專利名稱：連續(xù)式高處理量篩選的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用了至少一種多孔基質(zhì)的連續(xù)式高處理量篩選方法 (Continuous format high throughput screening, CF-HTS ), 該方法使 得制藥工業(yè)能夠同時對大量生物學(xué)或生化活性分布廣泛的化學(xué)實(shí)體進(jìn)
行篩選。此外，CF-HTS也可用于進(jìn)行多步驟的檢測實(shí)驗(yàn)。
背景技術(shù)：
生物學(xué)和生物化學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)的設(shè)計是為了對各種各樣系統(tǒng)的活性進(jìn)
行測試，其中包括從蛋白-蛋白相互作用、Sl^化、小分子-蛋白結(jié)合
到細(xì)胞功能。在"高處理量篩選方法"(HTS)中應(yīng)用了這些檢測實(shí)驗(yàn)測 試大量化學(xué)實(shí)體以探索這些化學(xué)實(shí)體先前未知的生物學(xué)或生物化學(xué)功能
一步(homogenous)和多步(heterogeneous)檢測實(shí)驗(yàn) 所有不同種類的生物學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)都可歸成兩個大類 一步檢測實(shí)驗(yàn)
和多步檢測實(shí)驗(yàn)。在一步檢測實(shí)驗(yàn)中，同時加入所有的試劑，并測量或 解釋結(jié)果而無需另外的操作。例如，在皮氏培養(yǎng)亞中培養(yǎng)的細(xì)胞可用化 學(xué)物質(zhì)處理。如果化學(xué)物質(zhì)對細(xì)胞是毒性的可通過簡單地觀察變清澈的 區(qū)域而判斷毒性。另一個例子是可以使用表達(dá)蛋白的細(xì)胞，所有表達(dá)蛋 白能改變該細(xì)胞的顏色。生長于含X-gal瓊脂上的表達(dá)p-半乳糖苷酶 (P-gal)的細(xì)胞這個例子中，根據(jù)P-gal蛋白表達(dá)量的不同細(xì)胞會不 同程度地變藍(lán)。因此對于任何影響報告基因，如p-半乳糖苷酶基因表達(dá) 的生物學(xué)過程，可設(shè)計一個一步檢測實(shí)驗(yàn)。 一步檢測實(shí)驗(yàn)的另一例子是 利用一種在酶的作用下改變顏色或焚光的底物。最后，如Amersham的 鄰近閃爍檢測(Scintillation Proximity Assays, SPA )，這樣的技術(shù)能直接 測量放射性標(biāo)記的配基與固定到含閃爍劑小珠上的蛋白或任何配基結(jié)合物質(zhì)的結(jié)合。以上所有的例子都是一步檢測實(shí)驗(yàn)的例子，因?yàn)樗鼈兂?在最后的探測、測量或讀取信號之前加入試劑外不需要任何另外的步驟
另一方面，多步檢測實(shí)驗(yàn)需要至少兩個不能合并成一步的步驟，因 為這些步驟不同程度上固有地不相容。例如，許多多步檢測實(shí)驗(yàn)要求按 一定的順序加入試劑(例如一些試劑將影響前面的步驟，但對于完成后 面的步驟又是必須的)。這種情況的常見例子包括需要加入信號顯示試劑 以間接地報告反應(yīng)產(chǎn)物的存在或濃度的檢測實(shí)驗(yàn)。在多步檢測實(shí)驗(yàn)中另 一常見的步驟是洗滌步驟。在檢測實(shí)驗(yàn)前期步驟中通常需要加入過量檢 測試劑，但在隨后的步驟中需要洗去以便隨后進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)不會出現(xiàn)過高 的背景信號。例如，在放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，首先將標(biāo)記的配基與結(jié) 合到固相表面上的蛋白溫育，但這些配基中只有一小部分真正結(jié)合有限 的蛋白位點(diǎn)。溫育后，在能準(zhǔn)確測量結(jié)合的放射性配基之前，必須將過 量的未結(jié)合配基洗去。洗滌可通過多種供選的方法完成，包括過濾、重 復(fù)洗滌/倒干、沉淀/分相和/或離心。
許多生物學(xué)和生物化學(xué)過程只能通過多步檢測方法測量。進(jìn)而，盡
管存在通過調(diào)整其他生物學(xué)或生物^:學(xué)過程使之適合一步法的途徑，但 使用多步法可使這些其他過程更有效地發(fā)揮作用，或可以使用更容易得 到的試劑進(jìn)行操作。給出的多種一步檢測技術(shù)的方法和試劑盒如SPA
(Amersham)，熒光極化(Jolley公司和其它公司)和時間分辨熒光技 術(shù)(Packard公司和其它公司)中只有少數(shù)是可由商業(yè)途徑獲得。而且， 使用這些方法總是需要更多的費(fèi)用和時間。對于多數(shù)檢測而言，多步法 可以更好地建立，并且更易于快速顯示結(jié)果。因此，多步法，如ELISA、 過濾結(jié)合、RIA、熒光素酶細(xì)胞檢測實(shí)驗(yàn)等等的應(yīng)用仍然很廣泛。下文將 就這些方法中的一些做法更為詳細(xì)地描述。 高處理量篩選(HTS)
多年以來，制藥工業(yè)越來越依賴于篩選化合物庫的HTS以發(fā)現(xiàn)候選 藥物。HTS是指一種平行測試許多離散化合物以便同時或幾乎同時篩選 大量測試化合物的生物學(xué)活性。目前，使用最廣泛的方法采用了 96孔微 量滴定板。在這種方式中，在一塊含96個反應(yīng)孔的8cmxl2cm的塑料板 上同時進(jìn)行96個獨(dú)立的測試。這些孔要求的檢測容量通常為50-500nl 。對于許多一步和多步檢測實(shí)驗(yàn)而言，除了板外，還可從商業(yè)途徑獲得多種與這種96孔板方法配套的儀器、材料、移液器、機(jī)器人、洗板機(jī)、 和讀板儀等等。
迄今為止，改進(jìn)HTS的努力集中于使孔更小(小型化)。因?yàn)槿绻?減小孔的大小就可以增加每塊板上孔的數(shù)量，從而提供更多的平行測試 。進(jìn)而，通過減小檢測實(shí)驗(yàn)的體積可以減小每次測試的試劑費(fèi)用。進(jìn)而， 因?yàn)榭梢愿〉捏w積進(jìn)行更多的平4亍測試，從而可以同時測試更多化合 物以發(fā)現(xiàn)候選藥物。目前為止，通過提供384孔(96x4)的方式稍稍改 進(jìn)了 96孔才支術(shù)，參見Comley et al" J. Biomol. Screening, vol.2(3)，
pp.ni-78(1997)。事實(shí)上，密度更大的方式已有報道，包括moo孔的方 式。但是，小型化必然會帶來費(fèi)用和復(fù)雜性的問題，
這些費(fèi)用和復(fù)雜性問題與使篩選方式小型化的三個主要部分直接相
關(guān)。首先，必須能使測試容器(管、孑L、凹窩等等)小型化。其次，必
須能將所有必需的測試試劑精確地分加到更多且更小的孔中(通常通過 液體處理機(jī)器人加入到多個孔中而完成)。第三，必須能從高密度的排列 "讀取"測試結(jié)果。
就平行獨(dú)立檢測實(shí)驗(yàn)的要求而言，各種部分都挑戰(zhàn)或限制著多大程 度上小型化是可行的，或在費(fèi)用上是有效的.例如， 一種新的更小型的 方式可能需要完全不同的分加試劑的方法，或需要分辨率、靈敏度、和 工程技術(shù)上與新的小型化方式相容的讀數(shù)儀器。如果減小了每個孔的大 小，那么制造容器陣列、分加更小量試劑和每個測試樣品的讀數(shù)變得更 困難，更消耗時間并更昂貴。并且，由于分加更小體積的試劑和測量更 弱的樣品信號時固有的不準(zhǔn)確性，更小的樣品量也將增加樣品與樣品之 間的統(tǒng)計可變性。進(jìn)而，當(dāng)樣品量減小到一定水平以下時，諸如蒸發(fā)和 表面張力這樣的因素甚至給實(shí)施新的小型化方式增加了更高的費(fèi)用和更 大的復(fù)雜性，
對于HTS技術(shù)在量上的進(jìn)步，制藥工業(yè)急切需要"自由式檢測實(shí)驗(yàn) "或在樣品之間無物理隔離的可能。這種技術(shù)通常被想象為在沒有任何 孔的情況下測試小液滴，但真正用常規(guī)的離散化合物匯集進(jìn)行自由式的 HTS檢測還未見報道。
組合文庫的篩選—膠滲入方法
隨著組合化學(xué)的到來，可以在固相支持物(通常為小珠)上迅速生 產(chǎn)以百萬計的化學(xué)實(shí)體。盡管96孔方式正被用于篩選基于小珠的文庫，但是這種方式通常被認(rèn)為效率不高，因?yàn)?1)每個小珠只帶有小量的化
學(xué)實(shí)體；(2)待測試的化合物數(shù)量極其大；(3)將小珠加入96孔微孔板 的操作很困難。
為了避免用96孔方式篩選組合文庫時固有的問題，有些人報道了可 被稱為"自由式"的簡單一步檢測法的應(yīng)用。舉個例子，Jayawickreme et al在Proc. Nat，l Acad. Sci. (USA), vol.191, pp.1614-18 (March,1994)中報 道了在組合肽庫的一個簡單一步檢測中使用了色素細(xì)胞(黑色素細(xì)胞)。 根據(jù)作者，他們將細(xì)胞放在有蓋培養(yǎng)亞中的瓊脂下，然后將帶有組合化 合物的小珠放在瓊脂的表面上，讓化合物從小珠上部分釋放到瓊脂中。 活性物質(zhì)表現(xiàn)為黑色區(qū)域，因?yàn)楫?dāng)化合物局部擴(kuò)散到凝膠介質(zhì)中時，該 活性物質(zhì)^t細(xì)胞改變顏色。
