本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中，GhNAC79及其在調(diào)控植物抗旱性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：棉花是纖維的主要來(lái)源，相對(duì)于水稻和小麥，棉花對(duì)干旱具有較高的抗性。中國(guó)有10％的耕地缺乏水分，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)50％左右。隨著全球氣候變化以及環(huán)境污染，干旱已經(jīng)成為限制棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。因此通過(guò)生物技術(shù)手段，挖掘干旱相關(guān)基因，培育高抗棉花材料對(duì)于棉花育種具有非常重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何提高植物的抗旱性。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種具有抗旱功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，其名稱為GhNAC79，是如下A1)、A2)、A3)、A4)或A5)：A1)氨基酸序列是序列2的蛋白質(zhì)；A2)氨基酸序列是序列2的第143-232位的蛋白質(zhì)；A3)氨基酸序列是序列2的第1-187位的蛋白質(zhì)；A4)將序列表中序列2或序列2的第143-232位或序列2的第1-187位所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質(zhì)；A5)在A1)或A2)或A3)或A4)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)。為了使A1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1、標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述A4)中的GhNAC79，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述A4)中的GhNAC79可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述A4)中的GhNAC79的編碼基因可通過(guò)將序列1的第53-751位、序列1的第479-751位或序列1的第53-613位所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與GhNAC79相關(guān)的生物材料。本發(fā)明所提供的與GhNAC79相關(guān)的生物材料，為下述B1)至B9)中的任一種：B1)編碼GhNAC79的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表達(dá)盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體、或含有B2)所述表達(dá)盒的重組載體；B4)含有B1)所述核酸分子的重組微生物、或含有B2)所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有B3)所述重組載體的重組微生物；B5)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；B6)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織、或含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；B7)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官、或含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物器官；B8)降低GhNAC79表達(dá)的核酸分子；B9)含有B8)所述核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。上述生物材料中，B1)所述核酸分子可為如下b1)-b5)中任一種：b1)其編碼序列是序列表中序列1的第53-751位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；b2)其編碼序列是序列表中序列1的第479-751位或序列1的第479-767位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；b3)其編碼序列是序列表中序列1的第53-613位或序列1的第23-613位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；b4)與b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼GhNAC79的cDNA分子或基因組DNA分子；b5)在嚴(yán)格條件下與b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列雜交，且編碼GhNAC79的cDNA分子或基因組DNA分子；B8)所述核酸分子為序列表中序列1所示的DNA分子中任一片段或其互補(bǔ)片段。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列1的第53-751位核苷酸所示的DNA分子編碼序列2所示的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的編碼GhNAC79的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過(guò)人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的GhNAC79的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼GhNAC79且具有GhNAC79功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列2或序列2的第143-232位或序列2的第1-187位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。上述生物材料中，所述嚴(yán)格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，B2)所述的含有編碼GhNAC79的核酸分子的表達(dá)盒(GhNAC79基因表達(dá)盒)，是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)GhNAC79的DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)GhNAC79基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止GhNAC79基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列。