本發(fā)明涉及一種雞細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白的原核表達(dá)及純化方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白（Extracellular Fatty Acid-Binding Protein，Ex-FABP），是一個在軟骨細(xì)胞分化后期，由軟骨細(xì)胞合成和大量分泌的具有明顯的低分子量為21 kDa蛋白，最初稱為ch21，也被描述為一個與雞胚成纖維細(xì)胞的細(xì)胞基質(zhì)相關(guān)的20K轉(zhuǎn)化敏感蛋白，屬于軟骨相關(guān)蛋白超家族。Ex-FABP參與炎癥性疾病，能夠隨著炎性因子增加而表達(dá)量上升和隨著抗炎性因子增加而表達(dá)量下降。在雞胚肝臟受到炎性因子如脂多糖（LPS）刺激后Ex-FABP表達(dá)增強，抗炎劑處理后表達(dá)量降低。而且，在正常情況下，成年成熟關(guān)節(jié)軟骨Ex-FABP不表達(dá)，但是在骨性關(guān)節(jié)炎、癌癥患者以及軟骨發(fā)育不良的病變區(qū)域的軟骨細(xì)胞中卻能夠表達(dá)該蛋白。最近研究發(fā)現(xiàn)，Ex-FABP基因在馬立克病雞發(fā)病不同階段紅細(xì)胞中的表達(dá)與正常對照雞相比存在顯著差異，推測其作為標(biāo)識物在傳染病診斷和防治中具有重要意義。

Ex-FABP是一種急性期蛋白，在不同的細(xì)胞應(yīng)激條件下均能激活該蛋白的表達(dá)。應(yīng)激條件可以是生理性（軟骨細(xì)胞分化為肥大的階段和隨后具有大量的細(xì)胞外基質(zhì)重塑的骨形成過程，成肌細(xì)胞融合和肌纖維形成），也可以是病理性（退化性疾病、腫瘤）。Ex-FABP是脂肪酸結(jié)合蛋白超家族的一個成員，能夠結(jié)合、運輸疏水性小分子。Ex-FABP能夠特異性的結(jié)合脂肪酸并分泌到細(xì)胞外基質(zhì)，具有高度親和性。脛骨軟骨發(fā)育不良（Tibial Dyschondroplasia，TD）是以軟骨內(nèi)骨化過程中通過從生長板伸入干骺端未礦化和無血管化為特征的軟骨疾病。TD發(fā)生時，可以觀察到在病變區(qū)域缺乏增殖細(xì)胞。由于骨骼前肥大軟骨細(xì)胞的積累而不能完全分化為肥大階段，破壞了生長板在明顯區(qū)域的有序分離。Ex-FABP在TD大小病變區(qū)域中均表達(dá)上調(diào)，并且在大病變區(qū)域存在顯著差異。在病理切片中，可以清楚地看到前肥大軟骨細(xì)胞區(qū)域與對照組織相比，Ex-FABP表達(dá)量增加，即前肥大軟骨細(xì)胞中大量表達(dá)Ex-FABP。在對照組切片中，Ex-FABP強染色主要出現(xiàn)在肥大軟骨細(xì)胞，而在前肥大軟骨細(xì)胞不存在染色陽性部分。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種雞細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白Ex-FABP的原核表達(dá)及純化方法，該方法利用RT-PCR技術(shù)從雞脛骨軟骨生長板組織或雞紅細(xì)胞中擴增出編碼Ex-FABP的DNA片段，將次目的基因克隆至pET-28a原核表達(dá)載體上，并利用親和層析進(jìn)一步純化出高濃度的蛋白，為研發(fā)針對該蛋白的檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

一種雞細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

一種雞細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

上述雞細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白的原核表達(dá)及純化方法，步驟為：

提取雞脛骨生長板組織或雞紅細(xì)胞的總RNA，以O(shè)ligo dT為引物合成cDNA，并以此為模板，設(shè)計一對上、下游引物進(jìn)行PCR擴增，與pGEM-T Easy載體連接，得到pGEM-T-Ex-FABP重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，然后經(jīng)過異丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，通過Ni-NTA親和層析柱純化；

其中所述上游引物：5’-CGGAATTCGCGGCCACAGTGCCGGACA-3’，

下游引物：5’-AGCTCTCGAGCTACACTTCATCAACGCTGCATTCC-3’，

在上游引物5’端引入EcoRⅠ酶切位點，在下游引物5’端引入XhoⅠ酶切位點。

所述的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞為E. coli DH5α或E. coli BL21(DE3)。