另 一個最近的例子是Daniel Chelsky在Philad印hia， PA的生物分子 篩選協(xié)會第一屆年會(First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening ) (1995年11月7 - 10日)上報道的"組合文庫 篩選策略傳統(tǒng)方法和新方法"。Chelsky在瓊脂凝膠中放置了一種檢測 羰基脫水酶的簡單一步檢測法，使得凝膠中的這種酶能使整個凝膠變色 。隨后，加入通過光敏連接而帶有組合化合物的小珠加入到凝膠中，并 通過紫外線部分釋放化合物.抑制酶活性的化合物表現(xiàn)為顏色改變較少 的局部抑制區(qū)。最后在Molecular Diversity v 2， pp 57-64 (1996)中Salmon 等人報道了 一種類似Jayawickreme等人的方法，其中組合化合物文庫是 用于篩選對生長在瓊脂上的癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng)的化合物。
所有的三個例子都是抗細(xì)菌或抗癌物質(zhì)的久經(jīng)試驗(yàn)的凝膠檢測的變 體，它們還與熟悉的在凝膠中測量抗原/抗體反應(yīng)的免疫學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)類似 。盡管這些凝膠滲入檢測實(shí)驗(yàn)非常適合篩選基于小珠的組合文庫，還沒 有人報道將這種方式擴(kuò)展到多步檢測實(shí)驗(yàn)或不基于小珠的文庫。常識阻 礙研究者以連續(xù)的方式測試樣品，因?yàn)檫@種方式會使樣品混合。在報道 的有限種檢測實(shí)驗(yàn)和對以連續(xù)方式檢測時多種樣品會混合在一起的關(guān)注 中，只有基于小珠的文庫檢測測試。由于這些限制，研究者相信96孔方 式更適于多步的和不基于小珠的文庫篩選。在自由方式裝置中進(jìn)行多步 檢測將是合乎需要的。進(jìn)而，在自由方式設(shè)置中測試離散化合物將是合 乎需要的。發(fā)明概述
在此描述的發(fā)明，連續(xù)式高處理量篩選(CF-H)，成功地補(bǔ)充了任 何能在96孔方式中完成的一步或多步檢測實(shí)驗(yàn)的自由方式的概念。此夕卜， CF-HTS還可用于通過多步檢測，而不僅僅是一步檢測，篩選組合文庫 。進(jìn)而，CF-HTS能檢測離散復(fù)合物并能同時避免小型化帶來的費(fèi)用和 復(fù)雜性問題?；瘜W(xué)試劑和測試結(jié)果在后續(xù)的步驟中可能混在一起的擔(dān)心 被證明是沒有根據(jù)的。
本發(fā)明的一個實(shí)施例涉及通過以下方法測試樣品的生物學(xué)或生物化 學(xué)活性
a) .將多種待測樣品引入到多孔檢測基質(zhì)中，多孔檢測基質(zhì)可供選地 含有一種或多種檢測組分；
b) 用至少一種基質(zhì)引入一種或多種檢測組分進(jìn)行檢測，其中該基質(zhì)可 以是也可以不是多孔檢測基質(zhì)；以及
c) 進(jìn)行以下步驟
i ).洗滌檢測中使用的任一基質(zhì)以除去過量的待測樣品、檢測組分或 其組合。
ii).將檢測中使用的任一基質(zhì)與溶于溶液中或液體形式的另 一種試劑 接觸。
另 一實(shí)施例涉及通過將多種待測樣品引入到多孔檢測基質(zhì)中，多孔 檢測基質(zhì)可供選地含有一種或多種檢測組分，測試樣品的生物學(xué)或生物 化學(xué)活性，并使用至少兩種另外的基質(zhì)進(jìn)行檢測實(shí)驗(yàn)。
而另 一實(shí)施例涉及將96種以上的待測樣品引入到多孔檢測基質(zhì)中， 多孔檢測基質(zhì)可供選地含有一種或多種檢測組分；同時測試96種以上待 測樣品的生物學(xué)或生物化學(xué)活性。
附圖簡述


圖1示明在非多孔基質(zhì)上的gELISA待測樣品與含檢測試劑的多孔膠 基質(zhì)的一側(cè)接觸，該檢測試劑再順次與含另一種檢測試劑的非多孔基質(zhì) 接觸。
圖2示明除去gELISA測試樣品基質(zhì)和多孔Ji^質(zhì)，然后通過洗滌和 加入液體或溶液形態(tài)的試劑以在非多孔基質(zhì)上形成受體復(fù)合物。
圖3示明通過將受體復(fù)合物基質(zhì)與含受體底物的多孔膠基質(zhì)接觸而顯現(xiàn)gELISA的結(jié)果。圖4示明配基基質(zhì)是怎樣被施加到濾器上的與帶有細(xì)胞一面相對的 那一面上。圖5示明當(dāng)顯現(xiàn)檢測結(jié)果時，帶細(xì)胞的濾器表面可能產(chǎn)生的現(xiàn)象。 圖6顯示使用不同濃度的已知劑量依賴性抑制劑檢測VanA時的結(jié)果圖7示明用不同濃度已知抑制劑檢測EF - 3的結(jié)果。圖8示明蛋白-蛋白相互作用的gELISA檢測對照實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖9示明"抑制"蛋白-蛋白相亙作用的gELISA結(jié)果。圖10顯示放射性標(biāo)記的ITAM對固定的LCK的結(jié)合具有劑量依賴性。圖11將象素值對ITAM濃度作圖顯示出典型的受體—配基結(jié)合曲線圖12示明放射性標(biāo)記的IL-8的配基-細(xì)胞結(jié)合的對照實(shí)驗(yàn)。圖13示明對IL-8配基-細(xì)胞相互作用的"抑制"。圖14示明一個神經(jīng)氨酸酶抑制劑的檢測實(shí)驗(yàn)。圖15示明同時檢測10, 080個離散化合物對神經(jīng)氨酸酶的抑制。發(fā)明詳述在CF-HTS之后的中心思想是將待測樣品置于一個多孔介質(zhì)的環(huán) 境中。該方法包括將一種或多種檢測組分放在基質(zhì)如凝膠、塑料片、濾 器或易于操作的其它固體支持物之上或之中或底部。當(dāng)樣品被引入到多 孔基質(zhì)后，它們的擴(kuò)散足夠緩慢從而使得可進(jìn)行檢測實(shí)驗(yàn)而不會導(dǎo)致待 測樣品混合在一起。因此，CF-HTS是通過擴(kuò)散，而不是通過不可滲透 的障礙分開樣品。如果檢測實(shí)驗(yàn)進(jìn)行得太久那么測試樣品和結(jié)果最終會 混合在一起。然而，如果仔細(xì)控制時間的話，CF-HTS允許同時但各自 獨(dú)立地篩選高密度的化合物而不需往每個單獨(dú)的孔或容器里加溶液或檢 測組分。進(jìn)而，通過對帶有反應(yīng)組分的基質(zhì)的操作，甚至可以用這種方 式進(jìn)行復(fù)雜的多步檢測實(shí)驗(yàn)。通過對基質(zhì)的操作進(jìn)行多步檢測實(shí)驗(yàn)是完 全沒有先例的，它使得CF-HTS在廣泛的生物學(xué)和生物化學(xué)過程的篩選 中與96孔方式具有同樣的靈活性。進(jìn)而，CF-HTS達(dá)到了小型化所預(yù) 期的長處而沒有其缺點(diǎn)，并具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。CF-HTS可應(yīng)用多種基質(zhì)和檢測組分?；|(zhì)包括，但不限于，由瓊 脂糖、丙烯酰胺或其它凝膠狀物質(zhì)桑且成的凝膠、膜、濾器、塑料等等。 基質(zhì)的材料組成包括，但不限于，聚苯乙烯、聚丙烯、其它塑料、紙纖 維、玻璃、玻璃纖維、硅膠、聚碳酸酯、聚酯、聚偏氯乙烯和聚乙烯。 基質(zhì)可以是不滲透的固體、多孔固體如濾器、或凝膠。檢測組分包括， 但不限于，大分子如核酸、蛋白、和其它合成或天然大分子；細(xì)胞，細(xì) 胞裂解液、生物抽提物、有機(jī)體和其它復(fù)雜生物實(shí)體和混合物；以及小 分子如緩沖劑、鹽、抑制劑、底物、多肽、染料、核苷酸、輔助因子、 離子和溶劑。CF - HTS檢測實(shí)驗(yàn)是指通過擴(kuò)散而非通過不可滲透的障礙將多個待 測樣品或化合物隔離開的檢測實(shí)驗(yàn)。重要的組成步驟是將多個(一個以 上)待測樣品引入到供選地含有一種或多種檢測組分的多孔檢測基質(zhì)之 中或之上。含有檢測組分的多孔檢測介質(zhì)是通過將組分添加、混合、倒 入、分配、或浸泡加入基質(zhì)制備而成的.還可將檢測組分偶聯(lián)、覆蓋、 結(jié)合、固定、連接、交聯(lián)、或附接到基質(zhì)中或基質(zhì)的表面上而制備多孔 基質(zhì)。進(jìn)而，可通過在一層細(xì)胞、酶或其它固定的檢測組分上形成一層 液體或溶液薄膜而制備多孔基質(zhì)。多孔檢測基質(zhì)被用于控制組分加入的 順序和/或持續(xù)時間，以及控制多種組分聯(lián)合使用時混合和擴(kuò)散的程度。CF - HTS也可使用非多孔基質(zhì)。非多孔基質(zhì)是通過將檢測組分或待 測樣品偶聯(lián)、覆蓋、結(jié)合、固定、連接、交聯(lián)、或附接到非多孔基質(zhì)的 表面上而制備的。在CF-HTS中，非多孔基質(zhì)的應(yīng)用在空間上固定了一 種或多種檢測組分。當(dāng)將檢測組分引入到基質(zhì)表面時，檢測組分與經(jīng)過非衍生化、衍生 化或其它預(yù)處理以促進(jìn)檢測組分結(jié)合的基質(zhì)通過共價或非共價的、特異 或非特異的相互作用結(jié)合在一起。結(jié)合后，檢測組分在空間上被固定從 而滿足檢測實(shí)驗(yàn)對固定化的需要。