本發(fā)明涉及體外檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種改性心磷脂包被的納米磁珠及其制備方法。
背景技術(shù)：
抗心磷脂抗體是一種能與多種含有磷脂結(jié)構(gòu)的抗原物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的抗體，抗原為參與多種細(xì)胞膜組成的帶負(fù)電荷的磷脂成分。臨床上主要存在于抗磷脂綜合征、各種自身免疫性疾病和梅毒感染患者體內(nèi)。
抗磷脂綜合癥(APS)包括多種自身性免疫性疾病，多見于年輕人，男女發(fā)病比率約為2：8?；颊呖沙霈F(xiàn)一種或多種表現(xiàn)，可累及多個(gè)系統(tǒng)、器官，主要有：靜脈和動(dòng)脈血栓形成、血小板減少癥、習(xí)慣性流產(chǎn)、心肌病、心臟病、大腦和腎臟梗塞、肺高壓。惡性APS可表現(xiàn)為短期內(nèi)進(jìn)行性廣泛血栓形成，造成多器官功能衰竭甚至死亡?？衫^發(fā)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡或者其它自身免疫病，但也可單獨(dú)出現(xiàn)(原發(fā)抗磷脂綜合征)。
梅毒患者體內(nèi)也能產(chǎn)生抗磷脂抗體，梅毒是由螺旋體細(xì)菌梅毒密螺旋體引起的性傳播疾病。據(jù)報(bào)道，每年有超過5百萬人感染梅毒，其中包括通過先天性傳染的3萬名嬰兒。梅毒可于患者體內(nèi)潛伏和隱藏許多年，并可導(dǎo)致各種各樣的臨床表現(xiàn)。其中處于梅毒隱藏期的患者并無臨床癥狀，次階段在約三分之二未治療病人中持續(xù)終生。感染者在隱藏期不具有傳染性，然而處于隱藏期的母親所生的孩子可能感染先天性梅毒。
抗磷脂抗體檢測(cè)試驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于磷脂綜合征診斷以及梅毒的非密螺旋體試驗(yàn)。該檢測(cè)具有廉價(jià)、快速和方便對(duì)大量樣本執(zhí)行的優(yōu)點(diǎn)。此外，由于抗磷脂抗體的濃度會(huì)隨著梅毒的治療成功而逐漸降低，而梅毒感染的特異性抗體密螺旋體抗體會(huì)持續(xù)數(shù)年甚至終生都高。因此抗磷脂抗體檢測(cè)試驗(yàn)被認(rèn)為是監(jiān)測(cè)梅毒治療的更好選擇。
傳統(tǒng)的檢測(cè)抗磷脂抗體的主要方法是將心磷脂用物理吸附的方式涂抹在特定的固體如酶標(biāo)板上面，然后利用附著在酶標(biāo)板上面的心磷脂與待檢測(cè)樣本中的抗磷脂抗體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中的抗磷脂抗體的捕獲。通過對(duì)捕獲的抗磷脂抗體顯色并測(cè)定發(fā)光濃度，就能間接的讀取樣本中的抗磷脂抗體濃度。
由于用物理吸附方式固定的心磷脂在溶劑、加熱等外部條件影響下容易從固體板上解離和脫落，因此通過該方法制備的檢驗(yàn)產(chǎn)品的穩(wěn)定性較差。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
基于此，有必要提供一種用于檢測(cè)抗心磷脂抗體的穩(wěn)定性較好的改性心磷脂包被的納米磁珠及其制備方法。
一種改性心磷脂包被的納米磁珠，包括：改性心磷脂、生物素衍生物和鏈霉親和素磁珠；
所述改性心磷脂為心磷脂的疏水性脂肪酸側(cè)鏈被氧化并氨基化得到，所述改性心磷脂含有-NH2；
所述生物素衍生物的結(jié)構(gòu)式為：其中，所述-R-為含有4個(gè)～20個(gè)碳原子的飽和烷基鏈或含有2個(gè)～10個(gè)碳原子的聚乙二醇鏈，所述改性心磷脂中的-NH2與所述生物素衍生物中的-COOH生成-NH-CO-結(jié)構(gòu)從而將所述改性心磷脂和所述生物素衍生物連接到一起；