可用于本發(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于：組成型啟動(dòng)子，組織、器官和發(fā)育特異的啟動(dòng)子，和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子35S：來(lái)自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol120：979-992)；來(lái)自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，發(fā)病機(jī)理相關(guān)1(PR1)(由水楊酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯)誘導(dǎo))；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動(dòng)子(PIN2)或LAP啟動(dòng)子(均可用茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo))；熱休克啟動(dòng)子(美國(guó)專利5，187，267)；四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(美國(guó)專利5，057,422)；種子特異性啟動(dòng)子，如谷子種子特異性啟動(dòng)子pF128(CN101063139B(中國(guó)專利200710099169.7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動(dòng)子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的啟動(dòng)子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4：3047-3053))。它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(NOS終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、豌豆rbcSE9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)NucleicAcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.,15:9627)?？捎矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述GhNAC79基因表達(dá)盒的重組載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3′端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂堿合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3′端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptII基因，賦予對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對(duì)氨甲喋呤抗性的dhfr基因，賦予對(duì)草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。所述質(zhì)粒具體可為pBI121或pGBKT7。所述載體具體可為VIGS載體，如pCLCrVA載體或pYL156載體。B3)所述重組載體可含有序列1的第53-751位所示的用于編碼GhNAC79的DNA序列；進(jìn)一步B3)所述重組載體具體可為pBI121-GhNAC79、pGBKT7-ADfra2、pGBKT7-Adfra3或pGBKT7-Adfra4。所述pBI121-GhNAC79為將pBI121載體的XbaI和SacI識(shí)別位點(diǎn)間的DNA序列替換為序列1的第53-751位所示的DNA序列，得到表達(dá)序列2所示的GhNAC79的重組載體。所述pGBKT7-ADfra2為將EcoRI和BamHI識(shí)別位點(diǎn)間的DNA序列替換為序列1的第23-613位所示的DNA序列得到的表達(dá)序列2的第1-187位所示蛋白質(zhì)的重組載體。所述pGBKT7-Adfra3為將EcoRI和BamHI識(shí)別位點(diǎn)間的DNA序列替換為序列1的第479-767位所示的DNA序列得到的表達(dá)序列2的第143-232位所示蛋白質(zhì)的重組載體。所述pGBKT7-Adfra4為將EcoRI和BamHI識(shí)別位點(diǎn)間的DNA序列替換為序列1的第23-767位所示的DNA序列得到的表達(dá)序列2的第所示蛋白質(zhì)的重組載體。B8)所述核酸分子可為序列表中序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA分子。B9)所述重組載體可含有序列表中序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA分子。進(jìn)一步B9)所述重組載體具體可為下述B9a)或B9b)：B9a)將pCLCrVA載體的SpeI和AscI識(shí)別序列間的DNA片段替換為序列表中序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA分子得到的重組載體；B9b)將pYL156載體的EcoRI和BamHI識(shí)別序列間的DNA片段替換為序列表中序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA分子得到的重組載體。上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌。其中，細(xì)菌可來(lái)自埃希氏菌屬(Escherichia),歐文氏菌(Erwinia),根癌農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium),產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes),假單胞菌屬(Pseudomonas),芽胞桿菌屬(Bacillus)等。所述酵母可為酵母菌株Y2H。所述細(xì)菌可為農(nóng)桿菌，如農(nóng)桿菌LBA4404。上述生物材料中，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官均不包括繁殖材料。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了植物抗旱產(chǎn)品。本發(fā)明所提供的植物抗旱產(chǎn)品，含有GhNAC79或所述生物材料。上述植物抗旱產(chǎn)品中，所述植物抗旱產(chǎn)品可以以GhNAC79或所述生物材料作為活性成分，還可以將GhNAC79或所述生物材料與其它抗旱物質(zhì)進(jìn)行組合得到的組合物作為活性成分。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了GhNAC79、或所述生物材料在下述1)-15)中任一種中的應(yīng)用：1)調(diào)控植物抗旱性；2)制備植物抗旱產(chǎn)品；3)培育抗旱植物；4)調(diào)控植物ABA敏感性；5)制備植物ABA敏感產(chǎn)品；6)培育ABA敏感植物；7)調(diào)控植物氣孔開度；8)制備調(diào)控植物氣孔開度產(chǎn)品；9)培育氣孔開度降低植物；10)調(diào)控植物水分散失；11)制備調(diào)控植物水分散失產(chǎn)品；12)培育水分散失降低植物；13)調(diào)控植物開花時(shí)間；14)制備促進(jìn)植物開花產(chǎn)品；15)培育提前開花植物。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述任一方法：X1)一種培育抗旱性轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括：增加目的植物中GhNAC79的活性或增加目的植物中GhNAC79的含量或促進(jìn)GhNAC79的編碼基因的表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物抗旱性高于所述目的植物；X2)培育抗旱性降低的植物的方法，包括：降低目的植物中GhNAC79的活性、降低目的植物中GhNAC79的含量、抑制目的植物中GhNAC79的編碼基因的表達(dá)或敲除目的植物中GhNAC79的編碼基因，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性低于所述目的植物。