本發(fā)明涉及遺傳工程領(lǐng)域，具體涉及一種功能蛋白POX04420及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：人類的生產(chǎn)生活或多或少地消耗著能量，隨著化石燃料如石油、煤炭等非可再生能源的不斷消耗以及所帶來的一系列嚴(yán)重的社會問題。尋找可替代的、清潔的再生能源已成為研究者們和各國政府關(guān)注的焦點(diǎn)(Singh，R.，Krishna，B.B.，Kumar，J.，Bhaskar，T.Opportunitiesforutilizationofnon-conventionalenergysourcesforbiomasspretreatment[J].BioresourTechnol2016，199：398-407)。以纖維素為主要成分的植物木質(zhì)纖維素類物質(zhì)是地球上最豐富的可再生資源，全球每年產(chǎn)生約1800億噸植物木質(zhì)纖維素類物質(zhì)，其中小麥、水稻秸稈和甘蔗渣的量分別為3.54、7.31和1.81億噸，是極其廉價的可利用的原料(Taha，M.，F(xiàn)oda，M.，Shahsavari，E.，Aburto-Medina，A.，Adetutu，E.，Ball，A.Commercialfeasibilityoflignocellulosebiodegradation：possibilitiesandchallenges[J].CurrOpinBiotechnol2016，38：190-197)。中國是個農(nóng)業(yè)大國，擁有極其巨大的植物生物質(zhì)資源，每年產(chǎn)生約7.3億噸的農(nóng)作物秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物，相當(dāng)于12000萬億kJ的能量。此外，中國每年還產(chǎn)生約3700萬立方米的森林廢棄物，相當(dāng)于580萬億kJ的能量(Ma，L.，Wang，T.，Liu，Q.，Zhang，X.H.，Ma，W.C.，Zhang，Q.Areviewofthermal-chemicalconversionoflignocellulosicbiomassinChina[J].BiotechnolAdv2012，30(4)：859-873)。木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，其中，纖維素含量最多，由成百上千個葡萄糖分子聚合而成，占40％-50％；半纖維素次之，占25％-30％；木質(zhì)素含量最少，主要由結(jié)構(gòu)復(fù)雜的含芳香環(huán)的有機(jī)分子聚合而成，占15％-20％(Brethauer，S.，Studer，M.H.Biochemicalconversionprocessesoflignocellulosicbiomasstofuelsandchemicals-areview[J].CHIMIAIntJChem2015，69(10)：572-581)。篩選和構(gòu)建高效的產(chǎn)纖維素酶的微生物菌株，實(shí)現(xiàn)天然纖維素的有效生物轉(zhuǎn)化，具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣闊的發(fā)展前景。生產(chǎn)中，纖維素酶主要來自于絲狀真菌，例如，木霉、青霉和曲霉等(Gusakov，AV.AlternativestoTrichodermareeseiinbiofuelproduction[J].TrendsBiotechnol2011，29(9)：419-425；Yao，GS.，Li，ZH.，Gao，LW.，Wu，RM.，Kan，QB.，Liu，GD.，Qu，YB.RedesiginingtheregulatorypathwaytoenhancecellulaseproductioninPenicilliumoxalicum[J].BiotechnolBiofuel2015，8：71；Florencio，C.，Cunha，F(xiàn).，Badino，A.，F(xiàn)arinas，C.，Ximenes，E.，Ladisch，M.SecretomeanalysisofTrichodermareeseiandAspergillusnigercultivatedbysubmergedandsequentialfermentationprocesses：Enzymeproductionforsugarcanebagassehydrolysis[J].EnzymeMicrobTech2016，90：53-60)。根據(jù)作用方式的不同，纖維素酶主要分為三類：內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖酶(endo-1，4-β-D-glucanase，EG，EC3.2.1.4)、纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase，CBH，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BGL，EC3.2.1.21)(Lynd，L..R.，Weimer，P.J.，vanZyl，W.H.，Pretorius，I.S.Microbialcelluloseutilization：fundamentalsandbiotechnology[J].MicrobiolMoleculBiolR2002，66(3)：506-577；Glass，N.L.，Schmoll，M.，Cate，J.H.，Coradetti，S.Plantcellwalldeconstructionbyascomycetefungi[J].AnnuRevMicrobiol2013，67：477-498)。EG作用于纖維素鏈分子內(nèi)部，隨機(jī)水解纖維素分子內(nèi)的β-1，4-糖苷鍵，產(chǎn)生短的纖維素鏈或可溶性纖維寡糖，暴露出新的纖維素鏈末端。CBH沿著纖維素鏈末端由外向里水解β-1，4-糖苷鍵，釋放纖維二糖。上述酶解反應(yīng)為固相反應(yīng)，反應(yīng)速度慢，是纖維素酶水解的限速步驟。繼而是液相反應(yīng)，反應(yīng)速度快。在液相反應(yīng)中，EG和CBH繼續(xù)水解上述固相反應(yīng)產(chǎn)生的可溶性纖維寡糖產(chǎn)生纖維二糖，BGL將上述固相反應(yīng)和液相反應(yīng)產(chǎn)生的纖維二糖水解成葡萄糖。通過這三種酶的協(xié)同作用，纖維素酶將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖，葡萄糖可以被微生物利用產(chǎn)生化學(xué)品如被釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)燃料酒精(Wang，J.，Quirk，A.，Lipkowski，J.，Dutcher，J.R.andClarke.A.J.Directinsituobservationofsynergismbetweencellulolyticenzymesduringthebiodegradationofcrystallinecellulosefibers[J].Langmuir2013，29(48)：14997-15005；Zhang，Y.H.P.，Himmel，M.E.，Mielenz，J.R.Outlookforcellulaseimprovement：screeningandselectionstrategies[J].BiotechnolAdv2006，24(5)：452-481；Dashtban，M.，Schraft，H.，Qin，W.Fungalbioconversionoflignocellulosicresidues：opportunityandperspectives[J].IntJBiolSci2009，5(6)：578-595)。纖維素酶可應(yīng)用在食品、飼料、釀造和釀酒、農(nóng)業(yè)、生物煉油、紙漿和造紙、紡織和洗滌等行業(yè)(Kuhad，R.C.，Gupta，R.，Singh，A.Microbialcellulasesandtheirindustrialapplication[J].EnzymeRes2011，ArticleID280696)。木霉、曲霉、青霉、粗糙脈胞菌等絲狀真菌在誘導(dǎo)物存在的情況下，可迅速啟動纖維素酶和半纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯合成纖維素酶和半纖維素酶。真菌細(xì)胞內(nèi)存在多個功能保守的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控纖維素酶和半纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，例如，里氏木霉中的Crel(Portnoy，T.，Margeot，A.，Linke，R.，Atanasova，L.，F(xiàn)ekete，E.，Sándor，E.，Hartl，L.，Karaffa，L.，Druzhinina，IS.，Seiboth，B.，LeCrom，S.，Kubicek，CP.TheCRE1carboncataboliterepressorofthefungusTrichodermareesei：amasterregulatorofcarbonassimilation[J].BMCGenomics2011，12：269)，AceII(Aro，N.，Saloheimo，A.，Ilmen，M.，M.ACEII，anoveltranscriptionalactivatorinvolvedinregulationofcellulaseandxylanasegenesofTrichodermareesei[J].JBiolChem2001，276(26)：24309-24314)，曲霉中的XlnR(Hasper，A.A.，Trindade，L.M.，vanderVeen，D.，vanOoyen，A.J.