本發(fā)明引物合成根據(jù)GenBank中已知雞Ex-FABP的基因序列（AF121346.1），利用Primer 5.0軟件設(shè)計針對Ex-FABP基因的引物對，上游引物：5’-CGGAATTCGCGGCCACAGTGCCGGACA-3’，下游引物：5’-AGCTCTCGAGCTACACTTCATCAACGCTGCATTCC-3’，在上游引物5’端引入EcoRⅠ酶切位點，在下游引物5’端引入XhoⅠ酶切位點，由上海捷瑞生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成；預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為495bp；提取雞脛骨生長板組織，添加液氮并用力研磨直至成粉末狀，Trizol法提取雞脛骨生長板組織或雞紅細(xì)胞的總RNA，以O(shè)ligo dT為引物合成cDNA，并以此為模板，用合成的引物對進(jìn)行PCR擴增，PCR條件為95℃預(yù)變性3 min，98℃變性10 sec，54℃退火5 sec，72℃延伸1 min，擴增30個循環(huán)，最后72℃終延伸5 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果；將上述PCR擴增用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，與pGEM-T Easy載體連接，得到pGEM-T-Ex-FABP重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（E. coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞，測序正確的重組質(zhì)粒pGEM-T-Ex-FABP經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，所釋放的Ex-FABP基因片段與經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pET28a連接，獲得pET-28a-Ex-FABP重組表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，命名為pET-28a-Ex-FABP-BL21，于含100 mg/L卡那霉素抗性的固體LB培養(yǎng)基上挑取單個菌落，用PCR和酶切鑒定；挑取經(jīng)鑒定確證的單菌落，接種于含100 mg/L卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜，再按1:100的比例接種于含100 mg/L卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.5~0.8；加濃度為1.0mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，于誘導(dǎo)后1h、3h及5h分別收集菌液，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5min，取10μl進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，并用轉(zhuǎn)空載體pET28a的BL21菌液作為對照；將pET-28a-Ex-FABP-BL21菌液于37℃振搖培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.5~0.8，在30℃、1.0mmol/L的IPTG條件下振搖培養(yǎng)21h，誘導(dǎo)培養(yǎng)物再經(jīng)4℃、12000 rpm離心10min，收獲pET-28a-Ex-FABP-BL21菌體沉淀；用含50mmol/L的NaH2PO4、500mmol/L的NaCl、1.0g/L的溶菌酶、1mmol/L的PMSF，pH8.0的細(xì)菌裂解液20ml重懸菌體，冰上放置20min，超聲裂解后，4℃、12000rpm離心10min，收集上清并用0.45μm孔徑濾膜過濾，于上清中加入咪唑至終濃度為20mmol/L后，過Ni-NTA親和層析柱，用含有10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L和40mmol/L咪唑的20 mmol/L的NaH2PO4、500mmol/L的NaCl，pH7.4的洗脫緩沖液洗脫雜質(zhì)，最后用500mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白效果較好，SDS-PAGE鑒定洗脫目的蛋白的純度。

本發(fā)明應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴增獲得了編碼Ex-FABP的cDNA序列，并克隆進(jìn)pET-28a表達(dá)載體中，誘導(dǎo)后振蕩培養(yǎng)，利用蛋白親和層析柱純化重組蛋白，并最終獲得了較高純度的重組蛋白。結(jié)果顯示目標(biāo)蛋白在E. coli中獲得了高效表達(dá)，Ex-FABP重組蛋白的高效表達(dá)和純化為進(jìn)一步制備其單克隆抗體，建立Ex-FABP快速檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為Ex-FABP的原核表達(dá)及純化路線圖；

圖2為Ex-FABP基因的RT-PCR擴增結(jié)果；

圖3為pGEM-T-Ex-FABP重組克隆質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果，其中1：Marker；2、3：EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物；

圖4為Ex-FABP蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最適溫度摸索結(jié)果，其中1：Marker；2-4：IPTG誘導(dǎo)溫度分別為25℃、30℃和37℃；

圖5為Ex-FABP蛋白表達(dá)形式鑒定結(jié)果，其中1：蛋白Marker；2：上清；3：沉淀；

圖6為Ex-FABP蛋白純化結(jié)果，其中1：30 mM咪唑；2：100 mM咪唑；3：500 mM咪唑；

圖7為Ex-FABP蛋白的Western Blot檢測結(jié)果，用His標(biāo)簽抗體對純化蛋白進(jìn)行檢測。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步詳細(xì)地說明。

本發(fā)明所用的限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自大連寶生物工程公司，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，DNA基因提取試劑盒，DNA回收試劑盒購自北京天根生化科技公司，親和層析柱購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，T4 DNA連接酶、pGEM-T Easy載體和pET28a載體Promega公司，其他所用化學(xué)試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