所述鏈霉親和素磁珠為結(jié)合了鏈霉親和素的納米磁珠，所述生物素衍生物和所述鏈霉親和素連接。
在一個(gè)實(shí)施例中，所述-R-為含有4個(gè)～10個(gè)碳原子的飽和烷基鏈。
在一個(gè)實(shí)施例中，所述改性心磷脂含有一個(gè)-NH2。
在一個(gè)實(shí)施例中，所述改性心磷脂的結(jié)構(gòu)式如下：
一種上述的改性心磷脂包被的納米磁珠的制備方法，包括如下步驟：
將心磷脂和過氧化物在第一溶劑存在的條件下充分反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物；
向所述中間產(chǎn)物中加入過量氨水并充分反應(yīng)，得到改性心磷脂，其中，所述改性心磷脂的疏水性脂肪酸側(cè)鏈被氧化并氨基化，所述改性心磷脂含有氨基；
將所述改性心磷脂和N-羥基丁二酰亞胺活化的生物素衍生物在第二溶劑存在的條件下充分反應(yīng)，得到生物素衍生物結(jié)合的改性心磷脂，其中，所述生物素衍生物的結(jié)構(gòu)式為：其中，所述-R-為含有4～20個(gè)碳原子的碳鏈或含有2～10個(gè)碳原子的聚乙二醇鏈，所述改性心磷脂中的-NH2與所述生物素衍生物中的-COOH生成-NH-CO-結(jié)構(gòu)從而將所述改性心磷脂和所述生物素衍生物連接到一起生成所述生物素衍生物結(jié)合的改性心磷脂；以及
將所述生物素衍生物結(jié)合的改性心磷脂和鏈霉親和素磁珠混合并充分反應(yīng)，得到改性心磷脂包被的納米磁珠，其中，所述鏈霉親和素磁珠為結(jié)合了鏈霉親和素的納米磁珠，所述生物素衍生物和所述鏈霉親和素連接。
在一個(gè)實(shí)施例中，所述將心磷脂和過氧化物在第一溶劑存在的條件下充分反應(yīng)的操作中，所述過氧化物為過氧苯甲酸、間氯過氧苯甲酸、過氧乙酸或過氧丙酸，所述心磷脂和所述過氧化物的摩爾比為1：1～8，所述第一溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、氯仿、苯或甲苯。
在一個(gè)實(shí)施例中，所述向所述中間產(chǎn)物中加入過量氨水并充分反應(yīng)的操作中，所述氨水的質(zhì)量濃度為10％～30％。
在一個(gè)實(shí)施例中，所述將所述改性心磷脂和N-羥基丁二酰亞胺活化的生物素衍生物在第二溶劑存在的條件下充分反應(yīng)的操作中，所述第二溶劑為DMSO、DMF、四氫呋喃或pH為6.5～8.5的磷酸鹽緩沖液。
在一個(gè)實(shí)施例中，所述將所述改性心磷脂和N-羥基丁二酰亞胺活化的生物素衍生物在第二溶劑存在的條件下充分反應(yīng)的操作中，所述改性心磷脂與所述N-羥基丁二酰亞胺活化的生物素衍生物的摩爾比為1：1.5～20。
在一個(gè)實(shí)施例中，所述將所述生物素衍生物結(jié)合的改性心磷脂和鏈霉親和素磁珠混合并充分反應(yīng)的操作中，所述生物素衍生物結(jié)合的改性心磷脂的濃度為0.1mg/mL～1mg/mL，所述鏈霉親和素磁珠的濃度為5mg/mL～15mg/mL。
這種改性心磷脂包被的納米磁珠通過化學(xué)鍵直接將改性心磷脂牢固與生物素衍生物牢固的連接，生物素衍生物和鏈霉親和素磁珠表面的鏈霉親和素連接，相對(duì)于物理吸附的方式，更加易于控制磁珠表面的改性心磷脂量，并且可以通過調(diào)節(jié)-R-的長(zhǎng)度，實(shí)現(xiàn)改性心磷脂量與納米磁珠之間的距離的控制，更好的保留了改性心磷脂量與抗磷脂抗體結(jié)合的空間。這種改性心磷脂包被的納米磁珠可以直接用于抗磷脂抗體的檢測(cè)，并且相對(duì)于傳統(tǒng)物理吸附心磷脂的方法制備的檢測(cè)產(chǎn)品，具有較高的穩(wěn)定性。