在這種情況下或者待測樣品應(yīng)能擴(kuò)散 通過基質(zhì)到達(dá)檢測組分，以及/或者檢測組分的亞組分或產(chǎn)物應(yīng)能擴(kuò)散通 過基質(zhì)到達(dá)測試樣品。至少一種含待測樣品的多孔基質(zhì)被用于以下步驟中的任何一步或多步。(1)使多孔基質(zhì)的表面與至少一種其它(多孔或非多孔)基質(zhì)接觸， 使得樣品和/或一種或多種檢測組分能擴(kuò)散通過界面。(2) 分開兩種或多種基質(zhì)以停止組分和/或樣品的反應(yīng)。(3) 使兩種或多種基質(zhì)的表面接觸，使得檢測組分能反應(yīng)。(4) 用緩沖液或其它溶劑洗條、漂洗或洗脫基質(zhì)以除去未結(jié)合和/ 或非特異性結(jié)合的檢測組分。(5) 將溶液中的檢測組分分配、倒入、加入或浸泡入基質(zhì)或?qū)⑸鲜?組分過濾通過基質(zhì)。(6) 通過顯象、讀數(shù)、掃描、探測或其它方法，顯現(xiàn)一種或多種基 質(zhì)中的放射性測定的、熒光的、分光光度法的或電磁的信號。CF-HTS提供了許多超過先前技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。由于沒有明顯的孔，從 而無需同時并準(zhǔn)確地將檢測組分或試劑分加入孔中.替代地，檢測組分 是通過一步大量處理進(jìn)行分加和混合的。由于檢測組分是制備成均一大 量的溶液或基質(zhì)，所以樣品之間的統(tǒng)計學(xué)差異被減小到最小。與之相比， 96孔方式中存在的孔產(chǎn)生了很大的樣品間差異。進(jìn)而，CF-HTS提供了大量化合物的極高密度的篩選。盡管觀察到 的選中樣品在有限程度上"混合"在一起，但只需要對選中樣品的鄰近樣 品進(jìn)行再次測試。這樣如果能將IO，OOO個測試樣品減少到顯現(xiàn)區(qū)域周圍 的50個候選樣品，甚至就可通過96孔技術(shù)從50種候選樣品中很容易地 篩選到活性化合物。通過在塑料片上將離散化合物分配并干燥成高度密集的排列，然后 對其進(jìn)行CF-HTS，就可致力于所有小型化的關(guān)鍵點(diǎn)。這種方式不需要 對塑料和其他材料做任何改進(jìn)就可實(shí)現(xiàn)小型化，因?yàn)樾⌒突呛唵蔚赝?過限制擴(kuò)散到基質(zhì)中的樣品量而實(shí)現(xiàn)的。這種方式也不需要通過微量流 量控制來分加反應(yīng)試劑，因?yàn)檎麄€檢測實(shí)驗(yàn)實(shí)質(zhì)上是在"一個大孔"里 進(jìn)行的，在這里試劑和溶液都是以批量的方式進(jìn)行操作的。只有待測樣 品需要通過微量流量控制分加.而且，這種方式存在的統(tǒng)計誤差也小得 多，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)者只需要在均一的基質(zhì)中尋找出不均一的固定區(qū)域。實(shí)驗(yàn) 者并不需要讀取和比較不同的孔。除了小型化預(yù)期的所有優(yōu)點(diǎn)外(費(fèi)用、 處理量、試劑用量、待測化合物用量)外，CF-HTS還提供了驚人的長 處，如以批量的方式操作檢測實(shí)驗(yàn)的大多數(shù)步驟。CF - HTS的一個中心特點(diǎn)是盡管在基質(zhì)的界面檢測組分和待測樣品 也不會快速地側(cè)向擴(kuò)散。例如，當(dāng)瓊脂糖凝膠被放在塑料板上時，在凝 膠的交界表面上有大量的液體。當(dāng)需要凝膠上的檢測組分和板上的檢測組分相互作用時(例如在ELISA的例子中)，凝膠中的組分能從凝膠擴(kuò) 散到板上是很關(guān)鍵的。但是，CF-HTS要求伴隨的側(cè)向擴(kuò)散相當(dāng)慢，以 使板上的反應(yīng)發(fā)生在凝膠中組分的初始位置附近。同樣的原則也適用于 凝膠之間、濾器之間或任何組合形式的表面之間(或任何其它基質(zhì))的 基質(zhì)-基質(zhì)界面。意識到這種擴(kuò)散《亍為是可控制的并通常適用于任何基 質(zhì)界面是沒有先例的，并與常識相反。將待測樣品或化合物引入到基質(zhì)中(如凝膠或潤濕的濾器)的一種 優(yōu)選方法是將小體積的每種樣品分配到一個表面上，如塑料片的表面上， 形成排列并干燥，從而使得沒有兩個樣品混合或重疊，并且每個處于特 定的位置。當(dāng)塑料片被放到基質(zhì)上時，樣品溶解并擴(kuò)散到基質(zhì)中，其位 置與它們在初始排列中的預(yù)定位置相對應(yīng)。將樣品分加到排列中的一種替代方法是將樣品分加到多孔基質(zhì)如濾 器上形成排列，每種樣品的分加體積足夠小以使得樣品不會在基質(zhì)中重 疊。在與另一種含有更多液體的基質(zhì)接觸后化合物擴(kuò)散并啟動檢測實(shí)驗(yàn)一種將基于小珠的組合化合物《1入基質(zhì)的優(yōu)選方法是將小珠隨機(jī)地 分加到一個表面上，如一個塑料片的表面上，或在表面上形成有序排列 。如果待測化合物是以不穩(wěn)定的連接共價吸附到小珠上的話，那么隨后 小珠從中釋放(切割)出待測化合物(光切割以及氣-相酸切割)為本 領(lǐng)域所熟知。然后每種化合物非共價地結(jié)合到其來源小珠所在的區(qū)域， 然后干的化合物可被引入到基質(zhì)之中或之上。一種將離散化合物引入基質(zhì)的替代方法是通過浸泡或其它方法使每 種化合物非共價吸附到小珠之中或之上。利用這種方法可以使大量的化 合物在小珠中一次混合同時每個小珠具有單一的化合物。然后可;f艮容易 地將小珠分散到一個表面上以引入到基質(zhì)中。這種方法完全不需對小體 積液體進(jìn)行操作。在CF-HTS篩選中，引入到基質(zhì)中的樣品初始排列是高度密集的， 以使得特定的活性區(qū)域在空間上覆蓋了 一種以上樣品的初始區(qū)域，然后 這些樣品中的每種都是觀察到的活性的潛在來源。對于更高的初始密度 而言，每個區(qū)域?qū)⒕哂懈嗟暮蜻x樣品，因?yàn)樵谝粋€特定區(qū)域內(nèi)將具有 多種樣品?；衔锟赡軘U(kuò)散到一起，但它們?nèi)匀痪哂兴鼈冏陨砜臻g上的 梯度，并且數(shù)量上不會在任何一個位置混合。因此，區(qū)域的中心將仍然與活性化合物在初始排列中的精確位置對應(yīng)。實(shí)際上，被選中的樣品是 很稀少的，這足以使得為確保從每個活性區(qū)域中鑒定出活性化合物而對 多個樣品進(jìn)行再測試的工作量是微不足道的。本發(fā)明的一個替代實(shí)施例是在檢測的基質(zhì)中引入物理障礙(從而嚴(yán) 格上說使得此方式不連續(xù))以限制樣品能擴(kuò)散的距離。例如分別含有一 種酶和底物的兩塊凝膠可被分別切成網(wǎng)眼狀("蛋糕切割器"，cookie-cutter),使得每塊凝膠被分成離散的區(qū)域。然后仍讓這兩塊凝膠 接觸，使得酶和底物在分割后的凝膠塊中擴(kuò)散到一起.然后將待測樣品 虧1入到分割后的凝膠塊中從而使得檢測實(shí)驗(yàn)是完全獨(dú)立的，在檢測與檢 測之間沒有擴(kuò)散。由于測試樣品之間引入了統(tǒng)計差異，并且由于固定了 體積從而限制了信號的高度密集排列，因而這個實(shí)施例明顯地喪失了 CF -HTS的一些優(yōu)點(diǎn)。但是，此實(shí)施例仍然具有基于凝膠的多步檢測實(shí)驗(yàn) 的優(yōu)點(diǎn)，它不需要往大量的平行反應(yīng)容器里分加檢測組分，并且它消除 了樣品的部分混合現(xiàn)象。 gELISA酶聯(lián)免疫吸附檢測實(shí)驗(yàn)(ELISA)是探測溶液中的配基與固定的受體 之間相互作用的多步檢測實(shí)驗(yàn)。ELISA需要多次的混合和洗滌步驟，這 些在96孔方式中難以進(jìn)^f亍，可以想象將96孔方式變成384孔方式時困 難更大。發(fā)明者將CF - HTS方法應(yīng)用于檢測對配基和固定的靶受體之間 結(jié)合的抑制(gELISA)。受體是能結(jié)合另一分子的任一分子。非限制性的例子包括蛋白、肽、 核酸、碳水化合物以及以上例子的復(fù)合物。受體被固定到幾種可能的基 質(zhì)中的一種(受體基質(zhì))的表面上，包括但不限于具有高靶結(jié)合容量的 塑料表面(例如有蓋平皿或塑料板(源自Nunc))、膜或?yàn)V器(例如硝酸 纖維素、尼龍或PVDF (Millipore， Corning Costar， Schleicher&Schue11， BioRad )或衍生的膜如SAM膜(Promega ))。多孔配基基質(zhì)(如瓊脂糖 凝膠或多孔膜)的制備，使得固定受體的配基可被加入到基質(zhì)之中或之 上。待測化合物或樣品被直接分加到配基基質(zhì)上或替代地被加入到待測 樣品基質(zhì)(例如聚苯乙烯(Tekra )、聚偏乙烯(例如源自Dow Brands的 )或其它柔性塑料片或膜)上.在適當(dāng)時間的溫育之后，將配基基質(zhì)與 受體基質(zhì)接觸，使得配基與樣品通過擴(kuò)散和受體接觸并發(fā)生可能的反應(yīng) 。(圖1示明固定受體R結(jié)合生物素標(biāo)記的配基LP)。在溫育中，除非樣品化合物抑制配基/受體的結(jié)合，配基將結(jié)合到固定的受體上。在適當(dāng)時間的溫育之后，將受體基質(zhì)移開并用適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌以 除去未結(jié)合的和非特異性結(jié)合的配基和樣品。