實施例1雞細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白（Ex-FABP）的原核表達(dá)及純化方法，流程如圖1所示，步驟為：

1．引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中已知雞Ex-FABP的基因序列（AF121346.1），利用Primer 5.0軟件設(shè)計針對Ex-FABP基因的引物對，在上游引物5’端引入EcoRⅠ酶切位點，在下游引物5’端引入XhoⅠ酶切位點；

正、反向引物由上海捷瑞生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成，其中，正、反向引物序列如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示，具體如下：

正向引物：5’-CGGAATTCGCGGCCACAGTGCCGGACA-3’；

反向引物：5’-AGCTCTCGAGCTACACTTCATCAACGCTGCATTCC-3’。

2．目的基因的擴增

提取雞脛骨生長板組織，添加液氮并用力研磨直至成粉末狀，Trizol法提取雞脛骨生長板組織或雞紅細(xì)胞的總RNA，以O(shè)ligo dT為引物合成cDNA，并以此為模板；

RT反應(yīng)程序如下：42℃、30min，99℃、5min，5℃、5min；

RT反應(yīng)體系如下：

Rnase Free dH₂O 3.75μL

MgCl₂（25mM） 2μL

10×RT Buffer 1μL

dNTP Mixture（10mM） 1μL

Oligo dT-Adaptor Primer 0.5μL

AMV Reverse Transcripase XL 0.5μL

RNase Inhibitor 0.25μL

RNA 1μL

總體積 10μL

PCR反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3 min；98℃變性10 sec，54℃退火5 sec，72℃延伸1 min，擴增30個循環(huán)；最后72℃終延伸5 min；

PCR反應(yīng)體系如下：

ddH2O 11.8 μL

5×Buffer 4 μL

dNTP 1.6 μL

上游引物 0.4 μL

下游引物 0.4 μL

HS DNA Polymerase 0.2 μL

cDNA 1.6 μL

總體積 20 μL。

3．PCR產(chǎn)物的回收及連接反應(yīng)

用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，電泳結(jié)束，將凝膠置于紫外分析儀內(nèi)，切取含PCR產(chǎn)物的膠塊，用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，在無菌的EP管中加入：3μL回收產(chǎn)物，1μL的pGEM-T Easy載體，1μL的T4 DNA連接酶，5μL的T4 DNA連接酶Buffer，總體積為10μL。將各組分混勻，22℃連接過夜，得到DNA連接產(chǎn)物。

4．E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備

挑取E. coli DH5α單菌落到5mL的液體LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)過夜，取1mL培養(yǎng)過夜的菌液到含有50mL的液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)到OD₆₀₀值為0.5~0.8之間，將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)移到50mL的離心管中，冰浴15min，4℃、12000rpm條件下離心10min，用2mL預(yù)冷的0.1M CaCl₂溶液重懸沉淀，4℃、12000rpm條件下再次離心10min，再用2mL預(yù)冷的0.1M CaCl₂溶液重懸沉淀，按每管100μL分裝細(xì)胞重懸液與無菌EP管中，于-80℃中保存。

5．連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞

在100μL的E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中加入10μL的DNA連接產(chǎn)物，混合均勻，冰上放置30min，42℃水浴熱激處理90sec，冰上放置5min，再加入400μL的液體LB培養(yǎng)基，混合均勻后，37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)45min，400rpm離心5min，吸棄多余LB培養(yǎng)基，剩余100μL液體LB培養(yǎng)基重懸沉淀，然后把菌液涂布于含100μg/mL卡那霉素抗性固體瓊脂培養(yǎng)基上，用玻璃棒涂抹均勻，放置在37℃溫箱中倒置孵育12h。

6．質(zhì)粒的小量提取及雙酶切鑒定

挑取瓊脂培養(yǎng)就平板上生長的單一菌落，接種于4mL含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)過夜，在2mL EP管中收集2mL菌液，12000rpm離心，去上清，加入250μL預(yù)冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，10mmol/L EDTA(pH 8.0)），重懸菌液；加入250μL的溶液Ⅱ（0.2mol/L NaOH，1% SDS），迅速顛倒混勻4-5次至溶液呈透明粘稠狀；再加入300μL的溶液Ⅱ（5mol/L KAc 60mL，冰醋酸 11.5mL，H₂O 28.5mL），顛倒混勻4-5次至溶液中白色絮狀沉淀呈均勻分散狀，靜置5min，12000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），混合均勻，12000rpm離心10min，取上清至新EP管中，加入2倍體積的無水乙醇，混合均勻，靜置10min，棄去上清，室溫靜置15min，待管壁上殘余的無水乙醇揮發(fā)完全，用50μL的TE洗脫液（pH 8.0，含20μg/mL Dnase-free Rnase A）溶解DNA沉淀，與-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