，deGraaff，L.H.FunctionalanalysisofthetranscriptionalactivatorXlnRfromAspergillusniger[J].Microbiology2004，150：1367-1375)，PacC(Kunitake，E.，Hagiwara，D.，Miyamoto，K.，Kanamaru，K.，Kimura，M.，Kobayashi，T.RegulationofgenesencodingcellulolyticenzymesbyPal-PacCsignalinginAspergillusnidulans[J].ApplMicrobiolBiotechnol2016，100(8)：3621-3635)，粗糙脈孢菌中的Clrl和Clr2(Craig，J.P.，Coradetti，S.T.，Starr，T.L.，Glass，N.L.DirecttargetnetworkoftheNeurosporacrassaplantcellwalldeconstructionregulatorsCLR-1，CLR-2，andXLR-1[J].mBio2015，6(5)：e1415-e1452)，以及草酸青霉中的ClrB，CreA，XlnR和AmyR(Li，H.，Yao，G.，Wu，R.，Gao，L.，Kan，Q.，Liu，M.，Yang，P.，Liu，G.，Qin，Y.，Song，X.，Zhong，Y.，F(xiàn)ang，X.，Qu，Y.Synergisticanddose-controlledregulationofcellulasegeneexpressioninPenicilliumoxalicum[J].PLoSGenet2015，11：e1005509)，ClrC(Lei，Y.，Liu，G.，Yao，G.，Li，Z.，Qin，Y.，Qu，Y.AnovelbZIPtranscriptionfactorClrCpositivelyregulatesmultiplestressresponses，conidiationandcellulaseexpressioninPenicilliumoxalicum[J].ResMicrobiol2016.167(5)：424-435)等。這些轉(zhuǎn)錄因子呈現(xiàn)共調(diào)控作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)草酸青霉可以產(chǎn)生完整的纖維素酶系及高活力的β-葡萄糖苷酶(Gusakov，A.V.AlternativestoTrichodermareeseiinbiofuelproduction[J].TrendsBiotechnol2011，29(9)：419-425；Yao，G.S.，Li，Z.H.，Gao，L.W.，Wu，R.M.，Kan，Q.B.，Liu，G.D.，Qu，Y.B.RedesiginingtheregulatorypathwaytoenhancecellulaseproductioninPenicilliumoxalicum[J].BiotechnolBiofuel2015，8：71；Zhao，S.，Yan，Y.S.，He，Q.P.，Yang，L.，Yin，X.，Li，C.X.，Mao，L.C.，Liao，L.S.，Huang，J.Q.，XieS.B.，Nong，Q.D.，Zhang，Z.，Jing，L.，Xiong，Y.R.，Duan，C.J.，Liu，J.L.，F(xiàn)eng，J.X.Comparativegenomic，transcriptomicandsecretomicprofilingofPenicilliumoxalicumHP7-1anditscellulaseandxylanasehyper-producingmutantEU2016，andidentificationoftwonovelregulatorygenesofcellulaseandxylanasegeneexpression[J].BiotechnolBiofuel2016，(9)：203)，在工業(yè)生產(chǎn)纖維素酶方面具有應(yīng)用價值?；阼b定的真菌調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)建的基因工程菌株比野生型菌株明顯提高了纖維素酶的產(chǎn)量。例如，在瑞氏木霉中過量表達(dá)ace3后纖維素酶的產(chǎn)量比野生型菌株的顯著提高(Hakkinen，M.，Valkonen，M.，Westerholm-Parvinen，A.，Aro，N.，Arvas，N.，Vitikainen，M.，Penttila，M.，Saloheimo，M.，Pakula，T.ScreeningofcandidateregulatorsforcellulaseandhemicellulaseproductioninTrichodermareeseiandidentificationofafactoressentialforcellulaseproduction[J].BiothechnolBiofuel2014，7∶14)。在草酸青霉中，Yao等遺傳改造草酸青霉菌株114-2，通過缺失crel和bgl2，過量表達(dá)clrB，構(gòu)建突變菌株RE-10，檢測發(fā)現(xiàn)菌株RE-10的纖維素酶產(chǎn)量比野生型的提高了20倍(Yao，G.，Li，Z.，Gao，L.，Wu，R.，Kan，Q.，Liu，G.，Qu，Y.RedesigningtheregulatorypathwaytoenhancecellulaseproductioninPenicilliumoxalicum[J].BiotechnolBiofuel2015，8：71)。但是，真菌纖維素酶的產(chǎn)量仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足木質(zhì)纖維素工業(yè)規(guī)模生物煉制的需求。因此，鑒定絲狀真菌纖維素酶基因更多新的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，為通過理性設(shè)計(jì)、遺傳改造真菌以提高纖維素酶產(chǎn)量提供理論指導(dǎo)，具有潛在的應(yīng)用價值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種功能蛋白POX04420及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，獲自草酸青霉，命名為POX04420蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(a2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。序列1由302個氨基酸殘基組成，自N端的第237-290位氨基酸殘基為其結(jié)合功能域，自N端的第237-259和265-290位氨基酸殘基為兩個連續(xù)的功能域，功能域均為C2H2型，可與DNA結(jié)合。為了使(a1)中的POX04420蛋白便于純化和檢測，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-mvc10EQKLISEEDL上述(a2)中的POX04420蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(a2)中的POX04420蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述POX04420蛋白的基因(POX04420基因)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因具體可為如下(1)-(4)中任一所述的DNA分子：(1)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的DNA分子；(2)序列表的序列3所示的DNA分子；(3)在嚴(yán)格條件下與(1)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼所述POX04420蛋白的DNA分子；(4)與(1)或(2)或(3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼所述POX04420蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA雜交實(shí)驗(yàn)中65℃下雜交并洗膜。序列表的序列2是POX04420基因的開放閱讀框(ORF)序列，由909個堿基組成。序列表的序列3是POX04420基因的基因組DNA序列，自5′端的第179-259位堿基為POX04420基因的一個內(nèi)含子。含有所述POX04420基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)所述POX04420蛋白或POX04420基因的應(yīng)用，為如下(b1)-(b14)中的至少一種：(b1)調(diào)控微生物纖維素酶產(chǎn)量；(b2)調(diào)控微生物半纖維素酶產(chǎn)量；(b3)調(diào)控微生物羧甲基纖維素酶產(chǎn)量；(b4)調(diào)控微生物外切纖維素酶產(chǎn)量；(b5)調(diào)控微生物木聚糖酶產(chǎn)量；(b6)調(diào)控微生物β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量；(b7)調(diào)控微生物纖維素酶基因的表達(dá)量；(b8)調(diào)控微生物半纖維素酶基因的表達(dá)量；(b9)調(diào)控微生物內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖酶基因的表達(dá)量；(b10)調(diào)控微生物纖維二糖水解酶基因的表達(dá)量；(b11)調(diào)控微生物β-葡萄糖苷酶基因的表達(dá)量；(b12)調(diào)控微生物木聚糖酶基因的表達(dá)量；(b13)調(diào)控微生物纖維素酶基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的表達(dá)量；(b14)調(diào)控微生物木聚糖酶基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的表達(dá)量。