然后將受體基質(zhì)浸泡在含 能與配基反應(yīng)的檢測試劑的溶液中(例如一種抗體、在生物素標(biāo)記的配 基的情況下的親和素或鏈霉親和素)，從而能直接(例如通過熒光或放射性)或間接(例如辣過氧化物酶(HRP )、堿性磷酸酶(AP )或P -半乳 糖苷酶)地檢測(圖2顯示結(jié)合到生物素標(biāo)記配基上的一種親和素-HRP 標(biāo)記物，AHRP)。在適當(dāng)?shù)臏赜?，從溶液中移開受體配基并洗滌以除 去未結(jié)合的和非特異性結(jié)合的試劑。在直接信號探測中，基質(zhì)用適當(dāng)?shù)?方法顯象(例如分光光度掃描儀，CCD照相機(jī)、膜、磷光顯象儀或閃爍 探測裝置)。非直接信號(如HRP或AP)需要另外的反應(yīng)來顯現(xiàn)信號， 這是通過將底物或其它必需的反應(yīng)《且分分加到多孔底物基質(zhì)之中或之上， 并使此基質(zhì)與受體基質(zhì)接觸而完成的。然后酶(例如HRP或AP)與底 物(圖3)反應(yīng)。替代地，可將可沉淀的底物引入到溶液中代替基質(zhì)。通 過任何可視方法，受體/配基結(jié)合區(qū)域?qū)a(chǎn)生可見的反應(yīng)，而受體/配基結(jié) 合受抑制的區(qū)域?qū)⒉划a(chǎn)生可見的反應(yīng)。 細(xì)胞/配基結(jié)合CF - HTS也能用于探測對配基/細(xì)胞受體結(jié)合的抑制。在傳統(tǒng)檢測實(shí) 驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)者在一個容器，如孔中混合待測化合物、放射性標(biāo)記配基和 表達(dá)相應(yīng)受體的細(xì)胞。然后提供充分的時間使受體結(jié)合配基，如果這樣 的結(jié)合不被測試化合物抑制的話。任何未結(jié)合的或非特異性結(jié)合的組分 都被從細(xì)胞上除去，然后測量與細(xì)J!包結(jié)合的放射性的量.本發(fā)明者將采 用CF - HTS方法來探測對配基和受體結(jié)合的抑制。將表達(dá)所需受體的細(xì) 胞生長在或鋪到基質(zhì)上(細(xì)胞基質(zhì))，例如，但不限于，凝膠、濾器或膜(例如Transwell組織培養(yǎng)膜(Corning Costar)或化學(xué)向性膜(Neuro Probe))。制備一種多孔基質(zhì)(如瓊脂糖凝膠或多孔膜)使得受體的標(biāo)記 配基被分配到基質(zhì)之上或之中(配基基質(zhì))。待測化合物或樣品被直接分 加到配基或細(xì)胞基質(zhì)之上，或替代地分加到另一基質(zhì)(例如聚苯乙烯(Tekra)、聚偏乙烯、或其它柔軟塑料片；樣品基質(zhì))之上或之中。使 樣品基質(zhì)與配基基質(zhì)接觸使得樣品擴(kuò)散到配基基質(zhì)上。在適當(dāng)時間的溫 育之后，將該配基基質(zhì)與細(xì)胞基質(zhì)接觸，優(yōu)選地在無細(xì)胞的一側(cè)接觸， 并使得配基和樣品通過擴(kuò)散與受體接觸并反應(yīng)。除非樣品抑制配基/細(xì)胞結(jié)合，否則在溫育過程中，標(biāo)記配基將結(jié)合到固定的細(xì)胞上。溫育后，將細(xì)胞基質(zhì)從配基基質(zhì)分開，并用適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌以除 去未結(jié)合的或非特異性結(jié)合的配基和樣品。細(xì)胞用恰當(dāng)?shù)姆椒@象(例如分光光度掃描儀，CCD照相機(jī)、膜、磷光顯象儀或閃爍探測裝置)(圖 5示明在一張膜上顯現(xiàn)檢測結(jié)果)。如上所述，CF - HTS能夠?qū)崿F(xiàn)"自由方式"檢測實(shí)驗(yàn)預(yù)期的全部優(yōu)點(diǎn)， 并能在所有不同類型的方式下，用不同的試劑和裝備，應(yīng)用于所有不同 類型的生物學(xué)或生物化學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)。由于其廣泛的應(yīng)用性，在以下的實(shí) 施例中得到了最好的闡明。然而，盡管這些實(shí)施例闡明了本發(fā)明的優(yōu)選 實(shí)施方案，但它們并不限制權(quán)利要求或說明書。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 很容易理解到，可以在不離開本發(fā)明的精神和范圍的前提下對特定的實(shí) 施例進(jìn)行變化和修改。最后，所有參考文獻(xiàn)在此引入作為參考。實(shí)施例實(shí)施例1:用于探測由萬古霉素抗性酶VanA產(chǎn)生的磷酸根的兩步比 色法凝膠檢測實(shí)驗(yàn)，VanA是萬古霉素抗性中的關(guān)鍵酶，它催化D -丙氨酸和D -丙氨酸 或D-丙氨酸和D-乳酸的連接。通常這種酶是通過使活性酶釋放的磷 酸根產(chǎn)生顏色而進(jìn)行檢測(VanA活性將ATP水解成ADP和磷酸根)。 科學(xué)家已知D-環(huán)絲氨酸以劑量依賴的方式抑制VanA， 并將這種抑制 劑作為其它潛在抑制劑的陽性對照.酶凝膠酶凝膠的制備是通過在45"C下往溶于50mM HEPES(N-[2-羥基乙基
哌溱-N， _ [2-乙磺酸)20 mM MgCl2， 20mM KC1， pH7.3中的熔融的1 % 瓊脂糖凝膠中加入VanA至終濃度2nM。然后將這種瓊脂混合物倒入到 BioRad凝膠成型裝置中，使之在2 - 8°C凝固30分鐘。底物凝膠底物凝膠的制備是通過往熔化的瓊脂中加入ATP、 D-丙氨酸、D-乳酸使它們的濃度分別達(dá)到lmM，1.5mM和1.75mM,然后按照酶凝膠的 方法制備。樣品基質(zhì)一系列順序稀釋的5000， 2000， 1000， 500, 200, lOO^M的D-環(huán)絲氨酸， 一種作為對照的抑制劑，溶于l: l乙醇-水中，取linl小樣分 加到一片聚偏氯乙烯(PVDC)膜上并干燥10分鐘。 將酶與底物在抑制劑的存在下^^育讓酶凝膠與樣品基質(zhì)接觸5分鐘。然后將底物凝膠放在酶凝膠的頂 部并溫育15-20分鐘。隨后將兩塊凝膠分離開。在溫育過程中，可預(yù)期 由于該酶催化底物的連接在整塊凝膠中產(chǎn)生磷酸根，只有D-環(huán)絲氨酸 的濃度足以抑制反應(yīng)的區(qū)域例外。檢測結(jié)果的觀察將由溶于1.33N HC1的0.15%孑L雀綠和1.4%鉬銨酸組成的新鮮制備 磷酸根檢測試劑倒入，并使之均一地分配到酶和底物凝膠上。這些試劑 與磷酸根反應(yīng)，隨著磷酸根濃度的濃度升高綠色背景加深。顯色5-10 分鐘(圖6示明在凝膠上的顯色，其中抑制劑的量為從5納摩爾到0.5納 摩爾)。用Stratagene Eagle Eye CCD相機(jī)對綠色的凝膠照相.如所預(yù)期 的那樣，看上去不那么綠的抑制區(qū)域與加入的抑制劑的濃度相對應(yīng)。因 此，通過將組合小珠或化合物分加到任何其它表面然后使之與檢測凝膠 接觸，這種檢測實(shí)驗(yàn)可用于篩選VanA的抑制劑。這個檢測實(shí)驗(yàn)還表明凝膠篩選方式可用于多步反應(yīng).此特征對于這 種方式在廣泛的檢測實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用是必需的，因?yàn)樵S多檢測實(shí)驗(yàn)需要進(jìn) 行許多步驟。在這個例子中，VanA檢測實(shí)驗(yàn)是在兩步酶活性測試后進(jìn)行 顯色反應(yīng)。此實(shí)驗(yàn)的一步(單一步驟)法方式是難以實(shí)行的，因?yàn)轱@色 的試劑和條件干擾VanA的活性，并且與在瓊脂凝膠中傳送不相容。因此， 在空間和溫度上將這兩個步驟分開，首先進(jìn)行酶凝膠實(shí)驗(yàn)然后進(jìn)行溶液 相的顯色反應(yīng)是合乎需要的，實(shí)施例2.用于檢測由核糖體激活的哞酒糖酵母延伸因子3的ATP 酶活性產(chǎn)生的磷酸根的一種兩步法凝膠實(shí)驗(yàn)當(dāng)真菌延伸因子3 (EF-3)與核糖體相互作用時，磷酸酶活性被激 活。本發(fā)明的發(fā)明者將CF-HTS應(yīng)用于檢測這種活性。制備了一種酶凝膠，其中含有EF-3 (—種對溫度高度敏感的酶) 和溶于EF-3檢測緩沖液中的酵母核糖體。還制備了含有溶于檢測緩沖 液的lmMATP的底物凝膠。兩種凝膠都在低熔點(diǎn)瓊脂糖(GibcoBRL) 中含有2%二甲亞砜，兩種凝膠的制備都是在37°C進(jìn)行并在4。C靜置30 分鐘。將聚_ L -賴氨酸的系列稀釋液點(diǎn)樣PVDC到膜上并干燥(樣品基質(zhì))， 一種EF-3抑制劑用作對照樣品，然后如在實(shí)施例1中那樣進(jìn)行檢 測實(shí)驗(yàn)，首先將酶凝膠與樣品基質(zhì)上的抑制劑預(yù)溫育，然后將酶凝膠與 底物凝膠接觸20分鐘。如在實(shí)施例1中那樣，用孔雀綠/鉬酸銨顯色混合 物對酶和底物凝膠進(jìn)行染色。然后用CCD相機(jī)對酶凝膠進(jìn)行拍照。在綠 色背景下抑制劑點(diǎn)表現(xiàn)為較清晰的區(qū)域，圖7示明抑制劑量在5皮摩爾 和200皮摩爾之間時在凝膠上的顯色。結(jié)果表明抑制劑的信號是劑量依 賴性的，這意味著可以用這種檢測方法篩選化合物以發(fā)現(xiàn)新的EF-3抑 制劑。