附圖說明
圖1為一實(shí)施方式的改性心磷脂包被的納米磁珠的制備方法的流程圖。
具體實(shí)施方式
為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施的限制。
一實(shí)施方式的改性心磷脂包被的納米磁珠，包括：改性心磷脂、生物素衍生物和鏈霉親和素磁珠。
心磷脂是由3個(gè)甘油、2個(gè)磷酸以及4個(gè)長(zhǎng)鏈不飽和烷基構(gòu)成的酯類物質(zhì)，該結(jié)構(gòu)含有2個(gè)親水性中心以及4條疏水性側(cè)鏈。心磷脂的結(jié)構(gòu)式如下：
改性心磷脂為心磷脂的疏水性脂肪酸側(cè)鏈被氧化并氨基化得到，改性心磷脂含有-NH2。
由于心磷脂有4條側(cè)鏈，心磷脂改性時(shí)4條側(cè)鏈可以同時(shí)被氧化，因此該改性心磷脂可能包含多個(gè)-NH2。具體來說，該改性心磷脂可以包含1個(gè)～8個(gè)-NH2。
優(yōu)選的，改性心磷脂含有一個(gè)-NH2。
特別優(yōu)選的，改性心磷脂的結(jié)構(gòu)式如下：
生物素衍生物的結(jié)構(gòu)式為：
其中，-R-為含有4個(gè)～20個(gè)碳原子的飽和烷基鏈或含有2個(gè)～10個(gè)碳原子的聚乙二醇鏈。
改性心磷脂中的-NH2與生物素衍生物中的-COOH生成-NH-CO-結(jié)構(gòu)從而將改性心磷脂和生物素衍生物連接到一起。
優(yōu)選的，-R-為含有4個(gè)～10個(gè)碳原子的飽和烷基鏈。
特別優(yōu)選的，-R-為-(CH2)6-。
由于心磷脂分子的尺寸非常小，可改造的空間嚴(yán)重不足，對(duì)親水性的磷酸酯中心進(jìn)行修飾會(huì)降低心磷脂與抗磷脂抗體的親和性，甚至使抗原活性消失。
這種改性心磷脂包被的納米磁珠通過對(duì)心磷脂疏水性側(cè)鏈進(jìn)行改造，保留了心磷脂親水性磷酸酯中心的改性心磷脂。
這種改性心磷脂包被的納米磁珠通過化學(xué)鍵直接將改性心磷脂牢固與生物素衍生物牢固的連接，生物素衍生物和鏈霉親和素磁珠表面的鏈霉親和素連接，相對(duì)于物理吸附的方式，更加易于控制磁珠表面的改性心磷脂量，并且可以通過調(diào)節(jié)-R-的長(zhǎng)度，實(shí)現(xiàn)改性心磷脂量與納米磁珠之間的距離的控制，更好的保留了改性心磷脂量與抗磷脂抗體結(jié)合的空間。這種改性心磷脂包被的納米磁珠可以直接用于抗磷脂抗體的檢測(cè)，并且相對(duì)于傳統(tǒng)物理吸附心磷脂的方法制備的檢測(cè)產(chǎn)品，具有較高的穩(wěn)定性。
此外，由于每個(gè)鏈霉親和素能與4個(gè)生物素緊密結(jié)合，這種改性心磷脂包被的納米磁珠通過生物素-鏈霉親和素放大效應(yīng)，使被檢測(cè)信號(hào)放大了4倍，極大的提高了抗磷脂抗體的檢測(cè)靈敏度。
如圖1所示的上述改性心磷脂包被的納米磁珠的制備方法，包括如下步驟：
S10、將心磷脂和過氧化物在第一溶劑存在的條件下充分反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物。
通過心磷脂與過氧化物反應(yīng)，對(duì)心磷脂的脂肪酸側(cè)鏈進(jìn)行氧化。
過氧化物為過氧苯甲酸、間氯過氧苯甲酸、過氧乙酸或過氧丙酸。
心磷脂和過氧化物的摩爾比為1：1～8。
第一溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、氯仿、苯或甲苯。
