯著提高病毒抗原的制備效率。

附圖說明

圖1為載體的酶切鑒定結(jié)果圖；

m：核酸marker，1:pcag-hmrp18s-2經(jīng)kpni和noti的酶切產(chǎn)物。

圖2為用rt-pcr鑒定檢測結(jié)果圖；

m：核酸marker，1:cel-hmrp18s-2細(xì)胞，2:原代雞胚胎肝臟細(xì)胞。

圖3為westernblot鑒定檢測結(jié)果圖；

m：蛋白質(zhì)marker，1:cel-hmrp18s-2細(xì)胞，2:原代雞胚胎肝臟細(xì)胞。

圖4為cel-hmrp18s-2細(xì)胞生長曲線圖。

圖5為i型禽腺病毒在cel-hmrp18s-2細(xì)胞中連續(xù)增殖的pcr鑒定結(jié)果圖；

m：核酸marker，原毒：spf雞胚擴(kuò)增的i型禽腺病毒原毒，

p1～p20：i型禽腺病毒在cel-hmrp18s-2細(xì)胞中連續(xù)傳代樣品。

圖6為i型禽腺病毒在cel-hmrp18s-2細(xì)胞中連續(xù)增殖的細(xì)胞生長形態(tài)、細(xì)胞病變形態(tài)圖；

a：i型禽腺病毒在cel-hmrp18s-2細(xì)胞上的細(xì)胞病變

b：未接毒cel-hmrp18s-2細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)

具體實(shí)施方式

為了更好的理解本發(fā)明，下面我們結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。

實(shí)施例1pcag-hmrp18s-2表達(dá)載體的構(gòu)建

1.1試劑

密碼子優(yōu)化后的hmrp18s-2蛋白編碼基因片段（seqidno.1）由金斯瑞生物技術(shù)公司化學(xué)合成，并克隆至puc57載體中。pmd19-t載體、各種限制性內(nèi)切酶、extaq酶、t4dna連接酶等分子生物學(xué)材料均購自takara公司。含有cag啟動(dòng)子序列的真核表達(dá)載體由國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心自行構(gòu)建并保存。膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提及大提試劑盒均購自qiagen公司。

1.2引物合成：用于擴(kuò)增hmrp18s-2蛋白o(hù)rf序列的引物由金斯瑞生物技術(shù)公司合成。

p1：gccggtaccgccaccatggccgcg（劃線處為kpni酶切位點(diǎn)）

p2：gccgcggccgcctagagagcactctg（劃線處為noti酶切位點(diǎn)）

1.3pcag-hmrps18-2表達(dá)載體的構(gòu)建及大提

采用上述引物，以puc-hmrp18s-2為模板，經(jīng)pcr反應(yīng)擴(kuò)增出hmrp18s-2的完整orf片段，pcr反應(yīng)條件：95℃3分鐘；95℃15秒，62℃30秒，72℃50秒，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘。采用kpni和noti雙酶切處理pcr擴(kuò)增的目的片段以及pcag質(zhì)粒，將目的片段及pcag質(zhì)粒的骨架片段進(jìn)行膠回收，定量后進(jìn)行核酸連接操作，轉(zhuǎn)化至dh5α中，挑選陽性菌落并大量擴(kuò)增，質(zhì)粒抽提后酶切驗(yàn)證重組真核表達(dá)載體pcag-hmrp18s-2。經(jīng)qiagen公司質(zhì)粒大提試劑盒抽提獲得質(zhì)量較高的轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒。

1.4結(jié)果

本試驗(yàn)利用兩個(gè)酶切位點(diǎn)將目的片段連入了真核表達(dá)載體中，獲得了pcag-hmrp18s-2真核表達(dá)載體用于后續(xù)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。使用kpni和noti雙酶切pcag-hmrp18s-2載體鑒定結(jié)果顯示目的片段連接正確（如圖1）。經(jīng)質(zhì)粒大提獲得質(zhì)量較高的質(zhì)粒，od260/od280的值為1.86，用于后續(xù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

實(shí)施例2重組cel-hmrp18s-2的構(gòu)建

2.1材料：

試劑：mem、g418、opti-mem、轉(zhuǎn)染試劑購自invitrogen公司。兔抗hmrp18s-2蛋白的一抗購自santacruz生物技術(shù)公司，fitc標(biāo)記的羊抗兔igg、hrp標(biāo)記的羊抗兔igg購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)公司。rna提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒等分子生物學(xué)試劑均購自qiagen公司。

生物材料：原代雞胚胎肝臟細(xì)胞由國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心自行從spf雞胚中分離獲得，該原代細(xì)胞制備后接種于含有10%新生牛血清的mem培養(yǎng)基中備用。