實(shí)施例2示范了 CF-HTS在存在細(xì)胞器和其他粗制生物混合物或 抽提物的復(fù)雜體系中的應(yīng)用.實(shí)施例3:蛋白-蛋白相互作用抑制劑的gELISA間接顏色檢測如上文所討論，ELISA經(jīng)常用于檢測對配基-受體相互作用的抑制， 其中受體是固定在微量滴定孔上的。用于ELISA中的"配基-受體對" 可包括從蛋白或其它大分子到小分子的任何結(jié)合分子對。這些檢測是復(fù) 雜的，多步驟的檢測，需要固定受體，將受體與配基溫育，洗滌以除去 可能造成高背景信號的非特異性保留的多余配基，使結(jié)合顯示試劑(例 如，與報告酶標(biāo)記的對配基特異的抗體)和受體結(jié)合的配基結(jié)合并通過 提供報告酶的底物產(chǎn)生可見信號。顯然，ELISA的復(fù)雜性使得HTS工業(yè) 得出結(jié)論，認(rèn)為ELISA不能被改造成自由方式的檢測實(shí)驗(yàn)。盡管如此，本 發(fā)明的發(fā)明者仍能將這種復(fù)雜的多步驟檢測實(shí)驗(yàn)改造成了 CF-HTS方 式以檢測許多蛋白-蛋白、蛋白-配基以及其它配基結(jié)合相互作用。尿激酶型血漿纖溶酶激活劑(uPA)與其相應(yīng)受體的結(jié)合(uPAR) 。uPA/ uPAR相互作用已被用于檢測各種類型的癌癥轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的發(fā) 明者已將傳統(tǒng)的uPA/ uPAR ELISA改造成了利用純化受體和配基的CF -HTS。uPAR基質(zhì)用15毫升溶于磷酸鹽緩沖液(PBS ) ( Life Technologies, Grand Island: NY)的U8nM uPAR，在pH7.4和4°C的條件下包被塑料板(7.5 cm x 11.5 cm;購自Nunc. Naperville, EL)過夜。在塑料板包被過夜后，倒去uPAR 溶液，加入15ml含1 % (w/v)酪蛋白的PBS (Life Technologies, Grand Island, NY)，室溫(RT)溫育2小時以封閉塑料板上剩下的結(jié)合位點(diǎn)。 封閉后倒空封閉液，并用20ml由溶于PBS的0.05% Tween-20(聚氧化乙烯 山梨聚糖單月桂酸)組成的洗滌液洗滌5次。洗滌后塑料板在RT干燥10分鐘。這一步需要控制好時間，使得塑料板隨后能立刻用于下述的實(shí)驗(yàn) 并避免基質(zhì)的過分干燥而導(dǎo)致失活。B- uPA基質(zhì)為了檢測的目的，使用的uPA用生物素進(jìn)行標(biāo)記(uPA )。含有p- uPA 的凝膠是通過將P- uPA浸泡入瓊脂以避免高溫(與實(shí)施例l和2中將其 倒入熔化的瓊脂的方法相反)。制備瓊脂時首先將O.lg的瓊脂(Sigma， St. Louis, MO)與10ml PBS混合，加熱至熔化，然后倒入到8x7x0.075cm3 的灌膠裝置中(Bio-Rad， Hercules, CA )。固化后(在室溫或在4。C )，將 凝膠在溶于檢測緩沖液的15ml p- uPA中4°C浸泡過夜；上述檢測緩沖液 由PBS、 0.05% Tween-20和0.1%的酪蛋白(兩者都購自Sigma, St. Louis, MO )組成。在使用前將凝膠RT干燥20分鐘。樣品基質(zhì)在針對uPA/ uPAR結(jié)合的已知小分子抑制劑不存在的條件下，將未 用生物素標(biāo)記的uPA (Pro- uPA)用作抑制uPA/ uPAR結(jié)合的對照樣品。 將溶于檢測緩沖液的O、 0.03、 0.1、 0.3、和3jxMpro-uPA的5微升小樣 分加到PVDC膜(Dowbrands L. P. Indianapolis, IN)上并在RT干燥2 小時。將uPAR與Pro-uPA和B — uPA溫育將樣品基質(zhì)置于P - uPA凝膠的 一側(cè)，使干燥的pro-uPA點(diǎn)與p - uPA 凝膠表面接觸。RT溫育10分鐘，使得pro-uPA擴(kuò)散到凝膠中。然后將P - uPA凝膠的另 一側(cè)放在塑料板上使得P-uPA(作為配基)和pro-uPA(作 為竟?fàn)幰种苿?與塑料板表面上的uPAR相互作用。在RT溫育20分鐘 進(jìn)行結(jié)合/竟?fàn)幏磻?yīng)。溫育后，將塑料板從凝膠分離開，迅速用20ml洗滌 緩沖液洗4次。將親和素-辣根過氧化物酶(Sigma, St. Louis， MO)用 檢測緩沖液1比25,000稀釋以制備親和素-HRP標(biāo)記物溶液，并將15ml 加入到塑料板上。反應(yīng)在RT溫育10分鐘進(jìn)行，然后倒空親和素-HRP 溶液并如上文所述洗滌塑料板。塑料板干燥20分鐘。親和素-HRP中的親和素特異性地與生物素結(jié)合，使得只有發(fā)生"配 基/受體"結(jié)合的基質(zhì)區(qū)域最終才會顯色。"配基/受體"結(jié)合被pro-uPA 竟?fàn)幮砸种频牡幕|(zhì)區(qū)域?qū)⒉粫@色。顯色含有比色測定HRP底物的顯色凝膠(OPD凝膠)是通過將鹽酸2-鄰苯二腐OPD )藥片溶于7ml稀釋'液(兩者都來自Abbott kit no. 6172-30， Aboot Labs， Abbott Park EL)并將此溶液與瓊脂糖溶液混合而制備，瓊 脂糖溶液是通過用3ml水熔化O.lg瓊脂糖而制備的。將最終的10ml混合 物倒入8x7x0.075cm的mini-proteinll凝膠裝置中并在4°C凝固15分鐘 。將凝膠從灌膠架的玻璃板上轉(zhuǎn)移到PVDC膜或柔軟的塑料片上，并在 空氣中室溫干燥10分鐘。然后將凝膠轉(zhuǎn)到另 一張PVDC膜或塑料片上使 凝膠的另一側(cè)干燥10分鐘。然后將OPD凝膠放到塑料板上開始顯色。 在OPD溫育的不同時間將塑料板放在440nm濾色鏡上(Omega Optical, Inc., Brattleboro， VT )，而上述濾色鏡放在纖維光學(xué)散射板上，散射板放 在Fiber-Lite光源上(兩者都來自Dolan-Jenner Industries" Lawrence, MA )。得到的圖象用CCD相機(jī)獲取(Eagle Eye system, Statagene, La Jolla: CA)。對照實(shí)驗(yàn)圖8示明實(shí)施例3的對照實(shí)驗(yàn).在圖8A中，瓊脂方塊(lcm"浸泡 在如方塊下方所表示的各種濃度的P - uPA中(除了 50nM的溶液是在瓊 脂方塊的左邊標(biāo)明)。在瓊脂方塊與塑料板上固定的uPA溫育后，這些方 塊被移開。然后洗滌塑料板，按照上文所述觀察基質(zhì)上發(fā)生P - uPA/uPAR 結(jié)合的區(qū)域。圖8B示明OPD顯色的不同時間中每個方塊的平均象素值 (減去背景)(利用NIH圖象檢測軟件檢測CCD相機(jī)數(shù)字圖象而確定) 對每個方塊中P-uPA的濃度作圖從瓊脂方塊中釋放的P-uPA表現(xiàn)出典型 的受體-配基結(jié)合曲線，半-最大結(jié)合(Kd)為2-5nM，這與常規(guī)ELISA 和其它測量此參數(shù)的檢測實(shí)驗(yàn)中此反應(yīng)的報道值相一致.圖8表明由 gELISA產(chǎn)生的間接比色信號定量地依賴于配基-受體相互作用程度。 Pro-upA/B-uPA竟?fàn)帉?shí)驗(yàn)結(jié)果圖9示明Pro-upA對P-uPA /叩A(chǔ)R結(jié)合的抑制，圖9A中的點(diǎn)顯示 P-uPA/upAR結(jié)合受抑制的區(qū)域。相應(yīng)地，親和素-HRP在這些區(qū)域不 結(jié)合。因此，HRP不與底物膠中的OPD反應(yīng)產(chǎn)生顏色。圖9B是顯示同 樣的CCD圖象數(shù)據(jù)的替代方法，這樣增強(qiáng)了人眼觀察定量滴定的能力。 實(shí)施例4:蛋白-蛋白相互作用抑制劑的直接放射性探測方法 T細(xì)胞激活是身體免疫應(yīng)答的一個組成部分。在T細(xì)胞激活中為了 發(fā)生下游事件，p561ck (LCK， 一種蛋白)必需與T細(xì)胞抗原受體的胞 漿內(nèi)結(jié)構(gòu)域中的ITAM區(qū)(基于酪氨酸的免疫球蛋白相關(guān)激活片段，immunoglobulin related tyrosine based activation motif)反應(yīng)。抑制這種 蛋白-蛋白相互作用的化合物是潛在的免疫抑制劑。本發(fā)明的發(fā)明者應(yīng) 用CF-HTS來檢測這種蛋白-蛋白相互作用，其中LCK被固定到膜上LCK基質(zhì)將11c邁x2cm的條帶用5ml溶于含5mM DTT (二硫蘇糖醇)的PBS 的3jiM LCK淹沒，室溫放置10分鐘，將緩沖液除去，從而將生物素標(biāo) 記的LCK固定到生物素捕獲膜上(SAM膜)(Promega Corp., WI )。這 一步驟要控制好時間，以便SAM膜能隨后立刻(幾分鐘以內(nèi))用于下述 的檢測實(shí)驗(yàn)中。ITAM頭基質(zhì)含放射性標(biāo)記的ITAM (ITAM* )瓊脂凝膠是通過混合O.lg瓊脂糖 和10ml水，加熱至熔化，然后倒入8x7xO.l灌膠裝置中而制備的。在 灌膠之前加入或在凝固后滲透加入ITAM、使其終濃度為10nM。