S10還包括對(duì)中間產(chǎn)物進(jìn)行純化的操作，純化可以為乙酸乙酯萃取后經(jīng)過液相制備色譜純化。純化后可以得到純度約80％的改性心磷脂。
S10中，反應(yīng)溫度為60℃～100℃。
S20、向S10得到的中間產(chǎn)物中加入過量氨水并充分反應(yīng)，得到改性心磷脂。
通過過氧化物和氨水，使得心磷脂的疏水性脂肪酸側(cè)鏈被氧化并氨基化，從而使得制得的改性心磷脂含有氨基。
由于心磷脂有4條側(cè)鏈，心磷脂改性時(shí)4條側(cè)鏈可以同時(shí)被氧化，因此該改性心磷脂可能包含多個(gè)氨基。具體來說，改性心磷脂可以包含1個(gè)～8個(gè)-NH2。
優(yōu)選的，改性心磷脂含有一個(gè)-NH2。
特別優(yōu)選的，改性心磷脂的結(jié)構(gòu)式如下：
氨水的質(zhì)量濃度為10％～30％。
S20中，反應(yīng)溫度為60℃～100℃。
S30、將S20得到的改性心磷脂和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)活化的生物素衍生物在第二溶劑存在的條件下充分反應(yīng)，得到生物素衍生物結(jié)合的改性心磷脂。
生物素衍生物的結(jié)構(gòu)式為：
-R-為含有4～20個(gè)碳原子的碳鏈或含有2～10個(gè)碳原子的聚乙二醇鏈，改性心磷脂中的-NH2與生物素衍生物中的-COOH生成-NH-CO-結(jié)構(gòu)從而將改性心磷脂和生物素衍生物連接到一起生成生物素衍生物結(jié)合的改性心磷脂。
優(yōu)選的，-R-為含有4個(gè)～10個(gè)碳原子的飽和烷基鏈。
特別優(yōu)選的，-R-為-(CH2)6-。
NHS活化的生物素衍生物即為生物素衍生物NHS酯，生物素衍生物NHS酯可以直接購(gòu)買得到。
S30中，第二溶劑為DMSO、DMF、四氫呋喃或pH為6.5～8.5的磷酸鹽緩沖液。
S30中，改性心磷脂與N-羥基丁二酰亞胺活化的生物素衍生物的摩爾比為1：1.5～20。
S40、將S30得到的生物素衍生物結(jié)合的改性心磷脂和鏈霉親和素磁珠混合并充分反應(yīng)，得到改性心磷脂包被的納米磁珠。
鏈霉親和素磁珠為結(jié)合了鏈霉親和素的納米磁珠，生物素衍生物和鏈霉親和素連接。
鏈霉親和素磁珠可以為直接購(gòu)買，例如，購(gòu)自MagnaBind公司(貨號(hào)為xxxx)。
將生物素衍生物結(jié)合的改性心磷脂和鏈霉親和素磁珠混合并充分反應(yīng)的操作中，生物素衍生物結(jié)合的改性心磷脂的濃度為0.1mg/mL～1mg/mL，鏈霉親和素磁珠的濃度為5mg/mL～15mg/mL。
這種改性心磷脂包被的納米磁珠的制備方法，通過化學(xué)鍵直接將改性心磷脂牢固與生物素衍生物牢固的連接，生物素衍生物和鏈霉親和素磁珠表面的鏈霉親和素連接，相對(duì)于物理吸附的方式，更加易于控制磁珠表面的改性心磷脂量，并且可以通過調(diào)節(jié)-R-的長(zhǎng)度，實(shí)現(xiàn)改性心磷脂量與納米磁珠之間的距離的控制，更好的保留了改性心磷脂量與抗磷脂抗體結(jié)合的空間。制得的改性心磷脂包被的納米磁珠可以直接用于抗磷脂抗體的檢測(cè)，并且相對(duì)于傳統(tǒng)物理吸附心磷脂的方法制備的檢測(cè)產(chǎn)品，具有較高的穩(wěn)定性。
此外，由于每個(gè)鏈霉親和素能與4個(gè)生物素緊密結(jié)合，制得的改性心磷脂包被的納米磁珠通過生物素-鏈霉親和素放大效應(yīng)，使被檢測(cè)信號(hào)放大了4倍，極大的提高了抗磷脂抗體的檢測(cè)靈敏度。
以下為具體實(shí)施例。
實(shí)施例1：改性心磷脂的制備