上述方法中，所述增加目的植物中GhNAC79的含量可通過(guò)向所述目的植物中導(dǎo)入GhNAC79的編碼基因?qū)崿F(xiàn)。所述抑制目的植物中GhNAC79的編碼基因的表達(dá)可通過(guò)病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-inducedgenesilencing,VIGS)來(lái)實(shí)現(xiàn)。所述抑制目的植物中GhNAC79的編碼基因的表達(dá)具體可通過(guò)將序列表中序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA片段導(dǎo)入所述目的植物實(shí)現(xiàn)。上述方法中，所述GhNAC79的編碼基因可為編碼序列是序列表中序列1的第53-751位的DNA分子。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述GhNAC79的編碼基因(即序列1的第53-751位核苷酸所示的DNA分子)通過(guò)含有GhNAC79基因表達(dá)盒的GhNAC79基因重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中。上述方法中，其中所述GhNAC79基因可先進(jìn)行如下修飾，再導(dǎo)入受體種子植物中，以達(dá)到更好的表達(dá)效果：1)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達(dá)；例如，可根據(jù)受體植物所偏愛的密碼子，在保持本發(fā)明所述GhNAC79基因的氨基酸序列的同時(shí)改變其密碼子以符合植物偏愛性；優(yōu)化過(guò)程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實(shí)現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達(dá)，其中GC含量可為35％、多于45％、多于50％或多于約60％；2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進(jìn)行修飾；3)與各種植物表達(dá)的啟動(dòng)子連接，以利于其在植物中的表達(dá)；所述啟動(dòng)子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動(dòng)子；啟動(dòng)子的選擇將隨著表達(dá)時(shí)間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達(dá)啟動(dòng)子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時(shí)期而定；盡管證明了來(lái)源于雙子葉植物的許多啟動(dòng)子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動(dòng)子用于雙子葉植物中的表達(dá)，單子葉植物的啟動(dòng)子用于單子葉植物中的表達(dá)；4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達(dá)效率；例如來(lái)源于CaMV的tml，來(lái)源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進(jìn)行連接；5)引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列(例如來(lái)源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例如來(lái)源于TMV,MCMV和AMV)。所述GhNAC79基因表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。所述培育抗旱性轉(zhuǎn)基因植物的方法還包括從導(dǎo)入序列2所示的GhNAC79的編碼基因的植株中篩選表達(dá)所述編碼基因的植株，得到所述轉(zhuǎn)基因植物。上述方法中，所述將序列表中序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA片段(將該片段命名為片段1)導(dǎo)入所述目的植物可通過(guò)pCLCrVA載體或pYL156載體將所述片段1導(dǎo)入所述目的植物。本發(fā)明中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述GhNAC79基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。本發(fā)明中，所述植物、所述受體植物和所述目的植物均可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為棉花或擬南芥。本發(fā)明中，所述抗旱具體可體現(xiàn)為對(duì)PEG(如PEG6000)或甘露醇模擬的干旱環(huán)境的抗性。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的GhNAC79可以提高植物的抗旱能力，抑制GhNAC79基因的表達(dá)可以降低植物的抗旱能力：1)干旱處理后的導(dǎo)入GhNAC79編碼基因的轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)狀況明顯好于野生型，并且葉片卷曲程度顯著小于野生型；轉(zhuǎn)基因植株的氣孔開度極顯著小于野生型(轉(zhuǎn)基因植株的氣孔開度為0.6690±0.0502，野生型的氣孔開度為0.7360±0.0614)；在甘露醇模擬的干旱環(huán)境中，導(dǎo)入GhNAC79編碼基因的轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于野生型，轉(zhuǎn)基因植株的干濕比顯著小于野生型，GhNAC79及其編碼基因可以降低植物在干旱環(huán)境中的氣孔開度，進(jìn)一步可以減少植株水分的散失，提高抗旱能力；正常生長(zhǎng)狀況下，單位面積內(nèi)轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株的葉片氣孔數(shù)目和氣孔開度沒有明顯差異；干旱處理14天后，轉(zhuǎn)基因植株葉片的氣孔開度顯著小于對(duì)照植株，轉(zhuǎn)基因植株葉片氣孔平均為16個(gè)/64mm2，對(duì)照植株葉片氣孔平均為14個(gè)/64mm2，GhNAC79及其編碼基因可以通過(guò)調(diào)控氣孔開度調(diào)控棉花干旱抗性；2)在pCLCrVA-pCLCrVB體系中，GhNAC79編碼基因在基因沉默植株中的表達(dá)量顯著低于空載體對(duì)照，對(duì)各棉花干旱處理后，待所有植株瀕臨死亡后，再?gòu)?fù)水，結(jié)果表明抑制GhNAC79的表達(dá)使轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)干旱抗性降低，并且復(fù)水后無(wú)法恢復(fù)生長(zhǎng)；在pYL156-pYL192體系中，GhNAC79編碼基因在基因沉默植株中的表達(dá)量顯著低于空載體對(duì)照,對(duì)各植株進(jìn)行干旱處理，基因沉默植株出現(xiàn)顯萎蔫時(shí)，空載體對(duì)照植株的葉片均未出現(xiàn)萎蔫表型，結(jié)果表明抑制GhNAC79編碼基因的表達(dá)，植物幼苗對(duì)干旱的抗性降低，表明GhNAC79及其編碼基因可以正調(diào)控棉花的抗干旱能力。另外，GhNAC79編碼基因的表達(dá)能夠被PEG6000和甘露醇模擬的干旱環(huán)境誘導(dǎo)，而NaCl模擬的高鹽環(huán)境對(duì)GhNAC79編碼基因的表達(dá)無(wú)明顯影響。GhNAC79的轉(zhuǎn)錄活性位于C端，序列1的第479-767位、序列1的第23-613位和序列1的第23-767位編碼的蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)錄激活活性。