取少量質(zhì)粒用EcoRⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系如下：

ddH₂0 12μL

10×Buffer 2μL

限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ 1μL

限制性內(nèi)切酶XhoⅠ 1μL

質(zhì)粒DNA 4μL

總體積 20μL

將反應(yīng)液混合均勻，放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育12 h。經(jīng)8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒送公司進(jìn)行測序分析鑒定。

7．表達(dá)質(zhì)粒的重組構(gòu)建

待測序結(jié)果正確后，用EcoRⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶同時對pGEM-T-Ex-FABP和pET28a空載體進(jìn)行雙酶切，把得到的Ex-FABP基因片段和線性pET28a載體進(jìn)行連接：3μL Ex-FABP基因片段，1μL的pET28a載體，1μL的T4 DNA連接酶，5μL的T4 DNA連接酶Buffer，總體積為10μL；將各組分混勻，22℃連接過夜，得到DNA連接產(chǎn)物pET28a-Ex-FABP，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，過程如步驟5，質(zhì)粒的小量提取及雙酶切鑒定過程如步驟6，雙酶切鑒定結(jié)果如圖3所示。

8．重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)

將轉(zhuǎn)化表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Ex-FABP的重組菌接種于5mL液體LB培養(yǎng)基（含100μg/mL卡那霉素）中，分別在25℃、30℃和37℃條件下振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀值在0.5~0.8之間，加入1.0mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3-4h，取適量菌液離心集菌后進(jìn)行SDS-PAGE分析Ex-FABP蛋白的表達(dá)情況，取培養(yǎng)好的菌液1mL，12000rpm離心1min集菌，棄上清，100μL ddH₂O重懸沉淀，取25μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸10min，取20μL進(jìn)行SDS-PAGE分析，電壓：80V，30min；120V，90min，然后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色、脫色，重組蛋白載30℃的表達(dá)量最高，如圖4所示。

9．重組蛋白的Ni-NTA親和層析純化

將重組菌接種于50mL液體LB培養(yǎng)基（含100μg/mL卡那霉素）中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀值在0.5~0.8之間，加入1.0mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3-4h，收集菌體后冰浴10min，用超聲破碎，4℃、12000rpm離心10min，收集上清和沉淀，用SDS-PAGE分析確定蛋白表達(dá)位置，結(jié)果顯示Ex-FABP大部分都表達(dá)在上清中如圖5所示，剩余上清用于蛋白純化，純化結(jié)果如圖6所示，最后用His標(biāo)簽抗體對純化的蛋白進(jìn)行Western Blot檢測如圖7所示；

蛋白純化用Buffer：超聲破碎Buffer（Binding Buffer）：20mM Tris-HCl pH 7.9、0.5M NaCl、10%甘油；洗雜液為20mM Tris-HCl pH 7.9、0.5M NaCl、10%甘油、10 mM/20 mM/30 mM/40 mM咪唑；洗脫液為20mM Tris-HCl pH 7.9、0.5M NaCl、10%甘油、30mM/100mM/500 mM咪唑；

具體純化過程如下：

①裝柱及平衡柱：向?qū)游鲋鶅?nèi)加入75%酒精，檢驗柱子是否漏液，然后進(jìn)行裝柱，約10 mL Ni瓊脂糖，靜置30 min，將上層液體吸出，用10倍柱體積的binding buffer平衡層析柱，使柱的PH值為8.0；

②Binding Buffer與超聲破碎后的樣品以1﹕1的比例混勻后過柱，使樣品沉降，收集流穿液；

③用10倍柱體積預(yù)冷的不同濃度的洗雜液（分別含10 mM，20 mM，30 mM，40 mM咪唑）過柱，收集洗雜液；

④用10倍柱體積預(yù)冷的洗脫液（咪唑的含量分別為含30mM、100mM和500 mM）流速為10倍柱體積/h洗脫目的蛋白，分管收集，作好記錄；

⑤收集完畢后先用10倍柱體積的無菌ddH₂O洗滌，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡，將收集的流穿液每管吸出20 μL另存，以便SDS-PAGE蛋白電泳進(jìn)行結(jié)果分析，剩余的置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

