本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種加壓素脫酰胺雜質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
：加壓素是由九個(gè)氨基酸殘基組成的合成多肽，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為加壓素的理論分子量1084.24。鞣酸加壓素為抗利尿激素藥，能促進(jìn)遠(yuǎn)端腎小管及集合管對(duì)水分的重吸收而具有抗利尿作用，其制劑臨床用于治療尿崩癥。目前國(guó)內(nèi)加壓素脫酰胺雜質(zhì)大多先是采用固相合成保護(hù)加壓素脫酰胺雜質(zhì)樹(shù)脂，再經(jīng)過(guò)裂解干燥得加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品(Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly的三氟乙酸鹽)，高度稀釋環(huán)化，純化，轉(zhuǎn)鹽等步驟，最終得到加壓素脫酰胺雜質(zhì)。高度稀釋環(huán)化由于樣品濃度稀，體積龐大，對(duì)于后期純化很不利?，F(xiàn)在還缺乏一種有效的制備含二硫鍵的多肽原料藥的方法，因此仍然迫切需要開(kāi)發(fā)新的含二硫鍵多肽的制備方法。就一個(gè)藥品而言，其中所含的少量雜質(zhì)是引發(fā)藥品副作用最重要的原因，因此對(duì)其純度的檢查是保證藥品安全有效性的重要基礎(chǔ)之一，而純度檢查的內(nèi)容，根據(jù)各個(gè)藥物的性質(zhì)和特點(diǎn)有些不同，但基本上均要涉及各自的“有關(guān)物質(zhì)”檢查研究。合成多肽的有關(guān)物質(zhì)主要來(lái)自合成過(guò)程中的工藝雜質(zhì)和由于多肽不穩(wěn)定而產(chǎn)生的降解產(chǎn)物、聚合物等雜質(zhì)，盡管目前合成多肽的純化工藝已經(jīng)有了很大進(jìn)步，但工藝雜質(zhì)仍是合成多肽有關(guān)物質(zhì)的重要來(lái)源，這主要是由于合成多肽的一些工藝雜質(zhì)(如缺失肽、斷裂肽、氧化肽、二硫鍵交換的產(chǎn)物等)與藥物本身的性質(zhì)可能非常近似，從而給純化造成了一定的難度。研究表明合成多肽中最常見(jiàn)的降解產(chǎn)物是脫酰胺產(chǎn)物、氧化產(chǎn)物、水解產(chǎn)物。在組成多肽的各種氨基酸中，天冬酰胺、谷胺酰胺和肽鏈C段酰胺易于發(fā)生脫酰胺反應(yīng)(尤其是在pH值升高和高溫條件下)。由于合成多肽中有些雜質(zhì)的性質(zhì)與目標(biāo)產(chǎn)品非常接近，因此建立適宜的方法充分檢出這些雜質(zhì)是合成多肽藥物有關(guān)物質(zhì)研究中面臨的巨大困難。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于為了克服現(xiàn)有技術(shù)中加壓素脫酰胺雜質(zhì)的制備工藝復(fù)雜、收率低、樣品濃度稀、體積龐大的缺陷，而提供了一種加壓素脫酰胺雜質(zhì)的制備方法。本發(fā)明的加壓素脫酰胺雜質(zhì)的制備方法以含一對(duì)游離巰基(-SH)的多肽粗品——加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品為起始原料，經(jīng)過(guò)高壓液相反相色譜環(huán)化、純化和脫鹽步驟，制備高純度的加壓素脫酰胺雜質(zhì)的方法。本發(fā)明的多肽是加壓素制備過(guò)程中的1個(gè)關(guān)鍵雜質(zhì)，因此可作為加壓素檢測(cè)過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，對(duì)加壓素以及雜質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，對(duì)于提高加壓素的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，控制產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題的：本發(fā)明提供了一種加壓素脫酰胺雜質(zhì)的制備方法，其包括下述步驟：采用高效液相反相色譜法將加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品溶液依次進(jìn)行反相環(huán)化、反相純化、反相脫鹽，即可；高效液相反相色譜法的填料為苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物；所述的加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品為含兩游離巰基的加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品；所述的加壓素脫酰胺雜質(zhì)為其中，所述的加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品較佳地為采用固相合成法經(jīng)過(guò)裂解干燥制得的加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品，HPLC純度為60～90％；所述的加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品的結(jié)構(gòu)式為Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly的三氟乙酸鹽。