實(shí)驗(yàn)證明，可利用本發(fā)明的GhNAC79及其編碼基因調(diào)控植物的抗旱性。附圖說(shuō)明圖1為GhNAC79轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)結(jié)果。圖1中a為轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)中，不同基因片段以及陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的生長(zhǎng)情況，a中左圖是無(wú)X-a-Gal底物條件下酵母的生長(zhǎng)情況，a圖右圖是存在X-a-Gal底物情況下酵母的顯色情況；b為對(duì)應(yīng)a圖中，各個(gè)酵母單克隆包含的基因片段，P為陽(yáng)性對(duì)照，N為陰性對(duì)照，1-4分別表示pGBKT7-ADfra1、pGBKT7-ADfra2、pGBKT7-ADfra3和pGBKT7-ADfra4。圖2為GhNAC79編碼基因的組織表達(dá)模式。圖3為GhNAC79編碼基因在干旱和鹽處理下的表達(dá)情況。圖4為GhNAC79編碼基因在干旱和鹽不同處理時(shí)間下的表達(dá)情況。橫坐標(biāo)表示不同處理時(shí)間。圖5為轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型。其中，OE3、OE5、OE10、OE17分別代表4個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。圖6為轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同生長(zhǎng)條件下對(duì)干旱的響應(yīng)。a-b：擬南芥播種14天后進(jìn)行干旱處理，a：轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥的表型，b：轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥的氣孔開度；c-d：培養(yǎng)基中種植的擬南芥在甘露醇模擬的干旱環(huán)境中的表型，c：轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥的表型，d：轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥的干濕重比。圖7為棉花中GhNAC79編碼基因的表達(dá)受到抑制后的表型。a-b為pCLCrVA-pCLCrVB體系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，a為GhNAC79編碼基因的相對(duì)表達(dá)量，b為干旱處理后棉花的表型；pCLCrVA為空載體對(duì)照植株，pCLCrVA::PDS為指示植株，pCLCrVA::GhNAC79為轉(zhuǎn)基因植株，1-4為不同的轉(zhuǎn)基因株系。c-d為pYL156-pYL192體系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中c為GhNAC79編碼基因的相對(duì)表達(dá)量，d為干旱處理后棉花的表型；pYL156::PDS為指示植株，pYL156為空載體對(duì)照植株，pYL156::GhNAC79為轉(zhuǎn)基因植株，1-4為不同的轉(zhuǎn)基因株系。圖8為轉(zhuǎn)基因棉花干旱處理后的表型。其中，a為氣孔開度的結(jié)果，正常水分管理指所有植株均正常水分管理；干旱處理指所有植株均利用20％的PEG6000水溶液進(jìn)行模擬干旱處理。b：干旱處理7天后轉(zhuǎn)基因棉花和空載體植株的表型以及干旱處理14天后轉(zhuǎn)基因棉花和空載體植株的表型。a圖和b圖中，對(duì)照：空載體植株；株系8和株系36分別為GhNAC79的不同轉(zhuǎn)基因株系。圖中，﹡﹡表示差異達(dá)到極顯著水平(p<0.01)，﹡表示差異達(dá)到顯著水平(p<0.05)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑、儀器等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。下述實(shí)施例中的陸地棉品種中棉所10號(hào)(CCRI10)為國(guó)家審定品種(GS08007-1984)，由張?jiān)７?、刁光中、黃禎茂、喻樹迅、李武斌和王者民育成，詳細(xì)信息：http://www.cricaas.com.cn/succeedvariety/mhpz/4ca5b972dea522b4/，公眾可從申請(qǐng)人處獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。下述實(shí)施例中的陸地棉中棉所24為國(guó)家審定品種(GS08007-1984)，由黃禎茂、喻樹迅、姜瑞云、原日紅育成，詳細(xì)信息：http://www.cricaas.com.cn/succeedvariety/mhpz/65121237a4e927f1/，公眾可從申請(qǐng)人處獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。下述實(shí)施例中的pGBKT7載體為北京華諾時(shí)代科技有限公司產(chǎn)品；pBI121載體為北京華越洋生物科技有限公司產(chǎn)品；pCLCrVA載體和pCLCrVB載體記載在文獻(xiàn)(Guetal.，AversatilesystemforfunctionalanalysisofgenesandmicroRNAsincotton，PlantBiotechnologyJournal(2014)12,pp.638–649)中；pYL156載體和pYL192載體記載在文獻(xiàn)(TurgayUnveretal.，Virus-InducedGeneSilencing,aPostTranscriptionalGeneSilencingMethod，InternationalJournalofPlantGenomics，Volume2009)中；公眾可從申請(qǐng)人處獲得這些載體，這些載體只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。pCLCrVA::PDS為將pCLCrVA載體的SpeI和AscI識(shí)別序列間的DNA片段替換為pds基因序列得到的重組載體，pYL156::PDS為將pYL156載體的EcoRI和BamHI識(shí)別序列間的DNA片段替換為pds基因序列得到的重組載體。其中，pds基因序列為：TTCCCGTCCAACTAAACCATTGAAAGTCATAATTGCTGGTGCAGGTATCAATTTTGTCTTAGTTCTTATATTCGTTTTCTTCATCTTTCGGGAAATCCATTTTCTACGCCTTTGAACCTTTTTTTGCAGCTTCATGGTGCCTTTGCTGCTGCTAATTTTCTAAGAAGTTACTTATTTTTCCTACTGATGAACTGAATTTCGGCTTGACTTA。實(shí)施例1、GhNAC79及其編碼基因的制備與特性本發(fā)明從陸地棉品種中棉所10號(hào)(CCRI10)的葉片中克隆到了序列1所示的DNA分子，其中序列1的第53-751位編碼序列2所示的蛋白質(zhì)，將該蛋白質(zhì)命名為GhNAC79。1、GhNAC79的轉(zhuǎn)錄活性分別利用表2中的引物，從CCRI10的葉片克隆到了含有不同長(zhǎng)度GhNAC79編碼基因片段的DNA分子，將利用ADfra-1、ADfra-2、ADfra-3和ADfra-4得到的序列正確的DNA分子分別命名為DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3和DNA片段4。表2、引物序列其中，下劃線為限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列，EcoRI：GAATTC，CCG為保護(hù)堿基；BamHI：GGATCC，CGC為保護(hù)堿基。將DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3和DNA片段4均利用EcoRI和BamHI雙酶切后分別與EcoRI和BamHI雙酶切pGBKT7載體得到的載體骨架連接，得到4個(gè)重組質(zhì)粒，將其分別命名為pGBKT7-ADfra1(pGBKT7-fra1(23-485))、pGBKT7-ADfra2(pGBKT7-fra2(23-613))、pGBKT7-ADfra3(pGBKT7-fra3(479-767))和pGBKT7-ADfra4(pGBKT7-fra4(23-767))，其中，pGBKT7-ADfra1含有序列表中序列1的第23-485位所示的DNA分子，pGBKT7-ADfra2含有序列表中序列1的第23-613位所示的DNA分子，pGBKT7-ADfra3含有序列表中序列1的第479-767位所示的DNA分子，pGBKT7-ADfra4含有序列表中序列1的第23-767位所示的DNA分子，即含有GhNAC79編碼基因的完整序列。將pGBKT7-ADfra1、pGBKT7-ADfra2、pGBKT7-ADfra3和pGBKT7-ADfra4分別導(dǎo)入酵母菌株Y2H(Clontech)中，通過(guò)缺失培養(yǎng)基和特異PCR確定陽(yáng)性單克隆，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照(pGBKT7-p53+pGADT7-largeT)和陰性對(duì)照(pGBKT7-laminC+pGADT7-largeT)，pGBKT7-p53和pGADT7-largeT分別含有SV40大T抗原和鼠p53的AD和BD的融合蛋白，pGBKT7-laminC含有人laminC與BD的融合蛋白，具體操作步驟如下：1、根據(jù)clontech的酵母轉(zhuǎn)化說(shuō)明書(YeastmakerTMYeastTransformationSystem2UserManual)，將包含不同基因片段的重組載體(pGBKT7-ADfra1、pGBKT7-ADfra2、pGBKT7-ADfra3和pGBKT7-ADfra4)分別轉(zhuǎn)入酵母Y2H中。2、利用SD/-Trp/25mM3-AT篩選培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基為向SD/-Trp中加入3-AT得到的3-AT濃度為25mM的培養(yǎng)基)篩選得到陽(yáng)性酵母菌株，同時(shí)將陽(yáng)性菌株轉(zhuǎn)移至SD/-Trp/25mM3-AT/X-a-Gal固體培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基為向SD/-Trp/25mM3-AT篩選培養(yǎng)基中添加X-a-Gal得到的培養(yǎng)基)中，觀察菌株的顏色變化。待到菌株出現(xiàn)藍(lán)色，調(diào)取對(duì)應(yīng)菌斑，轉(zhuǎn)移至SD/-Trp/25mM3-AT液體培養(yǎng)基中，30℃搖床中擴(kuò)搖，直至菌液出現(xiàn)渾濁。3、利用特異PCR進(jìn)一步確定陽(yáng)性單克?。喝啙峋?0μl,利用PCR儀器破壁(99℃10min,4℃1min,2個(gè)循環(huán))PCR檢測(cè)：A、引物：T7(上游引物):TAATACGACTCACTATAGGGC；R:對(duì)應(yīng)基因片段的反向引物(下游引物)B、PCR體系(使用LATaqDNApolymerase聚合酶)1μl10mM上游引物、1μl10mM下游引物、0.25μl5U/μlTaKaRaLATaq、2.5μl10×TaqBufferII、4μldNTPMixture(2.5mMeach)、2μl破壁菌液，加滅菌水至25μl。C、PCR循環(huán)4℃保存結(jié)果如圖1所示：結(jié)果表明GhNAC79的轉(zhuǎn)錄活性位于C端，序列1的第479-767位、序列1的第23-613位和序列1的第23-767位編碼的蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)錄激活活性，序列1的第479-767位編碼序列2的第143-232位所示的蛋白質(zhì)，序列1的第23-613位編碼序列2的第1-187位所示的蛋白質(zhì)，序列1的第23-767位編碼序列2所示的GhNAC79蛋白質(zhì)。2、GhNAC79編碼基因的表達(dá)模式利用引物對(duì)(F:AATCACATTAATCGGTTTAC和R:CTAAAGATTCCAAAACCCATC)檢測(cè)GhNAC79編碼基因在陸地棉品種中棉所10號(hào)中的表達(dá)模式，所用內(nèi)參為GhHIS3基因，內(nèi)參的引物為：GhHis3F：GAAGCCTCATCGATACCGTC；GhHis3R：CTACCACTACCATCATGGC)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。2.1GhNAC79在不同組織中的表達(dá)模式選取組織為根、莖、子葉、真葉、花、0DPA、5DPA、10DPA、15DPA、20DPA和25DPA。其中0DPA、5DPA、10DPA、15DPA、20DPA和25DPA分別表示纖維發(fā)育不同時(shí)間(DPA：Daysafteranthesis,開花后天數(shù))。結(jié)果顯示GhNAC79編碼基因在子葉及纖維發(fā)育后期高表達(dá)(圖2)。2.2干旱與高鹽對(duì)GhNAC79編碼基因表達(dá)的影響選取陸地棉品種中棉所10號(hào)的健康種子30粒，雙氧水消毒后，隨機(jī)分為三組，分別點(diǎn)播于含有200mM甘露醇的1/2MS固體培養(yǎng)基(1/2MS固體培養(yǎng)基為將MS培養(yǎng)基中的各微量元素濃度減半得到的培養(yǎng)基)和含有200mMNaCl的1/2MS固體培養(yǎng)基中，以1/2MS固體培養(yǎng)基作為對(duì)照組。密閉條件下，25℃，16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)，15天后，取葉片檢測(cè)GhNAC79編碼基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在密閉條件下，GhNAC79編碼基因在葉片中的表達(dá)量能夠被甘露醇模擬的干旱環(huán)境誘導(dǎo)，GhNAC79編碼基因在葉片中的表達(dá)量在鹽(200mMNaCl)處理后沒有顯著性變化(圖3)。將PEG6000溶于水中，得到PEG6000質(zhì)量百分比濃度為20％的PEG6000溶液；將NaCl溶于水中，得到NaCl濃度為200mM的NaCl溶液。選取陸地棉品種中棉所10號(hào)的真葉30片，隨機(jī)分為三組，即對(duì)照組、干旱處理組和鹽處理組。將對(duì)照組、干旱處理組和鹽處理組的葉片分別浸泡在水、PEG6000溶液和NaCl溶液中，分別在浸泡0、2、4、6、8、12和24小時(shí)時(shí)取葉片檢測(cè)GhNAC79編碼基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，棉花葉片經(jīng)PEG6000溶液處理24小時(shí)時(shí)，GhNAC79編碼基因高表達(dá)，GhNAC79編碼基因的表達(dá)受PEG6000模擬的干旱環(huán)境的影響，而GhNAC79編碼基因的表達(dá)情況不受NaCl模擬的鹽環(huán)境的影響(圖4)。圖4中，A-G分別表示干旱處理組表達(dá)量由高到低的時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果表明，GhNAC79編碼基因的表達(dá)能夠被PEG6000和甘露醇模擬的干旱環(huán)境誘導(dǎo)，而NaCl模擬的高鹽環(huán)境對(duì)GhNAC79編碼基因的表達(dá)無(wú)明顯影響。