所述(b1)-(b5)中，所述調(diào)控為正向調(diào)控。所述(b6)中，所述調(diào)控為負(fù)向調(diào)控。所述纖維素酶基因具體可為POX05587、POX04786、POX01166、POX02740、POX04173、POX05571、POX06147、POX06983、POX07535、POX06835、POX07963或POX08882。所述纖維二糖水解酶基因具體可為POX05587或POX04786。所述內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖酶基因具體可為POX01166、POX02740、POX04173、POX05571、POX06147、POX06983或POX07535。所述β-葡萄糖苷酶基因具體可為POX06835、POX07963或POX08882。所述半纖維素酶基因具體可為POX05916、POX06783或POX08484。所述木聚糖酶基因具體可為POX05916、POX06783或POX08484。所述纖維素酶基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子或所述木聚糖酶基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子具體可為PoxBrlA(無性繁殖調(diào)控因子)、PoxClrB(纖維素降解調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子)、PoxFlbD(無性繁殖調(diào)控因子)、PoxAmyR(淀粉酶基因表達(dá)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子)。本發(fā)明還保護(hù)一種抑制微生物生產(chǎn)纖維素酶和/或半纖維素酶的能力的方法，包括如下步驟：抑制所述微生物中POX04420基因的表達(dá)，得到生產(chǎn)纖維素酶和/或半纖維素酶的能力降低的微生物。本發(fā)明還保護(hù)一種抑制微生物生產(chǎn)纖維素酶和/或半纖維素酶的能力的方法，包括如下步驟：降低POX04420蛋白的表達(dá)量和/或活性，得到生產(chǎn)纖維素酶和/或半纖維素酶的能力降低的微生物。所述“抑制所述微生物中POX04420基因的表達(dá)”是通過向所述微生物中導(dǎo)入POX04420基因敲除盒實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明還保護(hù)一種制備重組微生物的方法，包括如下步驟：將抑制POX04420基因表達(dá)的物質(zhì)導(dǎo)入出發(fā)微生物，得到生產(chǎn)纖維素酶和/或半纖維素酶的能力低于所述出發(fā)微生物的重組微生物。所述抑制POX04420基因表達(dá)的物質(zhì)具體可為POX04420基因敲除盒。所述抑制POX04420基因表達(dá)的物質(zhì)還可為干擾載體；所述干擾載體為含有POX04420基因敲除盒的重組載體。以上任一所述POX04420基因敲除盒具體為序列表的序列4所示的DNA分子。以上任一所述微生物或所述出發(fā)微生物可為青霉，具體可為草酸青霉，更具體可為草酸青霉HP7-1。以上任一所述微生物或所述出發(fā)微生物更具體可為以草酸青霉HP7-1為出發(fā)菌，敲除其Ku70基因得到的重組菌。以上任一所述微生物或所述出發(fā)微生物更具體可為草酸青霉Ku70基因敲除突變體ΔPoxKu70。本發(fā)明還保護(hù)采用以上任一所述方法制備得到的重組微生物。所述重組微生物具體可為實(shí)施例中的ΔPOX04420-2，又稱為草酸青霉(Penicilliumoxalicum)ΔPOXO4420，已于2016年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；郵編：100101)，保藏編號為CGMCCNO.12967。本發(fā)明通過同源重組的方法敲除草酸青霉突變體ΔPoxKu70中的POX04420基因(將所有敲除POX04420基因的重組菌均命名為突變株ΔPOX04420)。突變株ΔPOX04420具有如下特點(diǎn)：(1)在葡萄糖培養(yǎng)條件下，突變株ΔPOX04420能夠正常生長。(2)在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突變株ΔPOX04420的濾紙酶活力、羧甲基纖維素酶活力、外切纖維素酶活力、木聚糖酶活力均顯著降低。(3)在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突變株ΔPOX04420的β-葡萄糖苷酶活力顯著升高。(4)在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突變株ΔPOX04420中纖維素酶基因和木聚糖酶基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低/升高。(5)在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突變株ΔPOX04420中已知關(guān)鍵纖維素酶基因和木聚糖酶基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低/升高。本發(fā)明提供了一種草酸青霉的功能蛋白POX04420，通過實(shí)驗(yàn)證明POX04420在調(diào)控纖維素酶和木聚糖酶基因的表達(dá)過程中起關(guān)鍵性作用，在提高纖維素酶產(chǎn)量中具有應(yīng)用潛力。附圖說明圖1為構(gòu)建POX04420基因敲除盒的PCR產(chǎn)物電泳圖。圖2為POX04420基因敲除盒的元件示意圖。圖3為突變株ΔPOX04420的PCR驗(yàn)證電泳圖。圖4為突變株ΔPOX04420的Southern雜交驗(yàn)證圖。圖5為突變株ΔPoxKu70和ΔPOX04420-2在葡萄糖培養(yǎng)條件下的生物量檢測結(jié)果。圖6為突變株ΔPoxKu70、ΔPOX04420-2、ΔPOX04420-6和ΔPOX04420-8的濾紙酶產(chǎn)量檢測結(jié)果。圖7為突變株ΔPoxKu70、ΔPOX04420-2、ΔPOX04420-6和ΔPOX04420-8的羧甲基纖維素酶產(chǎn)量檢測結(jié)果。圖8為突變株ΔPoxKu70、ΔPOX04420-2、ΔPOX04420-6和ΔPOX04420-8的外切纖維素酶產(chǎn)量檢測結(jié)果。圖9為突變株ΔPoxKu70、ΔPOX04420-2、ΔPOX04420-6和ΔPOX04420-8的木聚糖酶產(chǎn)量檢測結(jié)果。圖10為突變株ΔPoxKu70、ΔPOX04420-2、ΔPOX04420-6和ΔPOX04420-8的β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量檢測結(jié)果。圖11為突變株ΔPOX04420相對ΔPoxKu70在Avicel誘導(dǎo)條件下不同纖維素酶和木聚糖酶基因的RT-PCR檢測結(jié)果。圖12為突變株ΔPOX04420相對ΔPoxKu70在Avicel誘導(dǎo)條件下已知轉(zhuǎn)錄因子PoxFlrD，PoxAmyR，PoxClrB和PoxBrlA編碼基因的RT-PCR檢測結(jié)果。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。質(zhì)粒pCPXG418：參考文獻(xiàn)：Chen，M.M.，JiangM.G.，Shang，J.J.，Lan，X.W.，YangF.，Huang，J.K.，Nuss，D.L.，Chen，B.S.CYP1，ahypovirus-regulatedcyclophilin，isrequiredforvirulenceinthechestnutblightfungus[J].MolPlantPathol2011，12(3)：239-246；質(zhì)粒pCPXG418在文獻(xiàn)中的名稱為“transformationvectorpCPXG418”，公眾可以從廣西大學(xué)獲得。DNA純化試劑盒：天根生化科技有限公司，貨號：DP214。溶菌酶：索萊寶公司，貨號：L8120。蝸牛酶：索萊寶公司，貨號：S8280。裂解酶：Sigma公司，貨號：L1412-5G。PDA培養(yǎng)基：BD公司，貨號：5056836。再生培養(yǎng)基：酸水解酪蛋白1.0g、酵母提取物1.0g、蔗糖342.0g、瓊脂17.0g，蒸餾水定容至1L，115℃滅菌20分鐘?；九囵B(yǎng)基：KH2PO44.0g、(NH4)2SO44.0g、MgSO4·7H2O0.6g、CaCl20.6g、FeSO4·7H2O0.005g、MnSO40.0016g、ZnCl20.0017g、CoCl20.002g、Tween801.0g，蒸餾水定容至1L，pH5.5；115℃滅菌20分鐘。葡萄糖液體培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中加入葡萄糖，葡萄糖在培養(yǎng)基中的終濃度為10g/L。Avicel液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中加入微晶纖維素(Avicel)，Avicel在培養(yǎng)基中的終濃度為20g/L。CM培養(yǎng)基：20×硝酸鹽50mL、微量元素混合液1mL、葡萄糖10.0g、蛋白胨2.0g、酵母提取物1.0g、酸水解酪蛋白1.0g，調(diào)pH至6.5；115℃滅菌20分鐘。20×硝酸鹽：NaNO3120g、KCl10.4g、MgSO4.7H2O10.4g、KH2PO430.4g，蒸餾水定容至1L；高壓滅菌后室溫保存。