附：本發(fā)明所涉及的DNA核苷酸序列和蛋白質(zhì)氨基酸序列如下：

SEQUENCE LISTING ID No.1

gcggccacag tgccggacag gagcgaggtt gcagggaaat ggtatattgt tgctctggcc 60

tccaacaccg acttcttcct gcgtgagaag ggcaagatga agatggtaat ggccagaatc 120

tctttcctag gagaggatga gctggaggtc tcctatgctg cccccagccc aaaggggtgc 180

agaaaatggg agacaacctt caagaagacc agtgatgatg gtgaactcta ctactcagag 240

gaagccgaga aaacggtgga ggtgctggac acggactaca agagctatgc agtgatcttt 300

gcaaccaggg tgaaggatgg gaggaccttg cacatgatga gactctacag cagaagccgt 360

gaggtgagcc ccacagccat ggcaatcttc aggaagcttg ctagggagcg gaactacacg 420

gatgagatgg tcgccgtgct gcccagccag gaggaatgca gcgttgatga agtgtag 477

SEQUENCE LISTING ID No.2

Ala Ala Thr Val Pro Asp Arg Ser Glu Val Ala Gly Lys Trp Tyr Ile Val Ala Leu Ala

5 10 15 20

Ser Asn Thr Asp Phe Phe Leu Arg Glu Lys Gly Lys Met Lys Met Val Met Ala Arg Ile

25 30 35 40

Ser Phe Leu Gly Glu Asp Glu Leu Glu Val Ser Tyr Ala Ala Pro Ser Pro Lys Gly Cys

45 50 55 60

Arg Lys Trp Glu Thr Thr Phe Lys Lys Thr Ser Asp Asp Gly Glu Leu Tyr Tyr Ser Glu

65 70 75 80

Glu Ala Glu Lys Thr Val Glu Val Leu Asp Thr Asp Tyr Lys Ser Tyr Ala Val Ile Phe

85 90 95 100

Ala Thr Arg Val Lys Asp Gly Arg Thr Leu His Met Met Arg Leu Tyr Ser Arg Ser Arg

105 110 115 120

Glu Val Ser Pro Thr Ala Met Ala Ile Phe Arg Lys Leu Ala Arg Glu Arg Asn Tyr Thr

125 130 135 140

Asp Glu Met Val Ala Val Leu Pro Ser Gln Glu Glu Cys Ser Val Asp Glu Val ***

145 150 155 158

SEQUENCE LISTING ID No.1

gcggccacag tgccggacag gagcgaggtt gcagggaaat ggtatattgt tgctctggcc 60

tccaacaccg acttcttcct gcgtgagaag ggcaagatga agatggtaat ggccagaatc 120

tctttcctag gagaggatga gctggaggtc tcctatgctg cccccagccc aaaggggtgc 180

agaaaatggg agacaacctt caagaagacc agtgatgatg gtgaactcta ctactcagag 240

gaagccgaga aaacggtgga ggtgctggac acggactaca agagctatgc agtgatcttt 300

gcaaccaggg tgaaggatgg gaggaccttg cacatgatga gactctacag cagaagccgt 360

gaggtgagcc ccacagccat ggcaatcttc aggaagcttg ctagggagcg gaactacacg 420

gatgagatgg tcgccgtgct gcccagccag gaggaatgca gcgttgatga agtgtag 477

SEQUENCE LISTING ID No.2

Ala Ala Thr Val Pro Asp Arg Ser Glu Val Ala Gly Lys Trp Tyr Ile Val Ala Leu Ala

5 10 15 20

Ser Asn Thr Asp Phe Phe Leu Arg Glu Lys Gly Lys Met Lys Met Val Met Ala Arg Ile

25 30 35 40

Ser Phe Leu Gly Glu Asp Glu Leu Glu Val Ser Tyr Ala Ala Pro Ser Pro Lys Gly Cys

45 50 55 60

Arg Lys Trp Glu Thr Thr Phe Lys Lys Thr Ser Asp Asp Gly Glu Leu Tyr Tyr Ser Glu

65 70 75 80

Glu Ala Glu Lys Thr Val Glu Val Leu Asp Thr Asp Tyr Lys Ser Tyr Ala Val Ile Phe

85 90 95 100

Ala Thr Arg Val Lys Asp Gly Arg Thr Leu His Met Met Arg Leu Tyr Ser Arg Ser Arg

105 110 115 120

Glu Val Ser Pro Thr Ala Met Ala Ile Phe Arg Lys Leu Ala Arg Glu Arg Asn Tyr Thr

125 130 135 140

Asp Glu Met Val Ala Val Leu Pro Ser Gln Glu Glu Cys Ser Val Asp Glu Val ***

145 150 155 158