其中，所述的加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品溶液較佳地為加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品溶于體積百分比濃度為5％的乙腈水溶液形成的5g/L溶液。本發(fā)明中，所述的反相環(huán)化、反相純化、反相脫鹽均是在一步的反相洗脫過(guò)程中完成。其中，所述的反相環(huán)化、反相純化、反相脫鹽的條件優(yōu)選如下：流動(dòng)相A1為純水，A2為體積百分比0.01～0.05％(較佳的為0.02～0.03％)的H2O2pH為7.5～9.0的NaOH水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相C1為所述的加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品溶液，流動(dòng)相C2為0.1mol/L的NaOH溶液，流速為180～220mL/min(較佳的為200mL/min)，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm；按照下表的條件進(jìn)行在線上樣、洗脫，百分比為體積百分比；洗脫步驟洗脫時(shí)間洗脫液10～10min100％C1210.1～25min75％A1+5％B+20％C2325.1～40min95％A1+5％B440.1～45min95％A2+5％B545.1～60min95％A1+5％B660～75min95％A1+5％B→80％A1+20％B775～90min80％A1+20％B→73％A1+27％B890～105min50％A1+50％B9105～115min95％A1+5％B收集保留時(shí)間為75～90min的洗脫液即得到加壓素脫酰胺雜質(zhì)溶液。其中，所述的高效液相反相色譜法的裝填條件優(yōu)選如下：填料為安捷倫PLRP-S苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物，孔徑10nm，粒徑10μm。加壓素脫酰胺雜質(zhì)是一種多肽物質(zhì)，在堿性條件下不穩(wěn)定，易降解，尤其是強(qiáng)堿環(huán)境下，本發(fā)明綜合考察了堿洗脫的濃度和時(shí)間，以保證減少脫鹽過(guò)程中樣品的破壞及損失。本發(fā)明創(chuàng)新點(diǎn)在于將環(huán)化、純化和脫鹽一步反相得到多肽純品，加壓素脫酰胺雜質(zhì)含有兩巰基并含有堿性氨基酸，傳統(tǒng)工藝環(huán)化和純化分步進(jìn)行，而且環(huán)化的體積龐大，增加了純化的難度，為了快速高效的環(huán)化和制備工藝，設(shè)計(jì)出聚合物填料PLRP-S苯乙烯-二乙烯基苯的最新應(yīng)用。本發(fā)明創(chuàng)新性運(yùn)用了反相吸附法環(huán)化、純化和脫鹽，一次性解決環(huán)化、純化和脫鹽的問(wèn)題。在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：(1)本發(fā)明采用在線環(huán)化的方法，先將還原型多肽粗品吸附到固定相上，利用多肽和反相填料的疏水結(jié)合，在色譜柱上先堿性洗脫強(qiáng)結(jié)合的酸根離子、再中性洗脫游離的羥基，并采用pH偏堿的含H2O2的流動(dòng)相沖洗，促使兩巰基成二硫鍵，獲得目標(biāo)多肽粗品，樣品保留在色譜柱上。(2)本發(fā)明采用在線環(huán)化，環(huán)化的樣品避免洗脫，可直接變換流動(dòng)相后進(jìn)行梯度洗脫純化，得到最終的純品，適合連續(xù)的生產(chǎn)。(3)本發(fā)明創(chuàng)新性地運(yùn)用了反相吸附環(huán)化、純化、脫鹽一步法制得多肽純品，優(yōu)化了生產(chǎn)工藝，適合工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)。具體實(shí)施方式下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書(shū)選擇。下述實(shí)施例中，加壓素脫酰胺雜質(zhì)為實(shí)施例1實(shí)施例1(HPLC法檢測(cè)加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品和純化后產(chǎn)品溶液純度)儀器：Waters2695/2489高效液相色譜儀分離柱：AgilentXDB-C184.6×250mm，5μm流動(dòng)相：A為體積百分比為0.1％TFA水溶液，B為體積百分比為0.1％TFA-50％的乙腈水溶液(TFA為三氟乙酸)流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，室溫檢測(cè)，洗脫梯度見(jiàn)下表，百分比為體積百分比。洗脫步驟洗脫時(shí)間洗脫液10～5min95％A+5％B25～25min95％A+5％B→50％A+50％B325～30min100％B430～35min95％A+5％B實(shí)施例2(75mm內(nèi)徑L&L4003制備柱裝填)運(yùn)用Load&Lock動(dòng)態(tài)軸向壓縮和靜態(tài)鎖緊技術(shù)，填料為苯乙烯-二乙烯苯共聚物(反相填料安捷倫PLRP-S)，孔徑10nm，粒徑10μm，裝柱密度0.33g/mL，裝填至柱床壓力650psi，采用Varian色譜裝填系統(tǒng)，370g干粉填料，2L甲醇攪拌勻漿后，倒入內(nèi)徑75mmL&L4003制備柱，壓縮比為3:1，載氣為N2，調(diào)節(jié)載氣壓力使得油壓表壓力為2000psi，動(dòng)態(tài)軸向壓縮至柱床高度26cm，作為反相環(huán)化、反相純化和反相脫鹽方案所用的制備柱。