微量元素混合液：ZnSO4.7H2O2.2g、H3BO31.1g、MnCl2.4H2O0.5g、FeSO4.7H2O0.5g、CoCl2.6H2O0.17g、CuSO4.5H2O0.16g、Na2MoO4.2H2O0.15g、Na4EDTA5.0g，蒸餾水定容至100mL。酶解液：溶菌酶0.2g、蝸牛酶0.3g、裂解酶0.3g，溶于50mLOM溶液中；28℃，180rpm震蕩30分鐘后離心，將上清液過濾除菌，得到酶解液。OM溶液：MgSO4.7H2O73.92g、NaH2PO40.3g，溶于400mL去離子水；用1MNa2HPO4水溶液調(diào)節(jié)pH至5.8，蒸餾水定容至500mL。Trappingbuffer溶液：山梨醇36.4g、Tris6.05g，溶于400mL去離子水中，用稀HCl溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，蒸餾水定容至500mL。STC溶液：山梨醇91g、Tris6g、CaCl25.55g，溶于400mL去離子水中，用稀HCl溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，蒸餾水定容至500mL。PTC溶液：聚乙二醇335040g、Tris3g、CaCl22.25g，溶于200mL去離子水中，用稀HCl溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，蒸餾水定容至250mL。0.1％吐溫80溶液：由吐溫80和水組成，吐溫80的體積百分含量為0.1％。實(shí)施例1、草酸青霉中功能蛋白POX04420及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)經(jīng)過對草酸青霉(Penicilliumoxalicum)菌株HP7-1的基因組及其在不同培養(yǎng)條件下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行大量分析和功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了一個新蛋白及其編碼基因。草酸青霉菌株HP7-1的基因組序列分析的文獻(xiàn)如下：Zhao，S.，Yan，Y.S.，He，Q.P.，Yang，L.，Yin，X.，Li，C.X.，Mao，L.C.，Liao，L.S.，Huang，J.Q.，XieS.B.，Nong，Q.D.，Zhang，Z.，Jing，L.，Xiong，Y.R.，Duan，C.J.，Liu，J.L.，F(xiàn)eng，J.X.Comparativegenomic，transcriptomicandsecretomicprofilingofPenicilliumoxalicumHP7-1anditscellulaseandxylanasehyper-producingmutantEU2106，andidentificationoftwonovelregulatorygenesofcellulaseandxylanasegeneexpression[J].BiotechnolBiofuel2016，9：203；草酸青霉菌株HP7-1在文獻(xiàn)中的名稱為“PenicilliumoxalicumstrainHP7-1”。草酸青霉菌株HP7-1保藏號為：CGMCC10781，公眾也可以從廣西大學(xué)獲得。將序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)命名為POX04420，由302個氨基酸殘基組成。將編碼POX04420的基因命名為POX04420基因，POX04420基因的開放閱讀框(ORF)如序列表的序列2所示。POX04420基因的基因組DNA如序列表的序列3所示。實(shí)施例2、POX04420基因敲除盒的構(gòu)建1、提取草酸青霉菌株HP7-1的基因組DNA。2、以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用引物POX04420-L-F和引物POX04420-L-R組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到POX04420基因ORF上游的1998bpDNA片段(電泳結(jié)果見圖1的泳道1)，稱為POX04420左臂。POX04420-L-F：5’-GCCAACATCAAAGTCCGATAACA-3’：POX04420-L-R：5’-GGTAATCCTTCTTTCTAGATGTCGGACTAGATGCTTCGT-3’。3、以質(zhì)粒pCPXG418為模板，采用引物G418-F和引物G418-R組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到抗生素G418抗性基因的編碼序列(1890bp)(電泳結(jié)果見圖1的泳道2)。G418-F：5’-TCTAGAAAGAAGGATTACC-3’：G418-R：5’-GTCGACAGAAGATGATATT-3’。4、以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用引物POX04420-R-F和引物POX04420-R-R組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到POX04420基因ORF下游的2656bpDNA片段(電泳結(jié)果見圖1的泳道3)，稱為POX04420右臂。POX04420-R-F：5’-AATATCATCTTCTGTCGACGACAACAAAAAACCCCCTTCA-3’；POX04420-R-R：5’-CGATTCGTGCGTGATGTTGAG-3’。5、將步驟2、步驟3和步驟4得到的三個PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化，然后按照摩爾比1∶1∶1混合后，進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增，得到PCR混合產(chǎn)物。融合PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性98℃3min；98℃30s，58℃15s，72℃3min，一共進(jìn)行30個循環(huán)反應(yīng)；72℃10min。6、以步驟5得到的PCR混合產(chǎn)物為模板，采用引物POX04420-N-F和引物POX04420-N-R組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到5572bpPCR產(chǎn)物(電泳結(jié)果見圖1的泳道4)。POX04420-N-F：5’-ATACAAACCAAACGAGAAAGTGAA-3’：POX04420-N-R：5’-CGTCCTCGTTCCACTTGCG-3’。經(jīng)測序，得到的PCR產(chǎn)物如序列表的序列4所示。將序列表的序列4所示的DNA分子命名為POX04420基因敲除盒。序列4中，自5’端第1-1533位核苷酸為POX04420左臂區(qū)段，第1534-3423位核苷酸為G418抗性基因區(qū)段，第3424-5572位核苷酸為POX04420右臂區(qū)段。POX04420基因敲除盒的元件示意圖見圖2。實(shí)際應(yīng)用中，也可以直接人工合成序列4所示DNA分子。實(shí)施例3、草酸青霉POX04420基因缺失突變株ΔPOX04420的構(gòu)建與驗(yàn)證1、以草酸青霉菌株HP7-1為出發(fā)菌，敲除其Ku70基因，得到草酸青霉突變體ΔPoxKu70。記載草酸青霉突變體ΔPoxKu70，以及敲除Ku70基因的具體步驟的文獻(xiàn)如下：Zhao，S.，Yan，Y.S.，He，Q.P.，Yang，L.，Yin，X.，Li，C.X.，Mao，L.C.，Liao，L.S.，Huang，J.Q.，XieS.B.，Nong，Q.D.，Zhang，Z.，Jing，L.，Xiong，Y.R.，Duan，C.J.，Liu，J.L.，F(xiàn)eng，J.X.Comparativegenomic，transcriptomicandsecretomicprofilingofPenicilliumoxalicumHP7-1anditscellulaseandxylanasehyper-producingmutantEU2106，andidentificationoftwonovelregulatorygenesofcellulaseandxylanasegeneexpression[J].BiotechnolBiofuel2016，9：203；草酸青霉突變體ΔPoxKu70在文獻(xiàn)中的名稱為“PenicilliumoxalicummutantΔPoxKu70”。草酸青霉突變體ΔPoxKu70保藏號為：CGMCC3.15650，公眾也可從廣西大學(xué)獲得。2、制備草酸青霉突變體ΔPoxKu70的原生質(zhì)體(1)將步驟1得到的草酸青霉突變體ΔPoxKu70接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃靜置培養(yǎng)6天后，用0.1％吐溫80溶液將平板表面的孢子洗脫，得到孢子懸浮液(1×108個孢子/mL)。(2)取2mL步驟(1)的孢子懸浮液，接種至200mLCM培養(yǎng)基中，28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)8小時。(3)完成步驟(2)后，4℃、3500rpm離心10min，棄上清，收集菌絲體沉淀，用0.6MMgSO4·7H2O水溶液洗滌2次，然后4℃、3500rpm離心15min，棄上清，收集菌絲體沉淀。(4)取(3)得到的菌絲體，用50mL酶解液重懸，28℃、180rpm振蕩反應(yīng)2-3小時以進(jìn)行酶解；用顯微鏡觀察到大部分菌絲形成原生質(zhì)體后，按每管12.5mL分裝到50mL離心管中，加入2倍體積的Trappingbuffer溶液，4℃、3500rpm離心30分鐘，觀察到明顯的分層現(xiàn)象。