實(shí)施例2、GhNAC79及其編碼基因可以提高擬南芥的抗旱性1、轉(zhuǎn)基因擬南芥的制備表達(dá)載體的制備：將pBI121載體的XbaI和SacI識(shí)別序列間的DNA片段替換為序列表中序列1的第53-751位所示的GhNAC79編碼基因，得到重組載體，將該重組載體命名為pBI121-GhNAC79。重組菌的制備：將pBI121-GhNAC79導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，得到重組菌，將該重組菌命名為L(zhǎng)BA4404-pBI121-GhNAC79。將pBI121導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，得到重組菌(作為空載體對(duì)照)，將該重組菌命名為L(zhǎng)BA4404-pBI121。利用花絮侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥：利用含有卡那霉素、鏈霉素和利福平的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)LBA4404-pBI121-GhNAC79，至農(nóng)桿菌培養(yǎng)液OD600值在1.2到1.6之間時(shí)，將農(nóng)桿菌培養(yǎng)液室溫5000rpm離心15min，棄上清，將沉淀懸浮于滲透液中，使OD600＝0.8，得到農(nóng)桿菌懸浮液。其中滲透液為向1/2MS培養(yǎng)基中添加Silwet-77得到的Silwet-77的體積分?jǐn)?shù)為0.02％的液體。將Columbia生態(tài)型擬南芥的花絮在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡1min，避光培養(yǎng)48小時(shí)開蓋，之后正常光照培養(yǎng)。分別在7天后和14天后分別重復(fù)上述步驟1次。最終得到T0代轉(zhuǎn)基因擬南芥，收獲T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子。將T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子滅菌后，點(diǎn)播至含有卡那霉素的1/2MS固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天后，選取綠色擬南芥，移栽至營(yíng)養(yǎng)土中，培養(yǎng)室中正常生長(zhǎng)。待綠色植株生長(zhǎng)健壯后，提取葉片DNA，并利用引物(F:GCTCTAGAAGACTGGCATGAATAAACAAG和R:CGAGCTCAGCTTCTCCATCTACACATCA)進(jìn)行PCR檢測(cè)，篩選含有目的基因的陽(yáng)性植株，得到T1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，收獲T2代轉(zhuǎn)基因種子。按照上述方法得到T4代轉(zhuǎn)基因種子。按照上述方法，利用LBA4404-pBI121進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，得到轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株。2、轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性檢測(cè)選取四個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(OE3、OE5、OE10和OE17，即分別為株系3、株系5、株系10和株系17)的T4代轉(zhuǎn)基因種子播種，播種20天后，每個(gè)株系選取12盆，將這12盆隨機(jī)分為四組：對(duì)照組、干旱處理組、脫落酸(ABA)處理組和鹽處理組，每組3盆。將對(duì)照組所有植株根部灌溉500ml的滅菌水。將干旱處理組所有植株根部灌溉500ml的20％(質(zhì)量百分比)PEG6000水溶液。將脫落酸(ABA)處理組所有植株葉面噴施200ml的50μMABA水溶液。將鹽處理組所有植株根部灌溉500ml的200mM的NaCl水溶液。每個(gè)處理均利用Columbia生態(tài)型擬南芥(即野生型，WT)與轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株作為對(duì)照。在處理7天后，觀察各組的表型(圖5)。結(jié)果顯示，對(duì)于對(duì)照組和鹽處理組，不同轉(zhuǎn)基因株系植株的表型與野生型及轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株沒有明顯差異；對(duì)于干旱處理組和ABA處理組，OE3、OE5、OE10和OE17均抽薹開花，而野生型及轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株均與對(duì)照組和鹽處理組各植株沒有明顯差異。結(jié)果說(shuō)明GhNAC79及其編碼基因可以使擬南芥對(duì)PEG6000模擬的干旱和ABA更加敏感。為了進(jìn)一步確定GhNAC79對(duì)干旱的響應(yīng)，選取轉(zhuǎn)基因株系OE3的T4代轉(zhuǎn)基因種子播種，播種14天后，選取20株隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組和干旱處理組，每組10株。將對(duì)照組植株根部灌溉500ml的滅菌水，將干旱處理組植株根部灌溉500ml的20％(質(zhì)量百分比)PEG6000水溶液。每種處理均利用Columbia生態(tài)型擬南芥(即野生型，WT)作為對(duì)照。在處理7天后，觀察各組的表型，并利用擬南芥倒數(shù)第二片蓮座葉的背部表皮制片，在顯微鏡下觀察氣孔運(yùn)動(dòng)，利用顯微鏡的標(biāo)尺測(cè)量并記錄氣孔最寬與最長(zhǎng)處，計(jì)算氣孔開度，氣孔開度為氣孔最寬與最長(zhǎng)處的比值(圖6中a和b)，所得到的氣孔開度值為同一植株20個(gè)氣孔開度的平均值。結(jié)果顯示，每種處理下野生型與轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的表型及氣孔開度無(wú)顯著差異，干旱處理后的轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)狀況明顯好于野生型，并且葉片卷曲程度顯著小于野生型擬南芥；在對(duì)照組的處理下，轉(zhuǎn)基因植株與野生型擬南芥的氣孔開度無(wú)顯著差異，在干旱處理下，轉(zhuǎn)基因植株的氣孔開度極顯著小于野生型擬南芥(轉(zhuǎn)基因植株的氣孔開度為0.6690±0.0502，野生型擬南芥的氣孔開度為0.7360±0.0614)(p<0.01)。表明，GhNAC79及其編碼基因可以降低擬南芥在干旱環(huán)境中的氣孔開度，進(jìn)一步可以減少植株水分的散失，提高抗旱能力。制備0mM甘露醇培養(yǎng)基和100mM甘露醇培養(yǎng)基：0mM甘露醇培養(yǎng)基即為1/2MS培養(yǎng)基，100mM甘露醇培養(yǎng)基為向0mM甘露醇培養(yǎng)基添加甘露醇得到的甘露醇濃度為100mM的培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)基因株系OE3的T4代轉(zhuǎn)基因種子與Columbia生態(tài)型擬南芥(即野生型，WT)播種至0mM甘露醇培養(yǎng)基和100mM甘露醇培養(yǎng)基中，并利用轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株作為對(duì)照，每個(gè)培養(yǎng)皿中均播種轉(zhuǎn)基因種子與野生型種子，每個(gè)培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)基因種子與野生型種子均為15粒，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，播種后正常培養(yǎng)，觀察表型。