2.2g418作用濃度的篩選

調(diào)整原代雞胚胎肝臟細(xì)胞的初始細(xì)胞密度為5×10⁵cells/ml，在96孔板中進(jìn)行g(shù)418作用濃度的篩選。培養(yǎng)液中加入不同濃度的g148，濃度為100、200、300、400、500、600ug/ml，置于37℃，5%co2的培養(yǎng)箱中，每日觀察細(xì)胞狀態(tài)，培養(yǎng)6-12天，確定g418的最小有效工作濃度。

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染

原代雞胚胎肝臟細(xì)胞的接種初始細(xì)胞密度為5×10⁵cells/ml，在6孔板中培養(yǎng)過夜后用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前將培養(yǎng)基更換為opti-mem培養(yǎng)基并在培養(yǎng)箱中孵育10分鐘。按照25kda支鏈pei轉(zhuǎn)染試劑的使用說明配置轉(zhuǎn)染復(fù)合物，并在室溫下孵育5分鐘。孵育完成后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入至原代雞胚胎肝臟細(xì)胞中，置于培養(yǎng)箱中6～8小時(shí)。之后將含有剩余轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)上清去除，更換成該原代細(xì)胞的正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.4cel-hmrp18s-2細(xì)胞克隆的篩選：

轉(zhuǎn)染后24～72小時(shí)的原代雞胚胎肝臟細(xì)胞經(jīng)消化后按照1:3～1:5的比例重新接種至6孔板中，于37℃，5%co2以及含有200ug/mlg418的培養(yǎng)液中進(jìn)重組細(xì)胞篩選。按照3天換一次液的頻率進(jìn)行g(shù)418持續(xù)篩選，第一輪篩選時(shí)間大致為2～3周。選擇能夠在有g(shù)418篩選壓力下持續(xù)增殖的重組cel-hmrp18s-2細(xì)胞克隆繼續(xù)培養(yǎng)。第二輪篩選中將g418篩選工作濃度提高至400ug/ml繼續(xù)加壓篩選。最終獲得能夠在g418篩選抗性中穩(wěn)定持續(xù)生長的重組cel-hmrp18s-2細(xì)胞克隆。

2.5rt-pcr、westernblot鑒定：

將篩選出來的cel-hmrp18s-2細(xì)胞克隆消化后離心收集，用pbs清洗3遍后按rna提取試劑盒說明抽提出的總rna。上述實(shí)驗(yàn)所用的器皿、槍頭、水等等均采用depc處理并高壓，全程戴手套進(jìn)行操作。抽提出的rna樣本按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟說明合成cdna，以cdna為模版進(jìn)行目標(biāo)序列pcr擴(kuò)增，具體參數(shù)同實(shí)施例一中操作。

將篩選出來的cel-hmrp18s-2細(xì)胞克隆消化后經(jīng)離心收集，pbs清洗3遍后按照線粒體蛋白抽提試劑盒的步驟說明抽提線粒體蛋白，用于westernblot檢測。以5%的濃縮膠和8%的分離膠進(jìn)行sds-page蛋白電泳，采用半干式轉(zhuǎn)膜操作將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至pvdf膜上，經(jīng)bsa封閉后，采用hmrp18s-2蛋白的兔源一抗及hrp標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育轉(zhuǎn)有目的蛋白的pvdf膜，采用顯色劑顯色鑒定目的蛋白表達(dá)情況。

上述鑒定試驗(yàn)均以原代雞胚胎肝臟細(xì)胞為空白對照，按照相同操作步驟進(jìn)行鑒定。

2.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6.1g418工作濃度的篩選確定

以在5天內(nèi)殺死全部原代雞胚胎肝臟細(xì)胞的濃度為g418篩選工作濃度。確定200ug/ml為正常篩選時(shí)的工作濃度，在加壓篩選中選擇400ug/ml。

2.6.2重組細(xì)胞的克隆、篩選及鑒定

轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在200ug/ml的g418篩選環(huán)境中經(jīng)過3周的篩選，獲得了能夠正常持續(xù)生長的重組細(xì)胞株。將存活的細(xì)胞株分散至含有400ug/ml的g418篩選培養(yǎng)基中繼續(xù)加壓篩選，最終獲得能夠持續(xù)生長的cel-hmrp18s-2重組細(xì)胞克隆。

經(jīng)rt-pcr檢測發(fā)現(xiàn)cel-hmrp18s-2重組細(xì)胞克隆可擴(kuò)增出795bp的特異條帶，而原代雞胚胎肝臟細(xì)胞的擴(kuò)增結(jié)果為陰性（如圖2所示）。westernblot檢測發(fā)現(xiàn)重組cel-hmrp18s-2細(xì)胞克隆表達(dá)了大約29kda的目的蛋白，而原代雞胚胎肝臟細(xì)胞無目的蛋白表達(dá)（如圖3所示）。