樣品基質(zhì)待篩選的測試樣品分加到塑料表面上或PVDC膜上并干燥以形成樣品基質(zhì)o溫育ITAM、 LCK和待測樣品并顯現(xiàn)結(jié)果樣品基質(zhì)與ITAM矢凝膠的一側(cè)接觸，使得測試樣品擴(kuò)散到ITAM頭凝 膠中。然后將ITAMA凝膠的另一側(cè)與固定LCK的SAM膜接觸。溫育 15-45分鐘后，移開SAM膜，洗滌，并用磷成像儀或膠片成像。圖象 上較低的信號強(qiáng)度對應(yīng)較低的放射性，這意味著存在ITAM - LCK相互 作用的抑制劑。ITAM*/LCK結(jié)合的對照實(shí)驗(yàn)瓊脂凝膠是通過混合O.lg瓊脂糖和10ml水，加熱至熔化，然后倒入 8 x 7 x 0.1灌膠裝置中而制備的。凝固后從凝膠中打孔取出直徑lcm的凝 膠并用400nl(U、 0.3、 1、 3、 10和20111111251標(biāo)記的ITAM (Amersham， Arlington heights, IL) 4°C浸泡過夜。從溶液中取出凝膠塊并在RT干燥 20分鐘。然后放在固定LCK的膜上并在RT溫育45分鐘。除去凝膠并 用緩沖液洗滌4次。SAM膜干燥后用磷成像儀成像.圖IO表明125I-ITAM和固定在SAM膜上的LCK之間的結(jié)合是劑 量依賴性的。圖11示明每塊125I-ITAM的凝膠平均象素值(減去背景)(利用 Molecular Dynamics的ImageQuant軟件檢測磷成像儀的數(shù)字化圖象而得 到)對每塊凝膠中125I - ITAM的濃度作圖。從凝膠中釋放到固定的LCK 上的125I - ITAM表現(xiàn)出典型的受體-配基結(jié)合曲線。實(shí)施例5:用凝J3^/濾器聯(lián)合方式檢測全細(xì)胞報告基因用含有融合到熒光酶基因(熒光酶報告基因來自Promega)上的環(huán) 腺苷酸應(yīng)答元件(CREB)啟動子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腎細(xì)胞，如HEK細(xì)胞。當(dāng) 用毛喉素處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞時，熒光酶^^艮告基因誘導(dǎo)表達(dá)。然后往HEK細(xì)胞 中加入含有熒光酶底物(甲蟲熒光素，Promega)和適當(dāng)輔助因子(20mM 苜蓿素(Tricine) pH 7.8， O.lmM EDTA， 33mM輔酶A， 0.5mM ATP， lmMMgCI2)的生物緩沖液，可利用常規(guī)的儀器檢測產(chǎn)生的光子發(fā)射。 發(fā)明者將這種檢測實(shí)驗(yàn)改造成了 CF-HTS。細(xì)胞基質(zhì)用胰蛋白酶處理培養(yǎng)基中的細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到Corning/Costar TRANSWEL1/m膜上(帶有塑料支持圈的3微米聚碳酸酯濾膜)上，并 在含5。/。C02組織培養(yǎng)基中37。C溫育過夜。然后從膜上除去培養(yǎng)基，并 將細(xì)胞結(jié)合的濾膜在空氣中干燥15分鐘，隨后立刻用于以下的步驟中。誘導(dǎo)劑基質(zhì)將12pl 10mM毛喉素(Sigma，儲存于乙醇中)儲存液加入到6ml1 % 低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中制備含有熒光酶表達(dá)誘導(dǎo)劑的凝膠。該凝膠在室溫 凝固，毛喉素的終濃度為20pM.樣品基質(zhì)將可能阻止毛喉素誘導(dǎo)的樣品高密度地分加到PVDC膜上的離散位置。反應(yīng)物的溫育和抑制的檢測將PVDC膜的抑制劑側(cè)與誘導(dǎo)劑凝膠溫育。然后，將舍有毛喉素誘 導(dǎo)劑的凝膠放置在上文制備的細(xì)胞基質(zhì)的非細(xì)胞側(cè)。在37°C, 5% C02 的條件下溫育20分鐘。然后除去毛喉素凝膠，在37。C， 5%002的條件 下再溫育4小時使熒光酶構(gòu)建體最大量地表達(dá)。為了探測焚光酶酶學(xué)活 性(或?qū)ζ涿笇W(xué)活性的抑制)，將細(xì)胞基質(zhì)濾膜從其塑料支持環(huán)上移開并 放置在有蓋培養(yǎng)皿中。有蓋培養(yǎng)亞中倒?jié)M溶于生物緩沖液的熒光酶底物 (甲蟲熒光素，Promega)和恰當(dāng)?shù)妮o助因子以產(chǎn)生光信號。因?yàn)樾盘柺俏挥诒磉_(dá)熒光酶的固定細(xì)胞內(nèi)的，初始誘導(dǎo)步驟的抑制劑將產(chǎn)生低光 子發(fā)射區(qū)域。實(shí)施例6:凝JK7濾器CF - HTS直接檢測配基-細(xì)胞相互作用的抑制劑細(xì)胞表面上的配基/受體結(jié)合啟動細(xì)胞中的信號通路，最終導(dǎo)致功能 性應(yīng)答(例如，細(xì)胞增殖或分泌生物活性物質(zhì))。為了調(diào)節(jié)疾病狀態(tài)細(xì)胞 的生物應(yīng)答，經(jīng)常需要抑制配基和細(xì)胞表面的結(jié)合。評測配基/細(xì)胞受體 結(jié)合抑制劑的 一種常規(guī)方法為評測抑制劑降低放射性標(biāo)記的天然配基和 細(xì)胞結(jié)合的能力。這需要將細(xì)胞和放射性配基和抑制劑溫育，然后通過 洗滌除去未結(jié)合的和非特異性結(jié)合的放射性配基，然后測量結(jié)合的放射 性。白介素-8 (IL-8)是一種趨化性的趨化因子，通過和多種細(xì)胞的 受體結(jié)合而參與炎癥反應(yīng)。本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)展了 一種CF - HTS配基-受體細(xì)胞檢測法來評測這種相互作用的抑制劑。細(xì)胞基質(zhì)表達(dá)IL - 8a受體的HEK細(xì)胞(ATCC， Bethesda， MD )鋪在75mm 直徑的transwell膜濾器上(Corning Costar Corp， Cambridge, MA )，密 度為大約2千萬個細(xì)胞每板。在含有10mM H印es (Sigma, St Louis, MO)， pH7.2的緩沖液(RPMI， Life Technologies, Grand Island, NY) 37。C過夜 使細(xì)胞結(jié)合到濾器上。細(xì)胞和濾器結(jié)合后除去培養(yǎng)基，用新鮮的緩沖液 洗滌細(xì)胞除去任何未結(jié)合的細(xì)胞。將濾器倒置，使細(xì)胞側(cè)向下并以一定 的角度放置，使得培養(yǎng)基流干，然后干燥20分鐘。這一步驟要控制好時 間，使得細(xì)胞基質(zhì)能馬上用于下述的步驟中。配基基質(zhì)配基基質(zhì)的制備是通過將125I標(biāo)記的IL-8 (Amersham， Inc., Arlington heights, IL)浸泡到瓊脂糖凝膠中，瓊脂凝膠是通過混合O.lg 瓊脂糖和10ml水，加熱至熔化，然后倒入8x7x0.075灌膠裝置中而制 備的。凝膠在室溫浸泡過夜并在旋轉(zhuǎn)平臺(New Brunswick Scientific Co, Inc，Edison，NJ)上緩慢地混合。浸泡后，在使用前將凝膠RT干燥20min ,這一步要計劃好時間，以便凝膠可馬上被用于以下的檢測中。樣品基質(zhì)在沒有結(jié)合IL-8/細(xì)胞受體的已知抑制劑的情況下，未放射性標(biāo)記的IL-8 (Genzyme.， Cambridge, MA)被用作對照樣品抑制劑，以觀察對125I -IL - 8和HEK細(xì)胞結(jié)合的抑制作用。在塑料片如PVDC上分加1微 升濃度為0， 0,03， O，l， 0，3 1, 3， 10，和100nM的IL>8并在室溫下真空干燥1小時。、、曰玄 /皿g將樣品基質(zhì)放在配基基質(zhì)的一側(cè)，使得干燥的IL-8點(diǎn)和凝膠表面 接觸。翻轉(zhuǎn)凝膠使得另一側(cè)室溫干燥10分鐘并使"抑制劑"擴(kuò)散到凝膠 里。隨后將凝膠放在細(xì)胞基質(zhì)無細(xì)胞的一側(cè)。然后在室溫溫育45分鐘進(jìn) 行結(jié)合反應(yīng)。此后將凝膠移開，將膜無細(xì)胞的一側(cè)用緩沖液洗滌4次。 在膜完全干燥后將其從塑料支持環(huán)上取下。然后用X-光膠片或磷成像 儀(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)成像。圖12示明從瓊脂擴(kuò)散到細(xì)胞基質(zhì)的12SI -IL-8和表達(dá)IL - 8a受體 的HEK細(xì)胞結(jié)合的劑量反應(yīng)。將幾個1平方厘米的瓊脂方塊浸泡在圖中 所示的各種濃度的125I - IL - 8中。隨后浸泡了配基的方塊如上文描述那 樣與細(xì)胞基質(zhì)接觸。溫育后，從細(xì)胞基質(zhì)上移走方塊，將膜的無細(xì)胞側(cè) 用緩沖液洗滌。用磷成像儀定位結(jié)合^I-IL-8的細(xì)胞，結(jié)果表明在這 種以凝膠為基礎(chǔ)的細(xì)胞檢測中直接讀出的放射性值定量地依賴于受體配 基結(jié)合的程度。圖12還表明結(jié)合區(qū)域在形狀上是清楚的，確證了信號的 側(cè)向擴(kuò)散在#測實(shí)驗(yàn)中不是問題。圖13示明竟?fàn)幰种茖?shí)驗(yàn)的結(jié)果。