(5)用巴氏吸管小心地吸出步驟(4)中間層的原生質(zhì)體至新的50mL離心管中，加入2倍體積1M山梨醇水溶液漂洗1次，4℃、3500rpm離心15分鐘，再使用20mLSTC溶液漂洗2次后離心，棄上清，得到原生質(zhì)體。3、草酸青霉突變株ΔPOX04420的構(gòu)建及驗(yàn)證(1)將4體積份的STC溶液和1體積份的PTC溶液混合，得到混合液，用混合液重懸步驟2得到的原生質(zhì)體，得到原生質(zhì)體溶液(調(diào)整濃度為1×107個/mL)。(2)用實(shí)施例2得到的POX04420基因敲除盒DNA轉(zhuǎn)化ΔPoxKu70原生質(zhì)體(方法參照文獻(xiàn)：Churchill，A.C.L.，Ciuffetti，L.M.，Hansen，D.R.，VanEtten，H.D.，VanAlfen，N.K.TransformationofthefungalpathogenCryphonectriaparasiticawithavarietyofheterologousplasmids[J].CurrGenetics1990，17：25-31)，具體步驟如下：①將5μgPOX04420敲除盒DNA和5μL100mM亞精胺溶液混合后加入到100μL步驟(1)制備的原生質(zhì)體溶液中，混合均勻，冰上反應(yīng)30分鐘；②反應(yīng)結(jié)束后向溶液中加入1mLPTC溶液，混合均勻，室溫放置25分鐘；③向混合液中加入1mLSTC溶液混合均勻，將混合液加入到20mL預(yù)熱的再生培養(yǎng)基中，混合均勻，將上述混合液倒入到無菌培養(yǎng)皿中(按每個培養(yǎng)皿分別倒入2-5mL)，室溫放置1h，加入40mL含有G418(800μg/mL)與潮霉素(250μg/mL)的PDA培養(yǎng)基，覆蓋在再生培養(yǎng)基的表面，完全凝固后28℃倒置培養(yǎng)5天。④將步驟③的轉(zhuǎn)化雙層板的孢子用0.1％吐溫80溶液沖洗，放入到新的離心管中，用無菌水梯度稀釋孢子懸浮液，將每個稀釋梯度的孢子懸浮液涂在兩個含有G418(800μg/mL)與潮霉素(250μg/mL)的PDA平板上，28℃培養(yǎng)4天，挑選單菌落，隨機(jī)選取三個候選突變株(Δ2、Δ6和Δ8)，提取各候選突變株基因組DNA，采用引物POX04420-L-F和左交叉驗(yàn)證引物-R、右交叉驗(yàn)證引物-F和引物POX04420-R-R、引物POX04420-F和引物POX04420-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證。左交叉驗(yàn)證引物-R：5’-GCCCTGGGTTCGCAAAGATA-3’；右交叉驗(yàn)證引物-F：5’-AATAATGTCCTCGTTCCTGTCTGC-3’。POX04420-F：5’-TGCCCAAGTCATACAGTGAAACA-3’；POX04420-R：5’-CGGAGAATGCCTTGCCACA-3’。結(jié)果如圖3所示。圖3中，泳道M為1kbDNAMarker，泳道1為Δ2的鑒定結(jié)果，泳道2為Δ6的鑒定結(jié)果，泳道3為Δ8的鑒定結(jié)果，泳道4為突變體ΔPoxKu70對照，泳道5為ddH2O陰性對照。圖3A為用引物POX04420-F和引物POX04420-R擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物；圖3B為用引物POX04420-L-F和左交叉驗(yàn)證引物-R擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物；圖3C為用右交叉驗(yàn)證引物-F和引物POX04420-R-R擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，Δ2、Δ6和Δ8不能擴(kuò)增出POX04420基因片段，而突變體ΔPoxKu70可以擴(kuò)增出876bp的POX04420基因片段(圖3A)。同時，Δ2、Δ6和Δ8都擴(kuò)增出2226bp的左臂DNA片段(圖3B)和2862bp的右臂DNA片段(圖3C)，而突變體ΔPoxKu70沒有G418抗性基因的存在，不能擴(kuò)增出左臂和右臂基因片段(圖3B、圖3C)。上述結(jié)果表明菌株Δ2、Δ6和Δ8中POX04420基因已被敲除。⑤提取三個候選突變株(Δ2、Δ6和Δ8)和突變體ΔPoxKu70的基因組DNA，將基因組DNA用BamHI酶切后進(jìn)行Southern雜交分析，結(jié)果如圖4所示。圖4中，泳道M為1kbDNAMarker，泳道1為突變體ΔPoxKu70的對照，泳道2為Δ2的鑒定結(jié)果，泳道3為Δ6的鑒定結(jié)果，泳道4為Δ8的鑒定結(jié)果。結(jié)果表明，Δ2、Δ6和Δ8均得到大小為4886bp的雜交帶，突變體ΔPoxKu70得到5765bp的雜交帶，與預(yù)計(jì)結(jié)果一致，表明Δ2、Δ6和Δ8中POX04420基因已被敲除。以上結(jié)果表明，將POX04420基因敲除盒導(dǎo)入草酸青霉突變體ΔPoxKu70得到的三個轉(zhuǎn)化子(Δ2、Δ6和Δ8)均為POX04420基因被敲除的突變菌株，分別命名為ΔPOX04420-2、ΔPOX04420-6和ΔPOX04420-8。將敲除POX04420基因的該3個突變菌株均命名為突變株ΔPOX04420。實(shí)施例4、草酸青霉突變株ΔPOX04420在葡萄糖液體培養(yǎng)基中生物量的測定待測菌株為：ΔPOX04420-2和ΔPoxKu70。1、將待測菌株接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃靜置培養(yǎng)6天。2、完成步驟1后，用0.1％吐溫80溶液將PDA平板表面的孢子洗脫，得到孢子懸浮液(1×108個孢子/mL)。3、將1mL步驟2得到的孢子懸浮液接種至100mL葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)72小時。分別于培養(yǎng)的第12小時、第24小時、第36小時、第48小時、第60小時、第72小時收集培養(yǎng)體系中的所有菌絲體，50℃烘干至恒重，測定生物量(菌絲體干重)。結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，ΔPOX04420-2在葡萄糖液體培養(yǎng)基中的生物量與ΔPoxKu70菌株的生物量無顯著差異，表明菌株ΔPoxKu70中POX04420基因的敲除不影響草酸青霉的基本代謝，ΔPOX04420-2能利用葡萄糖正常生長。實(shí)施例5、草酸青霉突變株ΔPOX04420纖維素酶和木聚糖酶活力的測定待測菌株為：ΔPoxKu70、ΔPOX04420-2、ΔPOX04420-6和ΔPOX04420-8。1、將待測菌株接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃靜置培養(yǎng)6天。2、完成步驟1后，用0.1％吐溫80溶液將平板表面的孢子洗脫，得到孢子懸浮液(1×108個孢子/mL)。3、將1mL步驟2得到的孢子懸浮液接種至100mL葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)24小時，離心收集菌體，用無菌水洗滌2-3次。4、取步驟3得到的菌體(濕重為1g)，轉(zhuǎn)接到100mLAvicel液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)4天。分別于培養(yǎng)的第2天、第3天和第4天取樣，8000rpm離心10min，收集上清液，即為粗酶液。5、檢測步驟4得到的粗酶液的如下各項(xiàng)酶活：濾紙酶活力、羧甲基纖維素酶活力(CMC酶活力)、外切纖維素酶活力(pNPC酶活力)、β-葡萄糖苷酶活力(pNPG酶活力)和木聚糖酶活力。檢測方法參照文獻(xiàn)：Ghose，T.K.Measurementofcellulaseactivities[J].PureandAppliedChemistry1959，(59)：257-268；Gokhale，D.V.，Puntambekar，U.S.，Deobagkar，D.N.，Peberby，J.F.ProductionofcellulolyticenzymesbymutantsofAspergillusnigerNCIM1207[J].EnzymeMicrobialTechnol1988，10：442-445。6.提取步驟4得到的菌體中的胞內(nèi)蛋白。方法參照以下步驟：①將步驟4得到菌體放入預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮迅速研磨成粉末。②將步驟①得到的粉末轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加入15mL蛋白提取液，再加入5g直徑為0.25mm以及1g直徑為3mm的玻璃珠。③將步驟②的混合液在旋渦振蕩器上振蕩1min，再放置冰上30s。重復(fù)8-10次。④將步驟③得到的混合液在7000rpm，4℃，離心20min，收集上清液，即為菌體胞內(nèi)蛋白。胞內(nèi)蛋白濃度檢測方法參照文獻(xiàn)：Zor，T.，Selinger，Z.LinearizationoftheBradfordproteinassayincreaseitssensitivity：theoreticalandexperimentalstudies[J].AnalBiochem1996，236：302-308。草酸青霉菌株酶產(chǎn)量(U/g胞內(nèi)蛋白)＝酶活力(U)/胞內(nèi)蛋白(g)。結(jié)果如圖6-圖10所示。