實(shí)施例3cel-hmrp18s-2細(xì)胞的連續(xù)生長性能測定

3.1材料與方法

原代雞胚胎肝臟細(xì)胞由國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心自行制備。

重組cel-hmrp18s-2細(xì)胞如前所述篩選獲得，并建系保存。

培養(yǎng)基：含有10%新生牛血清的mem培養(yǎng)基。

原代雞胚胎肝臟細(xì)胞和連續(xù)傳代不同代次的重組cel-hmrp18s-2細(xì)胞以3×10⁵cells/ml的初始密度接種于t150的培養(yǎng)方瓶中，放置于37℃，5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24小時(shí)取樣測定細(xì)胞密度和存活率，繪制不同生長代次的細(xì)胞生長曲線。

3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

重組cel-hmrp18s-2細(xì)胞的生長曲線如圖4所示。與原代雞胚胎肝臟細(xì)胞比較，重組cel-hmrp18s-2細(xì)胞的生長速率明顯高于原代雞胚胎肝臟細(xì)胞。特別是在具備連續(xù)傳代能力后，隨著傳代的代次增加，該細(xì)胞在t150瓶中培養(yǎng)細(xì)胞獲得最大的細(xì)胞密度可達(dá)到2.6×10⁶cells/ml，而原代雞胚胎肝臟細(xì)胞在初次培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞增殖效率較差，增殖不明顯。說明經(jīng)過外源基因轉(zhuǎn)染及篩選操作后獲得的重組細(xì)胞具備了原代細(xì)胞所不具備的連續(xù)傳代增殖能力。

實(shí)施例4cel-hmrp18s-2細(xì)胞增殖禽腺病毒

4.1試驗(yàn)材料

原代雞胚胎肝臟細(xì)胞由國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心自行制備。

重組cel-hmrp18s-2細(xì)胞如前所述篩選獲得，并建系保存。

細(xì)胞培養(yǎng)基：含有10%新生牛血清的mem培養(yǎng)基。

病毒增殖維持液：含有2%新生牛血清的mem培養(yǎng)基。

i型禽腺病毒：由國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心分離、鑒定、保藏。

4.2試驗(yàn)方法

將重組cel-hmrp18s-2細(xì)胞和原代雞胚胎肝臟細(xì)胞接種于6孔板中。待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%以上，去除培養(yǎng)上清，經(jīng)pbs清洗3遍后，接入200ul禽腺病毒（計(jì)算moi為0.1），于37℃培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)后去除病毒液，更換病毒增殖維持液繼續(xù)培養(yǎng)3～5天，觀察細(xì)胞病變，收獲病毒增殖樣品，-40℃凍存待測。連續(xù)盲傳該病毒20代，檢測病毒增殖效價(jià)。

病毒增殖效價(jià)測定。將病毒增殖后樣品進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，接種于含有已達(dá)到90%匯合度的cel-hmrp18s-2細(xì)胞96孔板中，每個(gè)稀釋度8個(gè)孔，37℃，50%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后觀察細(xì)胞病變，根據(jù)reed-muench法計(jì)算病毒的細(xì)胞半數(shù)感染量（tcid50/ml）。

病毒pcr檢測。檢測引物，f：caactacatcgggttcagggataacttc，r：ccagtttctgtggtggttgaaggggtt。擴(kuò)增目的片段為766bp左右。pcr擴(kuò)增條件為：步驟一：98℃30秒；步驟二：98℃15秒，55℃30秒，72℃20秒，30個(gè)循環(huán)；步驟三：72℃10分鐘。

4.3試驗(yàn)結(jié)果

cel-hmrp18s-2細(xì)胞可以支持i型禽腺病毒進(jìn)行連續(xù)20代的盲傳擴(kuò)增，病毒增殖正常。如圖5所示，病毒在該細(xì)胞中盲傳20代后可清晰檢測出該病毒的核酸片段。如圖6所示，病毒可在該細(xì)胞中增殖，接毒后細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的呈束狀、聚集成串等細(xì)胞病變現(xiàn)象，而未接毒對照cel-hmrp18s-2細(xì)胞則細(xì)胞面平整，細(xì)胞形態(tài)正常。如表1所示，i型禽腺病毒在cel-hmrp18s-2細(xì)胞和原代雞胚胎肝臟細(xì)胞中的增殖效價(jià)比較，本發(fā)明中的永生化cel-hmrp18s-2細(xì)胞的病毒增殖滴度顯著高于原代細(xì)胞的增殖滴度，達(dá)到8.5lgtcid50/ml。

表1.i型禽腺病毒在cel-hmrp18s-2細(xì)胞和原代雞胚胎肝臟細(xì)胞中的增殖比較

單位：lgtcid50/ml。

sequencelisting

<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>一種永生化雞胚胎肝細(xì)胞系及其制備方法和用途

<160>1

<170>patentinversion3.3

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<211>777

<212>dna

<213>人工合成

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aggacaccggctgaagcaagttcaaccgggcaaacgggcccgcagagtgctctctag777