在播種15天后，分別取轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株15株，稱取濕重，然后烘干稱量干重，計(jì)算干濕比(干濕比＝干重/濕重，也即干濕重比)。結(jié)果(圖6中c和d)顯示，轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株與野生型在不同處理下的表型與干濕比均無(wú)顯著差異，在0mM甘露醇培養(yǎng)基中，野生型與轉(zhuǎn)基因植株的表型與干濕比無(wú)顯著差異；在100mM甘露醇培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于野生型，轉(zhuǎn)基因植株的干濕比顯著小于野生型(p<0.05)。表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥抗甘露醇模擬的干旱環(huán)境的能力高于野生型，在干旱環(huán)境中的失水能力小，保水能力強(qiáng)。表明GhNAC79及其編碼基因可以提高擬南芥的抗旱能力。實(shí)施例3、抑制棉花GhNAC79編碼基因的表達(dá)可以降低棉花的抗旱性利用pCLCrVA-pCLCrVB和pYL156-pYL192兩種VIGS體系誘導(dǎo)GhNAC79基因沉默。1、VIGS載體及重組菌的構(gòu)建將pCLCrVA載體的SpeI和AscI識(shí)別序列間的DNA片段替換為序列表中序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA分子，得到重組載體，將該重組載體命名為pCLCrVA::GhNAC79。擴(kuò)增序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA分子所用引物為：F1：ACTAGTCTACACCTCCTATCCTAAGAC，R1：GGCGCGCCAGCTTCTCCATCTACACAT。將pYL156載體的EcoRI和BamHI識(shí)別序列間的DNA片段替換為序列表中序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA分子，得到重組載體，將該重組載體命名為pYL156::GhNAC79。擴(kuò)增序列1的第504-775位核苷酸所示的DNA分子所用引物為：F2：GAATTCCTACACCTCCTATCCTAAGAC；R2：GGATCCAGCTTCTCCATCTACACAT。分別將pCLCrVA::GhNAC79、pCLCrVA載體(作為空載體對(duì)照)、pCLCrVA::PDS(作為指示載體)和輔助質(zhì)粒載體pCLCrVB導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，將得到重組菌分別命名為L(zhǎng)BA4404-pCLCrVA::GhNAC79、LBA4404-pCLCrVA、LBA4404-pCLCrVA::PDS和LBA4404-pCLCrVB。分別將pYL156::GhNAC79、pYL156載體(作為空載體對(duì)照)、pYL156::PDS(作為指示載體)和輔助質(zhì)粒載體pYL192導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，將得到重組菌分別命名為L(zhǎng)BA4404-pYL156::GhNAC79、LBA4404-pYL156、LBA4404-pYL156::PDS和LBA4404-pYL192。2、VIGS侵染棉花子葉及抗旱性檢測(cè)根據(jù)文獻(xiàn)(Guetal.,2014,AversatilesystemforfunctionalanalysisofgenesandmicroRNAsincotton；Kumagaietal.,1995,Cytoplasmicinhibitionofcarotenoidbiosynthesiswithvirus-derivedRNA)的實(shí)驗(yàn)步驟，用LBA4404-pCLCrVA::GhNAC79、LBA4404-pCLCrVA和LBA4404-pCLCrVA::PDS分別與LBA4404-pCLCrVB等摩爾混合后侵染陸地棉品種中棉所10號(hào)棉花幼苗子葉，均侵染10株幼苗，分別得到基因沉默棉株、空載體對(duì)照棉株和指示棉株。將這三種棉花幼苗黑暗條件下放置過(guò)夜后，在培養(yǎng)室正常生長(zhǎng)(22℃，16h光照/8h黑暗，低濕)，待侵染LBA4404-pCLCrVA::PDS的指示棉花幼苗葉片出現(xiàn)白化表型，利用實(shí)施例1中GhNAC79編碼基因的表達(dá)模式的檢測(cè)方法在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)GhNAC79編碼基因在棉花葉片中的表達(dá)量并進(jìn)行干旱處理，觀察表型。干旱處理方法如下：對(duì)空載體對(duì)照棉株和基因沉默棉株根部均灌溉500mL的20％(質(zhì)量百分比)PEG6000水溶液，待所有棉株出現(xiàn)顯著性萎蔫(表現(xiàn)為棉株所有葉片嚴(yán)重失水，萎蔫：成熟葉片卷曲，下垂，干枯，幼嫩葉片卷曲。)后，每個(gè)棉株根部灌溉500mL無(wú)菌水進(jìn)行復(fù)水，復(fù)水2天后拍照記錄各棉株表型。根據(jù)文獻(xiàn)(UnverandBudak2009,Virus-inducedgenesilencing,aposttranscriptionalgenesilencingmethod)的實(shí)驗(yàn)步驟，用LBA4404-pYL156::GhNAC79、LBA4404-pYL156和LBA4404-pYL156::PDS分別與LBA4404-pYL192等摩爾混合后侵染陸地棉品種中棉所10號(hào)棉花幼苗子葉，均侵染10株幼苗，分別得到基因沉默棉株、空載體對(duì)照棉株和指示棉株。將這三種棉花幼苗黑暗條件下放置過(guò)夜后，在培養(yǎng)室正常生長(zhǎng)(22℃，16h光照/8h黑暗，低濕)，待侵染LBA4404-pYL156::PDS的指示棉花幼苗葉片出現(xiàn)白化表型，利用實(shí)施例1中GhNAC79編碼基因的表達(dá)模式的檢測(cè)方法在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)GhNAC79編碼基因在棉花葉片中的表達(dá)量并進(jìn)行干旱處理，觀察表型。干旱處理方法如下：對(duì)空載體對(duì)照棉株和基因沉默棉株根部均灌溉500mL的20％(質(zhì)量百分比)PEG6000水溶液，待基因沉默棉株出現(xiàn)顯萎蔫后拍照記錄各棉株表型。結(jié)果如圖7所示。在pCLCrVA-pCLCrVB體系中，GhNAC79編碼基因在基因沉默棉株中的表達(dá)量顯著低于空載體對(duì)照(p<0.01)，對(duì)各棉花干旱處理后，待所有植株瀕臨死亡后，再?gòu)?fù)水，結(jié)果表明抑制GhNAC79的表達(dá)使轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)干旱抗性降低，并且復(fù)水后無(wú)法恢復(fù)生長(zhǎng)，表明GhNAC79及其編碼基因可以正調(diào)控棉花的抗干旱能力。在pYL156-pYL192體系中，GhNAC79編碼基因在基因沉默棉株中的表達(dá)量顯著低于空載體對(duì)照(p<0.01),對(duì)各棉花進(jìn)行干旱處理，基因沉默棉株出現(xiàn)顯萎蔫時(shí)，載體對(duì)照棉株的葉片均未出現(xiàn)萎蔫表型，結(jié)果表明抑制GhNAC79編碼基因的表達(dá)，棉花幼苗對(duì)干旱的抗性降低，表明GhNAC79及其編碼基因可以正調(diào)控棉花的抗干旱能力。