與ΔPoxKu70相比，三株突變株(ΔPOX04420-2、ΔPOX04420-6和ΔPOX04420-8)的濾紙酶產(chǎn)量、羧甲基纖維素酶產(chǎn)量、外切纖維素酶產(chǎn)量和木聚糖酶產(chǎn)量均顯著降低(圖6-圖9)，說明POX04420為菌株生產(chǎn)濾紙酶、羧甲基纖維素酶、外切纖維素酶和木聚糖酶的正調(diào)控蛋白；相反，與ΔPoxKu70相比，三株突變株β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量顯著升高(圖10)，說明POX04420為菌株生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的負(fù)調(diào)控蛋白。實(shí)施例6、POX04420基因的缺失對草酸青霉纖維素酶基因和其它已知調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平的影響待測菌株為：ΔPOX04420-2和ΔPoxKu70。1、將待測菌株接種于無菌PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)6天。2、用0.1％吐溫80溶液將PDA平板表面的孢子洗脫，得到孢子懸浮液并將濃度調(diào)整到1×108個/mL。3、將1mL步驟2得到的孢子懸浮液接種至100mL葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃、180rpm培養(yǎng)24小時，收集菌絲體；將菌絲體轉(zhuǎn)接至100mLAvicel液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，28℃、180rpm培養(yǎng)。分別收集、提取誘導(dǎo)培養(yǎng)第4小時、第12小時、第24小時、第48小時的待測菌株總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行定量RT-PCR檢測，檢測關(guān)鍵纖維素酶基因(2個CBH基因：POX05587和POX04786；7個EG基因：POX01166、POX02740、POX04173、POX05571、POX06147、POX06983和POX07535；3個BGL基因：POX06835、POX07963和POX08882)和木聚糖酶基因(3個XYN基因：POX05916、POX06783和POX08484)的表達(dá)情況。采用actin基因作為內(nèi)參基因。qRT-PCR檢測引物如下所示(5’→3’)：actin-F：CTCCATCCAGGCCGTTCTG；actin-R：CATGAGGTAGTCGGTCAAGTCAC；POX05587-F:GTACTTGCGATCCTGATGGG；POX05587-R:CCACGGTGAAGGGAGACTTG；POX04786-F:TACTACGCTTCCGAGGTTCAGAG；POX04786-R:GTGTCCAGCCAAACGAAGG；POX01166-F:CGATACTACGGCAACATCATCAC；POX01166-R:AGGCACCAGTCCACGAGTTT；POX07535-F:CGACTACTTGACCCAGCACCA；POX07535-R:CTAGTACACGCTCGCAGACCA；POX06983-F:GATCAACCACCAGGGTCTCAA；POX06983-R:CAAACAACAGCCACGGAGTAAG；POX06147-F:CACAATTACGCTCGCTGGAA；POX06147-R:GGCTCGTTCATCACACCAAA；POX02740-F:GTTCAGTTCCTGATGGAAAGATTG；POX02740-R:CATAACCGCCTGCTTGAGTG；POX04137-F:CGGCACTCTCGGCAAGGATTA；POX04137-R:CATCAGGAAGGGGACACGGAA；POX05571-F:AACCTGGAAGAACGGCACC；POX05571-R:CCTTGTCACAGTCATCGGAGC；POX06835-F:GTGCTGGATGGGAACAGGA；POX06835-R:TACGAACGCCGAGAGGAGA；POX07963-F:ATCTTTTATGTGCTCCTACAACCAG；POX07963-R:GCCAGTCACTCATCACGAACC；POX08882-F:TCCAGGAAGCCGAGAAGAACC；POX08882-R:AGCACCGATGACACGAACGC；POX08484-F:ACAAGCACACGCAGGTCAA；POX08484-R:CGCTGAAGTGGTTGGCAGT；POX06783-F:TGAGCCCAGGACCATCAACTT；POX06783-R:TACCCTTGCTTTTGCCGCC；POX05916-F:ATCGAGAATCAGGGCACAAAG；POX05916-R:ATCCGCCAACGAAGGTGT。結(jié)果如圖11所示，其中差異表達(dá)量表示的是突變株ΔPOX04420-2中纖維素酶基因或木聚糖酶基因的轉(zhuǎn)錄水平減去ΔPoxKu70中同樣基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，在Avicel誘導(dǎo)第4小時時，ΔPOX04420-2中1個EG基因(POX06983)和1個BGL基因(POX08882)的轉(zhuǎn)錄水平分別相對于ΔPoxKu70中該基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)82.22％和133.23％，2個XYN基因(POX08484和POX06783)和1個BGL基因(POX07963)的轉(zhuǎn)錄水平相對于ΔPoxKu70中這些基因的轉(zhuǎn)錄水平無顯著差異，其它大部分纖維素酶基因顯著下調(diào)，下調(diào)程度介于19.86％-96.69％之間。在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)第12小時、第24小時和第48小時時，ΔPOX04420-2中除了2個BGL基因(POX07963和POX08882)的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)外，幾乎所有纖維素酶基因與木聚糖酶基因均顯著下調(diào)，下調(diào)程度介于21.99％-99.31％之間。進(jìn)一步繼續(xù)檢測調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子PoxFlrD(無性繁殖調(diào)控因子)、PoxBrlA(無性繁殖調(diào)控因子)、PoxAmyR(淀粉酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子)和PoxClrB(纖維素酶基因調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子)的編碼基因的相對表達(dá)水平。采用actin基因作為內(nèi)參基因。qRT-PCR檢測引物如下所示(5’→3’)：PoxFlrD-F:AACACATGCACTATCGCTCTCC；PoxFlrD-R:CTTGCCCATCTCATTCACCA；PoxBrlA-F:CCAGTTGCCTGTTTCGTCAG；PoxBrlA-R:GGTAAGGGAATGTCGGGTGTT；PoxAmyR-F:CATCGTGGAGGAGGTGAGTG；PoxAmyR-R:CTGGCTTGGCTTGTTGGAG；PoxClrB-F:CTTCCAGGCGTCTCTCGTTC；PoxClrB-R:CGCTTGCTTCGTAAA。結(jié)果如圖12所示，其中差異表達(dá)量表示的是突變株ΔPOX04420-2中纖維素酶基因或木聚糖酶基因的轉(zhuǎn)錄水平減去ΔPoxKu70中同樣基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，在Avicel為誘導(dǎo)碳源的培養(yǎng)條件下，相比ΔPoxKu70，ΔPOX04420-2中，PoxAmyR在誘導(dǎo)第24小時和第48小時時轉(zhuǎn)錄水平分別下調(diào)37.05％和69.50％，在誘導(dǎo)第4小時時，其轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)107.23％。此外，在Avicel為誘導(dǎo)第24小時和第48小時時，PoxClrB的轉(zhuǎn)錄水平和ΔPoxKu70相比分別下調(diào)32.87％和83.47％，PoxFlrD和PoxBrlA的轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)，上調(diào)程度介于40.26％-2796.18％之間。以上結(jié)果表明，POX04420在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，對草酸青霉關(guān)鍵纖維素酶基因與木聚糖酶基因的表達(dá)，以及已知重要的纖維素酶基因和木聚糖酶基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的表達(dá)起關(guān)鍵調(diào)控作用。將上述實(shí)施例中的ΔPOX04420-2，又稱為草酸青霉(Penicilliumoxalicum)ΔPOXO4420，于2016年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；郵編：100101)，保藏編號為CGMCCNO.12967。