對125I - IL - 8和HEK細(xì)胞結(jié)合的 抑制表現(xiàn)為較亮的點(diǎn)。顯然，未標(biāo)記EL-8的抑制也是可量化的劑量依 賴性的。這些數(shù)據(jù)表明以此例中未標(biāo)記DL-8為例子的抑制劑能穿過細(xì) 胞基質(zhì)降低125I -IL-8和細(xì)胞之間的結(jié)合。實(shí)施例7:基于濾器的無凝膠功能性細(xì)胞檢測實(shí)驗(yàn)細(xì)胞功能的改變通常是通過觀察化合物或樣品對構(gòu)建于細(xì)胞中的報 告系統(tǒng)的影響而測量的。具體實(shí)例包括觀察對細(xì)胞內(nèi)熒光蛋白如綠色熒 光蛋白(GFP)、細(xì)胞外蛋白如受體或粘附分子、或特定酶如熒光酶、氯 霉素?；D(zhuǎn)移酶或P-半乳糖苷酶(Promega)合成的影響，首先將待測樣 品與細(xì)胞溫育。然后在適當(dāng)?shù)臅r間內(nèi)(可以是幾分鐘、幾小時或幾天) 使細(xì)胞表達(dá)報告蛋白。然后用直接方法(例如GFP)或間接方法(例如 膜結(jié)合蛋白的ELISA技術(shù))檢測報告蛋白的水平，進(jìn)而，在酶的情況下， 可破碎細(xì)胞提取報告蛋白并檢測酶活性。其它功能性細(xì)胞檢測測量受體受刺謝物的行為或位置的變化。一種測量化合物對細(xì)胞間粘附分子1 (ICAM-1)的影響的ELISA 檢測可如下被改造成CF - HTS方式。將表達(dá)ICAM - 1的內(nèi)皮細(xì)胞鋪在 聚碳酸酯趨化膜(Neuro Probe)上，密度為每 mm 5，000個細(xì)胞。細(xì)胞 在培養(yǎng)基中溫育過夜.將培養(yǎng)基除去并使膜在室溫部分干燥10分鐘。用 于測試對ICAM-1的誘導(dǎo)的樣品或化合物被加到塑料片上干燥并使之 與潮濕膜的無細(xì)胞側(cè)接觸，化合物和細(xì)胞在潮濕的小室里37。C反應(yīng)1小 時，隨后細(xì)胞用培養(yǎng)基淹沒并在37°C溫育5小時。在足夠細(xì)胞合成誘導(dǎo)蛋白的一段時間之后，將培養(yǎng)基從膜上除去并 在含抗ICAM - 1抗體的緩沖液中溫育細(xì)胞(Genzyme， R&D系統(tǒng))，抗 體用異硫氰酸熒光素或生物素標(biāo)記或不用之標(biāo)記。室溫溫育30分鐘后， 除去緩沖液并洗滌細(xì)胞數(shù)次以除去未結(jié)合的抗ICAM - 1抗體。在FITC 標(biāo)記抗體的情況下，用CCD相機(jī)(Stratagene， Imaging Research )在485nm 激發(fā)520nm發(fā)射下對膜成像。由于FITC -抗ICAM - 1 -抗體的結(jié)合， 刺激ICAM- 1表達(dá)的化合物將導(dǎo)致熒光增強(qiáng)的區(qū)域。在生物素標(biāo)記抗體 的情況下細(xì)胞在含親和素-HRP的緩沖液中室溫溫育10分鐘。除去緩沖 液并洗去未結(jié)合的親和素-HRP。然后將膜浸泡在含沉降性HRP底物， 如四氯二M聯(lián)苯胺的緩沖液中，并觀察誘導(dǎo)表達(dá)ICAM 一 1的潛在細(xì)胞 區(qū)域的顯色。在未標(biāo)記的抗ICAM - 1抗體的情況下，用標(biāo)記的抗抗ICAM -1抗體的二抗與細(xì)胞反應(yīng)，然后用標(biāo)記物的適當(dāng)?shù)孜镲@現(xiàn)信號。用CCD 相機(jī)捕獲圖象。所有的這些變例(FITC、親和素-HRP、和抗抗ICAM - 1抗體)都是應(yīng)達(dá)到相同定性結(jié)果-即信號增強(qiáng)或減弱的區(qū)域能與影響 ICAM - 1表達(dá)的樣品相聯(lián)系-的不同報告標(biāo)記。值得注意的是此例中連續(xù)式基質(zhì)是膜或塑料片。凝膠對于CF-HTS 并不是必需的。實(shí)施例8: CF - HTS檢測離散樣品對神經(jīng)氨酸苷酶的抑制樣品基質(zhì)利用CF-HTS測試了 528種離散的、結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物的文庫。 用Packard Multiprobe MP204-DT將化合物從小瓶中稀釋到96孔板并將 化合物稀釋和轉(zhuǎn)移到塑料片上。最初將小瓶中溶于DMSO的40mM化合 物用DMSO在96孔板上稀釋到4mM。將兩份ljil樣品轉(zhuǎn)移到8cmx8cm的塑料片上，樣品間的間隙平均為5mm(BioRadcat#165-2956)，每塊塑 料片總共192個樣品，因此，每個lpl的點(diǎn)大約含有200pmol來自上述文 庫的一種特定樣品。稀釋一系列2，3-脫氫-2脫氧-N -乙耽基神經(jīng)氨酸 (DANA ), —種已知的神經(jīng)氨酸苦酶抑制劑(Boehringer Maimheim#528544 )，手工分加到每塊塑料片上與化合物相鄰的位置，作 為對照。在真空爐中干燥塑料片，4吏得每種化合物在其自身的位置上被 干燥到塑料表面上。 酶基質(zhì)檢測在40X:下前將25 %甘油、磷酸鹽緩沖液中的流感病毒神經(jīng)氨酸 苷酶按1500倍稀釋到液態(tài)的瓊脂凝膠中，該凝膠中含有1%瓊脂糖、 50mM檸檬酸鈉，pH6,0， 10mM氯化鈉。灌制8cmx8cmx0.075mm的酶 凝膠并將溫度降低到4tM吏之凝固。底物凝膠將DMSO中濃度為3mM的流感病毒神經(jīng)氨酸苷酶合成底物，2， - 4 -甲基^散形基(4methylumbelifeyl) - ct-D-N-乙酰神經(jīng)氨酸(Sigma cat#M-8639)，用液化瓊脂糖凝膠稀釋到30pM并以和上文描述的酶凝膠 類似的方式灌制。溫育和檢測酶基質(zhì)放在樣品基質(zhì)上所感興趣的化合物被干燥的一側(cè)。然后將底 物基質(zhì)迭放在酶基質(zhì)上。將這些基質(zhì)RT溫育30分鐘。在這段時間內(nèi)淬 滅熒光底物和酶在兩塊膠之間擴(kuò)散到一起，然后底物被酶水解，使得熒光 強(qiáng)度增加，監(jiān)測在340nm激發(fā)和450nm發(fā)射進(jìn)行。能抑制酶活性的化合 物使熒光的增加程度減小。凝膠在大多數(shù)部位熒光都增加，但酶抑制劑 從塑料片擴(kuò)散到凝膠的部位熒光較弱、較暗。通過適當(dāng)?shù)臑V光鏡控制發(fā) 射和激發(fā)波長，這樣容易用CCD相機(jī)監(jiān)測.表現(xiàn)出抑制性區(qū)域的化合物 的成分可通過確定該區(qū)域在抑制劑基質(zhì)上對應(yīng)的位置而確定。通過比較 DANA對照和已知量的各種測試抑制劑的熒光強(qiáng)度可定量地估計每種成 分的IC50.所有的538種化合物都進(jìn)行了雙份測試。所用的酶凝膠總體積為 33ml，或每次測試用31.25^1。進(jìn)而，所有的化合物都同時測試，與傳統(tǒng) 的96孔檢測方法相比檢測條件是恒定的。進(jìn)而，如圖14所示，該檢測 靈敏得足以探測含量少到100pM的抑制劑。每種活性化合物的ICso估計值和用96孔方法觀察到的同一測試化合物的相同，但96孔方法費(fèi)用更 昂貴，每次測試需要20(Hil。參見定量凝膠檢測結(jié)果表，這個實(shí)施例表明 測試高密度排列的化合物減少了費(fèi)用和時間。例如，僅僅將間距有5mm 減小到2.5mm就能使得每單位體積的測試樣品數(shù)量提高4倍.在本實(shí)驗(yàn) 中這將使得每種化合物的體積減小到10nl。但是試劑是以批量的形式操 作的，不需要小型化篩選中常用的小體積液體操作裝置。定量凝脫檢測結(jié)果樣品#凝膠實(shí)驗(yàn)得到的近似 最大Ki (pM)從96孔實(shí)驗(yàn)估計的 IC50 ( pM)34100>1003580>10036804237100>10038100>10039100>10040403241100>10042405043100>10044>200>10045100>10046100>10047107.548100>10049100>10050100>100用總體積17毫升的酶凝膠通過CF - HTS檢測了 10, 080種離散化 合物(每次檢測小于2pl)，以此為例說明這種小型化的優(yōu)點(diǎn)。用Packard Multipette分加30^1體積的每種樣品，樣品之間的間隔為lmm。分加的化合物溶于DMSO中，濃度為5mM,使得大約150pmol的每種樣品被 分加到塑料表面上。再一次用DANA作為對照。除了象通常那樣在化合 物排列的外邊進(jìn)行對照滴定外還在排列之中包括了對照滴定，作為盲試 (blind test);在盲試中對照樣品以和10， 080種未知樣品一樣的方式加 到塑料表面上。如上文所述，塑料片干燥后用于神經(jīng)氨酸苷酶檢測。利 用這種方法，在不到1個小時內(nèi)同時篩選了所有的10，080種化合物。除 了在將初始的化合物分加到塑料片上時，本實(shí)驗(yàn)再不需要微量流控和/或 小體積操作。本實(shí)驗(yàn)中極其高的密度并未干擾對抑制劑的探測。進(jìn)而， 高密度并未使活性化合物的鑒定復(fù)雜化，甚至在熒光化合物(在凝膠上 為亮點(diǎn)，很容易觀察到)與活性化合物緊鄰時也是如此。參見圖15。
權(quán)利要求