氬氣保護(hù)下，將0.5mmol心磷脂溶于1mL無水甲苯中，加入1.5mmol的間氯過氧苯甲酸，攪拌中逐漸加熱升溫至110℃，并維持該溫度反應(yīng)72小時(shí)。將反應(yīng)液冷卻至室溫后，倒入25mL冰水中，再用20mL乙酸乙酯萃取溶液3次，合并乙酸乙酯。將合并的乙酸乙酯溶用10mL飽和氯化鈉溶液洗滌1次后，加入無水硫酸鈉干燥12小時(shí)。液負(fù)壓下蒸干乙酸乙酯，殘余的固體加入至8mL濃氨水中，攪拌下逐漸加熱升溫至100攝氏度，并維持該溫度反應(yīng)8小時(shí)。負(fù)壓下蒸干反應(yīng)液，得到黃色粘稠狀液體，用少量甲醇溶解后，用0.2μm濾膜過濾掉不溶物質(zhì)，溶液用制備液相色譜純化，得到約83mg白色固體。S(ESI+,m/z):1495.29113。
實(shí)施例2：生物素衍生物結(jié)合的改性心磷脂的制備
稱取50mg實(shí)施例1制得的改性心磷脂溶于2mL無水DMF中，攪拌下加入20mg生物素衍生物NHS酯，于室溫下攪拌反應(yīng)2.5小時(shí)。減壓下蒸干反應(yīng)液，殘余固體用5mL乙酸乙酯溶解，過濾不溶物，并將所得的乙酸乙酯溶解蒸干，得到的白色固體即生物素衍生物結(jié)合的改性心磷脂。
本實(shí)施例中，生物素衍生物的結(jié)構(gòu)式為：-R-為-(CH2)6-。
本實(shí)施例制備的生物素衍生物結(jié)合的改性心磷脂不需要經(jīng)過特別純化即可用于后續(xù)的使用。
實(shí)施例3：包被有改性心磷脂的鏈霉親和素磁珠的制備
取100μL濃度為0.2mg/mL的生物素衍生物結(jié)合的改性心磷脂的磷酸鹽緩沖液，加入100μL濃度為10mg/mL的鏈霉親和素磁珠，混勻后37℃孵育10分鐘。磁分離后用1mL 30mM Tris緩沖液復(fù)溶，復(fù)溶所得的混合液震蕩后再次磁分離，并將所得的固體用5mL 30mM Tris緩沖液復(fù)溶，得到0.02mg/mL的包被有改性心磷脂的鏈霉親和素磁珠溶液。
實(shí)施例4：包被有改性心磷脂的親和素磁珠與抗磷脂樣本反應(yīng)
分別取200μL實(shí)施例1～3中制備的包被有改性心磷脂的親和素磁珠溶液，加入5μL抗磷脂抗體血清樣本并于37℃孵育30分鐘。磁分離后將包被有改性心磷脂的鏈霉親和素磁珠復(fù)溶至200μL，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育30分鐘后依次清洗、加入TMB底物液并孵育10分鐘，再加入100μL終止液，10分鐘內(nèi)酶標(biāo)儀上讀取OD值，得到樣本的發(fā)光信號(hào)值。
分別取三個(gè)心磷脂陽性血清樣本和三個(gè)心磷脂陰性血清樣本，并且以傳統(tǒng)的物理吸附法為對(duì)照，對(duì)比測(cè)得的OD值，得到下表1。
表1：實(shí)施例1～3和對(duì)照組(物理吸附法)測(cè)量不同樣本的OD值
由表1可以看出，實(shí)施例1～3制備的包被有改性心磷脂的親和素磁珠與物理吸附法吸附的磁珠(對(duì)照組)在測(cè)試抗磷脂抗體樣本時(shí)的發(fā)光信號(hào)比較，實(shí)施例1～3制備的包被有改性心磷脂的親和素磁珠在測(cè)量陰性樣本時(shí)發(fā)光信號(hào)值較對(duì)照組顯著低(降低了1倍～4倍)，同時(shí)實(shí)施例1～3制備的包被有改性心磷脂的親和素磁珠在測(cè)量陽性樣本時(shí)發(fā)光信號(hào)較對(duì)照組有極大的提高(提高了3～10倍)。
由此說明，實(shí)施例1～3制備的包被有改性心磷脂的親和素磁珠在測(cè)量抗磷脂樣本時(shí)，相對(duì)于傳統(tǒng)的物理吸附法的磁珠，檢測(cè)靈敏度具有明顯提升。
以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。