<110>廣西大學(xué)<120>功能蛋白POX04420及其編碼基因與應(yīng)用<160>4<210>1<211>302<212>PRT<213>草酸青霉<400>1MetAspLeuAlaSerLeuIleHisGlyAlaAlaProValProLysSer151015TyrSerGluThrTyrGlyLysArgSerArgGlnAlaProLeuSerPro202530ProAlaGluGluArgProLysCysAlaLeuProSerIleSerSerLeu354045LeuGluGlyAlaAsnGluAlaGlnHisSerAlaLysArgGlnArgLeu505560SerSerProIleSerLysArgAspAlaArgTyrAspThrIleCysLeu65707580ProProThrProProLeuArgProGlySerGlySerGlySerArgHis859095GlySerAlaValHisSerProValGluMetSerSerProArgHisPro100105110SerProHisAlaHisArgSerSerValSerSerAsnGlySerSerIle115120125GlySerGlnSerHisHisAlaLeuProGlnAsnTyrSerHisGlyPro130135140TyrAlaSerProAlaProSerValSerSerThrSerSerHisSerSer145150155160TyrThrSerProValGluAlaThrHisProSerThrSerProLeuTyr165170175TyrSerArgProProProValIleAsnThrAsnThrProAlaSerThr180185190ProProAlaHisProValSerAlaGlnAsnAlaSerGlyLeuIleSer195200205ProValThrProAlaTrpProHisGlnHisHisHisTyrPheProPro210215220ThrSerAlaAlaProTyrGlnGlnAsnHisAspArgTyrIleCysArg225230235240ThrCysHisLysAlaPheSerArgProSerSerLeuArgIleHisSer245250255HisSerHisThrGlyGluLysProPheHisCysThrHisProGlyCys260265270GlyLysAlaPheSerValArgSerAsnMetLysArgHisGluArgGly275280285CysHisSerGlyArgProAlaAlaLeuGlnAlaMetValSer290295300<210>2<211>909<212>DNA<213>草酸青霉<400>2atggatttggccagcctgattcacggtgccgctccggtgcccaagtcatacagtgaaaca60tatggcaagcgatcacgacaagcacctctttcaccacctgccgaggaacgtccgaaatgc120gccttgccctccatctcatcattgctcgaaggagccaacgaagctcagcactcagccaaa180cggcaacgcctgagctccccgatctcaaagcgtgatgctcgctacgataccatctgtctg240cctcccactccacctctccggcctggttcaggctcgggctctcgccatggtagtgcggtc300cactcgcccgtggagatgagctctcccagacatccttcaccacatgcgcaccgctcgtcg360gtctccagcaacggcagctcgatcggctctcaatcacaccatgctctccctcaaaattac420tcgcatggtccctacgcatctcccgctcccagcgtctcttccacctcttctcactcctcc480tacacctcgcctgtagaagccacccacccttccacctcgccactttactactcgcgtcct540ccacctgtcatcaacacgaatactcccgcctccacaccacccgctcaccccgtcagcgcc600cagaatgcttcgggcttgatctcccccgtgactcctgcgtggcctcatcaacatcaccac660tacttccctcccaccagtgctgcgccttatcagcagaatcatgaccgatatatctgccgc720acctgtcacaaggccttctctcggccttccagcctgcgcatccactcccactcccacacc780ggcgagaagccattccactgcacacatcccggctgtggcaaggcattctccgtgcgcagc840aacatgaaacgccatgagcgaggctgccactcgggacgccctgcagctctgcaggccatg900gtctcttaa909<210>3<211>990<212>DNA<213>草酸青霉<400>3atggatttggccagcctgattcacggtgccgctccggtgcccaagtcatacagtgaaaca60tatggcaagcgatcacgacaagcacctctttcaccacctgccgaggaacgtccgaaatgc120gccttgccctccatctcatcattgctcgaaggagccaacgaagctcagcactcagccagt180gagtcctccttgttacacactctctaccccctcccattctcacctcgacttgagttctga240tcactgaccattcaaccagaacggcaacgcctgagctccccgatctcaaagcgtgatgct300cgctacgataccatctgtctgcctcccactccacctctccggcctggttcaggctcgggc360tctcgccatggtagtgcggtccactcgcccgtggagatgagctctcccagacatccttca420ccacatgcgcaccgctcgtcggtctccagcaacggcagctcgatcggctctcaatcacac480catgctctccctcaaaattactcgcatggtccctacgcatctcccgctcccagcgtctct540tccacctcttctcactcctcctacacctcgcctgtagaagccacccacccttccacctcg600ccactttactactcgcgtcctccacctgtcatcaacacgaatactcccgcctccacacca660cccgctcaccccgtcagcgcccagaatgcttcgggcttgatctcccccgtgactcctgcg720tggcctcatcaacatcaccactacttccctcccaccagtgctgcgccttatcagcagaat780catgaccgatatatctgccgcacctgtcacaaggccttctctcggccttccagcctgcgc840atccactcccactcccacaccggcgagaagccattccactgcacacatcccggctgtggc900aaggcattctccgtgcgcagcaacatgaaacgccatgagcgaggctgccactcgggacgc960cctgcagctctgcaggccatggtctcttaa990<210>4<211>5572<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4atacaaaccaaacgagaaagtgaaataaaaggaaaatacccaatgtggcccaccacccga60gagactgactcgaagtataataacgctcatggttgaaaccttccactccccagtagacca120ctaatcaaaataagctttgggccggactgtctcacctcagagttgagagcacattgcaag180tcaagtacgctcccgggcaagcagtcatcgatgtgaatgccctttctttttttttttgtt240actttttttttttttcgatttccgtttcattttgggagaagattatgcccttttgcttga300tttcagcctttgggacccttgtagaattgacgccggatggatcgctcgatcgaatgattg360aggtctggatgcactgctggacacccagctcatcagccggactggttctgagcctcgact420aggcagagatgggggaaccactcaatttttgaaaaacgctcgacccaaggtgtgcgagtt480gggagttggcccaagacgtatgtgctcttcctgtgagctgcgcagaaaagaccgcaatca540tgaccggtgtctcgaactatcacggagacatgtttgcacacagaatgtttcacgatccac600acaatgggactgctcggtaccgtcctggattcaacctaccggcaaagcgaagagaaaagg660gaaagatgagcgcgaaaggcatgaatcaaaggagtcgagtgggggagaaataaaaaaaag720aaatccagaatccccaaatcagctctccttcctataccagggctttgtcgaaaagcggag780gggggcttaaccggcatcgcccgcgggcgatcatccacgcgaaaacccagccatctgggc840atggacgagggagggcaatggtgcagtttggaacggtgacatggggtggaggggggggga900ggactaaccaagctgtgagcacagagccctgactatcgtatcaataatcatttaatcatc960aaatggaattgggggcgatactttggaaaatgatcaaaaaggataaaaaatcaaaatatt1020ctgtcctttttttttcgttgagataggggtgggggggggggaagaggaggaaatgggtat1080agaaaaaatcgaattaatggaaattccggaaagaatcattatgaaataataccacaagac1140tggaagaagtggatcacggaggtggacgtggacgtggacgtggatgtggtggaagtggat1200acgctggtggccactgatgctcggcgggtgggttgtccctggttctgggaccgaccgtag1260tcgcctcagatcgtctggagtcgcttccactctggcgcctcccccggtggacgatgaaga1320atgtataaaccccctcgtgtctccccctcatgtgcgttcatgtggaaattcgtcgatttc1380aaactccttttcatcccaccttccacctctcacaactctccccttcccacaccttatcgg1440tcgtgactaaatctcacgtcccaattgtatcactcgacgacactgattccacacaattca1500acgatcccaacggacgaagcatctagtccgacatctagaaagaaggattacctctaaaca1560agtgtacctgtgcattctgggtaaacgactcataggagagttgtaaaaaagtttcggccg1620gcgtattgggtgttacggagcattcactaggcaaccatggttactattgtataccatctt1680agtaggaatgatttcgaggtttatacctacgatgaatgtgtgtcctgtaggcttgagagt1740tcaaggaagaaacatgcaattatctttgcgaacccagggctggtgacggaattttcatag1800tcaagctatcagagtaaagaagaggagcatgtcaaagtacaattagagacaaatatatag1860tcgcgtggagccaagagcggattcctcagtctcgtaggtctcttgacgaccgttgatctg1920cttgatctcgtctcccgaaaatgaaaatagctctgctaagctattcttctcttcgccgga1980gcctgaaggcgttactaggttgcagtcaatgcattaatgcattgcagatgagctgtatct2040ggaagaggtaaacccgaaaacgcgttttattcttgttgacatggagctattaaatcacta2100gaaggcactctttgctgcttggacaaatgaacgtatcttatcgagatcctgaacaccatt2160tgtctcaactccggagctgacatcgacaccaacgatcttatatccagattcgtcaagctg2220tttgatgatttcagtaacgttaagtggatggatccatctactctagaagaactcgtcaag2280aaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcacgaggaa2340gcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtc2400ctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccatt2460ttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcctcgccgtc2520gggcatgcgcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttc2580gtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcg2640atgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcat2700tgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtgagatgacaggagatcctg2760ccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgacaacgtcgagcac2820agctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcctgcag2880ttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctga2940cagccggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaa3000tagcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatcatatc3060gatgcttcggtagaataggtaagtcagattgaatctgaaataaagggaggaagggcgaac3120ttaagaaggtatgaccgggtcgttcacttaccttgcttgacaaacgcacaagttatcgtg3180caccaagcagcagatgataataatgtcctcgttcctgtctgctaataagagtcacacttc3240gagcgccgccgctactgcttacaagtgggctgatctgaccagttgcctaaatgaaccatc3300ttgtcaaacgacacaaattttgtgatccgcctggacgactaaaccaaaatagcattgatg3360tgttgacctccactagctccagccaagcccaaaaatgctccttcaatatcatcttctgtc3420gacgacaacaaaaaacccccttcaaaaaaaaacacaaaccattctcatcacaggaaatgt3480tatgtattgaacggatctcttttgtcatctttttccttttttttccctttctcctttttc3540tggtcagacctgggcttgctttgccaactcggtggatgctgatggcattttggttacctt3600gataccctgaatatgtacgattttttgtggctttgcactttcttttgttcattattatgc3660ctttcccccccatgccgggggaacctggcggtggatatatttagatcggccgtgcaagcc3720acgcaaagagacttgaatataacgaaataacggactctgatcaattttttttcttcacca3780gtaattaactaaatagatcattaaccttttgcactgtatgtctgatgggtccatcctatt3840cagccagtttatgatgccccttccaggtgagtggtcccgccccagtcgccatcacctatg3900atatcgtcgaccatatcactgctctgtttaactgttctggagaatcccatcgatctctcg3960aggagtacaaggttttgaattgaattcaatcggtctctgggtgaagacaaaaaaggagcc4020agaaccttggatccagacggtcgtcgactggataagctaaattccgccttcagcatacct4080ggctcgccctcagttcaatcttcgcgaatcaacaaatgtacgaattgatttttcattccc4140tagatttttgggggaaaaaaattgggtgtaccgacacccgcatcatctcgatagattcga4200agatcaaaaaaaagtcaagtgtcttttgactttctctcgagcgaagcgaaacttgaaacg4260ttttgtctaccgatatttgactttacccgtaccaacatcgactcctgtggatcgaaacca4320cgatccgcgagcttgcctatgggaaccttcgtgaagattcccaaagataagtcttgagca4380tgccccgaccacaacagagagccaggcgtatgttttgtttttctgaaggggggccttttg4440acttggaaaaattgtcgagtcgccggcatctttctccatattacgatgtcgtttgtacag4500cgcccatgcttattccaagaatcatcaaagagctccatactcgattaagttcccaatgtc4560ttaaaaagaaccacacacacacacactctctctctcggaaaaatctcggaaaaattgcaa4620tctctctgaactcctcctgtcgctccaaaactggagggatcaggtctaaccaagttacta4680gatttggaagctggtgatctatcgatgaaattgctacagtgcagcacacgtacattgatg4740atcctgtgtttcaatggacgtgctgtatgtcaggtgcccgtcccacttcagacaagttcg4800agttcgagcccgagacccagttctccgaggaggggagatcacacgggttccacactccgt4860tcttttttttagggggggggggttccttttctttttgtgggggcttgagaaaatcacttg4920tatgggattggggcttgagagaatcacttgtatgggattggggctgatcaaatcaagatg4980gatgggacacagggcgcgcgatctgcaaaattgatgtgcacacacaaccgagtcgatgat5040agatggaatatagaattgattgtaggtgtaatatttgaacttcatctcagtatatgtatg5100gagttcataagtacccgaatacaaggttggaagtatgtaccgccctctaaaagtcggagg5160aggcggcttggaacggaagcaccttctattttcgtattgacatcaacgatccctgcgttg5220gcttacaacggggagctttggaattaaatttggatgagaacgacatagatgtgctcctgc5280tccacatcagagttcgtctcggttcaagctacctgtacatgaattcagtagaatggctct5340tgtatcgtacacgcagtgtgcacggtttgtacgtatttatctggggtgttacagtgtaca5400gtgtgctcaagttggattgccgaggcaatttgattgatggagaaataaaaaatgggctga5460cgcttgacgatcttccagtttggtaaatcctggtctccacatgaagattcgaaacgaacc5520actgtgacaatgttttcaacgggagagtttcatcgcaagtggaacgaggacg5572當(dāng)前第1頁1 2 3