1.一種檢測測試樣品的生物學(xué)或生物化學(xué)活性的方法，該方法包括，a)將多種測試樣品引入到多孔檢測基質(zhì)之中或之上，檢測基質(zhì)任選地含有一種或多種檢測組分，b)使用至少一種基質(zhì)將一種或多種檢測組分引入到檢測中，其中所述基質(zhì)可以是也可以不是多孔檢測基質(zhì)，c)進(jìn)行以下另加步驟，i)洗滌檢測中用的任一基質(zhì)以除去多余的測試樣品、檢測組分或兩者；或者ii)使檢測中使用的任一基質(zhì)和批量溶液或其本身為液體另加試劑接觸。
2. 權(quán)利要求1中的方法，其中測試樣品是分加到含有配基的多孔檢測 基質(zhì)上的，另一種檢測基質(zhì)含有固定的受體，并且另一種另加的試劑為 顯現(xiàn)溶液(visualizing solution )。
3. 權(quán)利要求1中的方法，其中另加的試劑可以在一種細(xì)胞檢測中探測 報告基因的表達(dá)。
4. 權(quán)利要求1中的方法，其中一種多孔檢測基質(zhì)是在一面帶有全細(xì)胞 的膜，并且另加的步驟包括加入含有能與報告蛋白交聯(lián)的化合物的批量 溶液；報告蛋白是由于測試樣品和細(xì)胞之間的陽性反應(yīng)而產(chǎn)生的。
5. 權(quán)利要求1中的方法，其中另加的試劑是顯現(xiàn)試劑。
6. 權(quán)利要求1中的方法，其中的洗滌步驟除去多余的用于顯現(xiàn)檢測結(jié) 果的檢測組分'
7. —種檢測測試樣品生物學(xué)或生物化學(xué)活性的方法，該方法包括，a) 將多種測試樣品引入到多孔檢測基質(zhì)之中或之上，檢測基質(zhì)任選地 含有一種或多種檢測組分，b) 使用至少兩種另加的基質(zhì)進(jìn)4亍檢測。
8. —種檢測離散測試樣品生物學(xué)或生物化學(xué)活性的方法，該方法包括，a) 將96種以上測試樣品引入到多孔檢測基質(zhì)之中或之上，檢測基質(zhì) 任選地含有 一種或多種檢測組分，b) 進(jìn)行檢測。
9. 權(quán)利要求1、 7或8中的方法， 質(zhì)的步驟。
10. 權(quán)利要求1、 7或8中的方法，
11. 權(quán)利要求l、 7或8中的方法，
12. 權(quán)利要求1、 7或8中的方法， 混合物或抽提物。
13. 權(quán)利要求1、 7或8中的方法，胞。
14. 權(quán)利要求1、 7或8中的方法，
15. 權(quán)利要求1、 7或8中的方法， 定了的檢測組分上的液體薄膜。
16. 權(quán)利要求1、 7或8中的方法，權(quán)利要求書第2/4頁 還包括分加測試樣品到測試樣品基其中多孔檢測基質(zhì)含有靶大分子。 其中多孔檢測基質(zhì)含有酶。 其中多孔檢測基質(zhì)含有粗制的生物其中多孔檢測基質(zhì)含有細(xì)胞器或細(xì)其中多孔檢測基質(zhì)是濾器或膜。 其中多孔檢測基質(zhì)是一層覆蓋在固其中另加基質(zhì)含有固定的大分子靶
17. 權(quán)利要求1、 7或8中的方法，其中另加檢測基質(zhì)含有顯現(xiàn)試劑。
18. 同時檢測多種不同物質(zhì)樣品增強(qiáng)或抑制生物學(xué)過程能力的方法， 該方法包括，a) 96種以上獨(dú)特樣品，每種以一小份體積加到含有或帶有均一分布 的試劑的平面多孔基質(zhì)上形成排列，使得每種獨(dú)特物質(zhì)以其自身的獨(dú)特 位點(diǎn)為中心，并且能根據(jù)加樣位點(diǎn)確定每種物質(zhì)的身份，b) 觀察每種物質(zhì)和所述的檢測試劑的相互作用，并且將這種相互作用 與該物質(zhì)增強(qiáng)或抑制生物學(xué)過程的能力相聯(lián)系。
19. 同時檢測多種不同物質(zhì)樣品增強(qiáng)或抑制生物學(xué)過程能力的方法， 該方法包括，a) 96種以上獨(dú)特樣品，每種以 一小份體積加到平面基質(zhì)上形成排列， 使得每種獨(dú)特物質(zhì)以其自身的獨(dú)特位點(diǎn)為中心，并且能根據(jù)加樣位點(diǎn)確 定每種物質(zhì)的身份，b) 使上述基質(zhì)和含有或帶有均一分布的檢測試劑的多孔基質(zhì)接觸，并 使每種物質(zhì)各有一部分?jǐn)U散到上述多孔基質(zhì)，其擴(kuò)散的方式可以保證每 種擴(kuò)散物質(zhì)的位置能與上述平面基質(zhì)上上述物質(zhì)最初加樣的位置相關(guān) 聯(lián)，c) 進(jìn)行接觸以測定每種擴(kuò)散物質(zhì)增強(qiáng)或減弱上述生物學(xué)過程的能力。
20. 同時檢測多種不同物質(zhì)樣品增強(qiáng)或抑制生物學(xué)過程能力的方法，該方法包括，a) 96種以上獨(dú)特樣品，每種以一份小體積加到平面基質(zhì)上形成排列， 使得每種獨(dú)特物質(zhì)以其自身的獨(dú)特位點(diǎn)為中心，并且能根據(jù)加樣位點(diǎn)確 定每種物質(zhì)的身份，b) 使上述基質(zhì)和含有或帶有均一分布的檢測試劑的第一多孔基質(zhì)接 觸，并使每種物質(zhì)各有一部分?jǐn)U散到上述多孔基質(zhì)，其擴(kuò)散的方式可以 保證每種擴(kuò)散物質(zhì)的位置能與上述平面基質(zhì)上上述物質(zhì)最初加樣的位置 相關(guān)聯(lián)，c) 使上述第一多孔基質(zhì)和含有或帶有第二種均一分布的檢測試劑的 第二多孔基質(zhì)接觸，并使第二種檢測試劑擴(kuò)散到第一多孔基質(zhì)，或使每 種物質(zhì)和第一種試劑擴(kuò)散到笫二多孔基質(zhì)，在后一種情況下確保擴(kuò)散的 方式使得每種擴(kuò)散物質(zhì)在第二基質(zhì)中的位置能與上述物質(zhì)在上述平面基 質(zhì)上的最初加樣位置相關(guān)聯(lián)，以及d) 評測每種物質(zhì)增強(qiáng)或抑制所述生物學(xué)過程的能力。
21. 同時檢測多種不同物質(zhì)樣品增強(qiáng)或抑制生物學(xué)過程能力的方法， 該方法包括，a) 96種以上獨(dú)特樣品，每種以一份小體積加到含有或帶有均一分布 的第 一檢測試劑的第 一平面多孔基質(zhì)上形成排列，使得每種獨(dú)特物質(zhì)以 其自身的獨(dú)特位點(diǎn)為中心，并且能4艮據(jù)加樣位點(diǎn)確定每種物質(zhì)的身份，b) 使上述第一多孔基質(zhì)和含有或帶有第二種均一分布的檢測試劑的 第二平面基質(zhì)接觸，并使第二種檢測試劑擴(kuò)散到第一多孔基質(zhì)，或使每 種物質(zhì)和第一種試劑擴(kuò)散到第二平面基質(zhì)，在后一種情況下確保擴(kuò)散的 方式能使每種擴(kuò)散物質(zhì)在第二基質(zhì)之中或之上的位置可與上述物質(zhì)在上 述第一多孔基質(zhì)上的最初加樣的位置相關(guān)聯(lián)，以及c) 評測每種物質(zhì)增強(qiáng)或抑制生物學(xué)過程的能力。
22. 權(quán)利要求18或19或20或21中的方法，其中均一分布的檢測試 劑是有一種大分子。
23. 權(quán)利要求18或19或20或21中的方法，其中均一分布的檢測試 劑有一種是酶。
24. 權(quán)利要求18或19或20或21中的方法，其中均一分布的檢測試 劑有 一種是粗制的生物抽提物。
25. 權(quán)利要求18或19或20或21中的方法，其中均一分布的檢測試劑有一種是細(xì)胞器。
26. 權(quán)利要求18或19或20或21中的方法，其中均一分布的檢測試 劑有一種是全細(xì)胞。
27. 權(quán)利要求18或19或20或21中的方法，其中均一分布的檢測試 劑是平面多孔基質(zhì)一個表面上攜帶的全細(xì)胞。
28. 權(quán)利要求27中的方法，其中所述的相互作用是通過使上述多孔基 質(zhì)和一種試劑溶液或懸液或含有該試劑的多孔基質(zhì)接觸，上述試劑在隨 便那種情況下都可促進(jìn)一種蛋白的顯現(xiàn)，上述蛋白在上述全細(xì)胞中的表 達(dá)即是被評測的生物學(xué)過程。
29. 權(quán)利要求21中的方法，其中第一檢測試劑是標(biāo)記的配基，而第二 檢測試劑是針對上述配基的固定后的受體。
30. 權(quán)利要求29中的方法，其中笫二平面基質(zhì)被洗滌以除去擴(kuò)散到上 述第二平面基質(zhì)之上或之中但不與上述固定受體結(jié)合的任一標(biāo)記配基。
31. 權(quán)利要求30中的方法，其中所述笫二平面基質(zhì)與一種試劑的溶液 或懸液或含有該試劑的多孔基質(zhì)接觸，上述試劑在隨便那種情況下都促 進(jìn)未在洗滌中被除去的標(biāo)記配基的顯現(xiàn)。
全文摘要
本發(fā)明發(fā)明名稱為連續(xù)式高處理量篩選。本發(fā)明涉及應(yīng)用了至少一種多孔基質(zhì)的連續(xù)式高處理量篩選方法(CF-HTS)，該方法使得制藥工業(yè)能夠同時對大量生物學(xué)或生化活性分布廣泛的化學(xué)實(shí)體進(jìn)行篩選。此外，CF-HTS也可用于進(jìn)行多步驟的檢測實(shí)驗(yàn)。
文檔編號C07B63/00GK101256187SQ20081008176
公開日2008年9月3日 申請日期1998年12月11日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月12日
發(fā)明者B·A·比特爾, D·J·布爾恩斯, M·E·舒達(dá)克, M·J·沃二巴斯, M·K·約瑟夫 申請人:艾博特公司