實(shí)施例4、GhNAC79及其編碼基因可以提高棉花對(duì)干旱的抗性1、pBI121::GhNAC79過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)文獻(xiàn)(Zhang2008,EstablishmentofhighfrequencyregenerationsystemandgeneticanalysisformatureleafpetiolesinUplandcotton(G.hirsutumL.))的轉(zhuǎn)化方法，利用實(shí)施例2的LBA4404-pBI121-GhNAC79對(duì)陸地棉中棉所24(CCRI24)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到T0代轉(zhuǎn)基因棉花，并利用實(shí)施例2的LBA4404-pBI121作為空載體對(duì)照，得到空載體植株。2、陽(yáng)性棉花植株的檢測(cè)利用在pBI121-GhNAC79中35S啟動(dòng)子和GhNAC79編碼基因的序列上設(shè)計(jì)的引物(F(35S)：CCTAACAGAACTCGCCGTA；R：TCCCAATCTGAGTAAACCGAT)鑒定T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因棉花。將T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因棉花并嫁接至根系旺發(fā)達(dá)的海島棉枕木上，塑料袋密封條件下培養(yǎng)半個(gè)月后，打開塑料袋封口，待幼苗適應(yīng)開放條件后，將生長(zhǎng)良好的轉(zhuǎn)基因株系移栽至營(yíng)養(yǎng)土中，繼續(xù)培養(yǎng)。3、轉(zhuǎn)基因棉花的抗旱性檢測(cè)將T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因棉花的兩個(gè)株系Line8(株系8)和Line36(株系36)繼代培養(yǎng)至T1代，利用步驟2的引物對(duì)對(duì)葉片基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)篩選陽(yáng)性植株，待陽(yáng)性植株生長(zhǎng)良好時(shí)，進(jìn)行干旱處理，處理方法如下：將對(duì)照棉花、轉(zhuǎn)基因棉花Line8和Line36各取6株，隨機(jī)平均分為三組，即3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包含6株棉株：對(duì)照2株，轉(zhuǎn)基因株系Line8和Line36各2株。每組棉株放置于同一個(gè)塑料培養(yǎng)盆中，盆中倒入1L20％(質(zhì)量百分比)PEG6000水溶液進(jìn)行干旱處理，培養(yǎng)室中正常生長(zhǎng)，觀察棉花的表型并拍照記錄。利用空載體植株作為對(duì)照，結(jié)果如圖8所示。結(jié)果顯示，干旱處理7天后，對(duì)照棉株最底部的真葉萎焉并下垂，轉(zhuǎn)基因棉株相對(duì)正常生長(zhǎng)，干旱處理14天后，對(duì)照棉株的底部真葉掉落，轉(zhuǎn)基因棉株相對(duì)正常生長(zhǎng)。進(jìn)一步說(shuō)明GhNAC79及其編碼基因能夠提高棉花對(duì)干旱的抗性。正常生長(zhǎng)狀況下，單位面積內(nèi)轉(zhuǎn)基因棉花和對(duì)照植株的葉片氣孔數(shù)目和氣孔開度沒有明顯差異；干旱處理14天后，轉(zhuǎn)基因棉花葉片的氣孔開度顯著小于對(duì)照植株(與對(duì)照植株相比，Line8和Line36氣孔開度分別達(dá)到了顯著水平(p<0.05)和極顯著水平(p<0.01))，轉(zhuǎn)基因棉花葉片氣孔平均為16個(gè)/64mm2，對(duì)照植株葉片氣孔平均為14個(gè)/64mm2，說(shuō)明GhNAC79及其編碼基因可以通過(guò)調(diào)控氣孔開度調(diào)控棉花干旱抗性。<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所<120>GhNAC79及其在調(diào)控植物抗旱性中的應(yīng)用<160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>793<212>DNA<213>棉花<400>1cacgggggactctagaagactggcatgaataaacaagtataggcatataaaaatggagga60tatgccaccagggtttcggttctatcctactgaagaagagctggtttcgttttatctcca120caagaagcttgaagctaaaacagatgatgatctcaaccatgttatgaatcgtgttatacc180agttgtcgacatttataacttcaatccttgggatcttcctcaattctcagataacctatg240tcataaagacccagagcaatggtttttcttcattccaaggcaagagagtgaagctcgagg300agggagaccaaagcggctaacatcatcggggtactggaaagccactggttcacctggtta360tgtttactcttccaacagtcgccccataggtgtcaaacgaaccatggtcttctacaacgg420aagagccccaaatgggaagaaaactgactggaaaatgaacgaatataaagctattcaaga480ccatgtttctttagctaatgccactacacctcctatcctaagacaagaattcagcttgtg540ccgggtttataagaaatcgaaatgtttgaggtcattcgatagacggccgccagggatatt600aaagatgggagaatcgatccctcgactcgataataatcacattaatcggtttactcagat660tgggatgaacgataactcatcgacaaaaaaagacgttgtcgacgacgacgaatatgcatt720ttgggatgttgatgggttttggaatctttagagatgatgtgtagatggagaagctgagct780cgaatttccccga793<210>2<211>232<212>PRT<213>棉花<400>2MetGluAspMetProProGlyPheArgPheTyrProThrGluGluGlu151015LeuValSerPheTyrLeuHisLysLysLeuGluAlaLysThrAspAsp202530AspLeuAsnHisValMetAsnArgValIleProValValAspIleTyr354045AsnPheAsnProTrpAspLeuProGlnPheSerAspAsnLeuCysHis505560LysAspProGluGlnTrpPhePhePheIleProArgGlnGluSerGlu65707580AlaArgGlyGlyArgProLysArgLeuThrSerSerGlyTyrTrpLys859095AlaThrGlySerProGlyTyrValTyrSerSerAsnSerArgProIle100105110GlyValLysArgThrMetValPheTyrAsnGlyArgAlaProAsnGly115120125LysLysThrAspTrpLysMetAsnGluTyrLysAlaIleGlnAspHis130135140ValSerLeuAlaAsnAlaThrThrProProIleLeuArgGlnGluPhe145150155160SerLeuCysArgValTyrLysLysSerLysCysLeuArgSerPheAsp165170175ArgArgProProGlyIleLeuLysMetGlyGluSerIleProArgLeu180185190AspAsnAsnHisIleAsnArgPheThrGlnIleGlyMetAsnAspAsn195200205SerSerThrLysLysAspValValAspAspAspGluTyrAlaPheTrp210215220AspValAspGlyPheTrpAsnLeu225230當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3