實(shí)施例3加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品原料的反相環(huán)化、反相純化和反相脫鹽儀器：VarianSD-1高壓液相制備系統(tǒng)色譜柱：實(shí)施例2自裝的制備柱Load&Lock400375×260mm，PLRP-S10μm10nm加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品為采用固相合成法經(jīng)過(guò)裂解干燥制得的加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品，結(jié)構(gòu)式為Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly的三氟乙酸鹽。加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品溶液為上述加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品溶于體積百分比濃度為5％的乙腈水溶液形成的5g/L溶液。流動(dòng)相A1為純化水，A2為體積百分比0.03的H2O2pH為7.5的NaOH水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相C1為所述的加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品溶液(采用固相合成法制得的加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品)，按實(shí)施例1的方法測(cè)定其HPLC純度為83.77％，保留時(shí)間為12.6min，流動(dòng)相C2為0.1M的NaOH溶液。本實(shí)施例的反相環(huán)化、反相純化和反相脫鹽條件如下：流速200mL/min，220nm檢測(cè)，純化洗脫梯度見(jiàn)下表所示，百分比為體積百分比。洗脫步驟洗脫時(shí)間洗脫液10～10min100％C1210.1～25min75％A1+5％B+20％C2325.1～40min95％A1+5％B440.1～45min95％A2+5％B545.1～60min95％A1+5％B660～75min95％A1+5％B→80％A1+20％B775～90min80％A1+20％B→73％A1+27％B890～105min50％A1+50％B9105～115min95％A1+5％B收集保留時(shí)間為75～90min的洗脫液得到加壓素脫酰胺雜質(zhì)溶液。按實(shí)施例1的方法測(cè)定其HPLC純度為99.45％，保留時(shí)間為9.49min。實(shí)施例4加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品粗品原料的反相環(huán)化、反相純化和反相脫鹽儀器：VarianSD-1高壓液相制備系統(tǒng)色譜柱：實(shí)施例2自裝的制備柱Load&Lock400375×260mm，PLRP-S10μm10nm加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品為采用固相合成法經(jīng)過(guò)裂解干燥制得的加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品，結(jié)構(gòu)式為Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly的三氟乙酸鹽。加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品溶液為上述加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品溶于體積百分比濃度為5％的乙腈水溶液形成的5g/L溶液。流動(dòng)相A1為純化水，A2為體積百分比0.02的H2O2pH為9.0的NaOH水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相C1為所述的加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品溶液(采用固相合成法制得的加壓素脫酰胺雜質(zhì)前體粗品)，按實(shí)施例1的方法測(cè)定其HPLC純度為83.77％，保留時(shí)間為12.6min，流動(dòng)相C2為0.1M的NaOH溶液。本實(shí)施例的反相環(huán)化、反相純化和反相脫鹽條件如下：流速200mL/min，220nm檢測(cè)，純化洗脫梯度見(jiàn)下表所示，百分比為體積百分比。洗脫步驟洗脫時(shí)間洗脫液10～10min100％C1210.1～25min75％A1+5％B+20％C2325.1～40min95％A1+5％B440.1～45min95％A2+5％B545.1～60min95％A1+5％B660～75min95％A1+5％B→80％A1+20％B775～90min80％A1+20％B→73％A1+27％B890～105min50％A1+50％B9105～115min95％A1+5％B收集保留時(shí)間為75～90min的洗脫液得到加壓素脫酰胺雜質(zhì)溶液。按實(shí)施例1的方法測(cè)定其HPLC純度為99.40％，保留時(shí)間為9.48min。實(shí)施例5(加壓素脫酰胺雜質(zhì)的質(zhì)譜檢測(cè))采用watersmicromassZQ單重四級(jí)桿電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)測(cè)定實(shí)施例3、4得到的加壓素脫酰胺雜質(zhì)的分子質(zhì)量峰[M+1]+測(cè)定值1086.33，主要離子碎片峰[M+2]2+測(cè)定值543.70，都符合理論值1085.24。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3