專利名稱：煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及昆蟲基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白(Helicoverpa assulta Fatty Acid Binding Protein，縮寫為Hass-FABP)基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1972年Ockneir等在研究大鼠小腸脂肪酸吸收的調(diào)節(jié)時(shí)，在腸粘膜上發(fā)現(xiàn)了脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP)，后來發(fā)現(xiàn)這種蛋白廣泛存在于動(dòng)物的心肌、小腸、肝臟、脂肪組織、腦和表皮中，已發(fā)現(xiàn)的FABP包括心肌型(H-FABP)等9種。FABP大約由126-134個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量大約為11-16kDa。FABP的主要功能是參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸及其他一些疏水配基的運(yùn)輸，可將脂肪酸(優(yōu)先結(jié)合長(zhǎng)鏈脂肪酸)運(yùn)輸?shù)溅卵趸?、甘油三酯或磷酸合成的位點(diǎn)，促進(jìn)細(xì)胞合成脂肪酸，并在代謝內(nèi)環(huán)境中起重要作用。近年來，已用大量的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)FABP的轉(zhuǎn)運(yùn)功能進(jìn)行了研究。這些方法包括分子水平的體內(nèi)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)模型；對(duì)脂肪酸的攝取和由基因控制的FABP不同種類、數(shù)量體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的研究；同時(shí)對(duì)缺乏特異FABP表達(dá)的動(dòng)物組織細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。已經(jīng)清楚知道FABP周圍包圍了大量的相關(guān)蛋白，一些除脂肪酸外，還結(jié)合了疏水的配體。近來，對(duì)FABP的組織分布，配體親和力和特異性，以及其結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行了集中研究，結(jié)果均表明FABP參與細(xì)胞脂質(zhì)代謝。目前，脂肪酸結(jié)合蛋白的研究主要在高等動(dòng)物中進(jìn)行，而對(duì)昆蟲研究較少，已報(bào)道的僅有煙草天蛾(Manduca sexta)、果蠅(Drosophila melanogaster)、家蠶(Bombyxmori)和美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea)等，研究表明FABP基因在昆蟲中存在一定的同源性。
煙夜蛾(Helicoverpa assulta)又名煙草夜蛾、煙青蟲、煙實(shí)夜蛾，是一種世界性的煙草害蟲。該蟲具有分布廣、食性較雜、繁殖力較強(qiáng)和兼性滯育等特點(diǎn)。在我國(guó)除西藏外，各省、市區(qū)均有發(fā)生，以危害煙草及辣椒最重。國(guó)內(nèi)各煙區(qū)均有分布，其中以黃淮煙區(qū)、華中煙區(qū)、西南煙區(qū)的云南、貴州和四川等地?zé)煵荩l(fā)生世代多、發(fā)生量較大。由于使用化學(xué)防治方法引起的環(huán)境壓力以及害蟲產(chǎn)生的抗藥性等問題，利用其他方法控制此蟲已成為當(dāng)前防治的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因及其編碼的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因的全長(zhǎng)cDNA序列，具有如下所示的399bp的核苷酸序列1 atggcattct ttggcaagga atacaagttt gagaagcagg agaactttga ggatttcgtc61 aatgctttgg gcctcactcc cgagcagact caaggctacc tcgcctacac accgaccctc121 aagttcacgc aagatggtga ctcgtacacc gtgatcacca tcacgcccaa gactaaaagt181 gaagtcacct tcaagtctgg agtcgagttc gatgataaca atgctaaccg acactgcaag241 accacgtaca ccgttgccgg cgacaccatc acccaggtgc agaagtacga tgacggcaac301 agcctgacca tcaccaggaa gttctctggc aacgagatgg ttgtgactct ggcaaccagc361 aaatgggacg gagttgctcg cagatactac aaggcctaa煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因編碼的蛋白，編碼長(zhǎng)為132個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列為1 M A F F G K E Y K F E K Q E N F E D F V21 N A L G L T P E Q T Q G Y L A Y T P T L41 K F T Q D G D S Y T V I T I T P K T K S61 E V T F K S G V E F D D N N A N R H C K81 T T Y T V A G D T I T Q V Q K Y D D G N101 S L T I T R K F S G N E M V V T L A T S121 K W D G V A R R Y Y K A *煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因在對(duì)煙夜蛾及其他鱗翅目害蟲防治中的應(yīng)用。
煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因在煙夜蛾基因芯片中的應(yīng)用。
煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因在合成新的脂肪酸結(jié)合蛋白基因中的應(yīng)用。
利用煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因在獲得抗煙夜蛾及其他鱗翅目害蟲轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
獲得煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因的克隆過程包括如下步驟
(1)總RNA提取(2)引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)并合成的引物序列如下正向引物5’-GGATCCATGGCATTCTTTGGCAAG-3’反向引物5’-CTCGAGTTAGGCCTTGTAGTATCTG-3’。
(3)RT-PCR擴(kuò)增(4)PCR產(chǎn)物的克隆和鑒定(5)序列測(cè)定和分析。
本發(fā)明的積極有益效果(1)提供了一種煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因及其編碼的蛋白質(zhì)。
(2)對(duì)煙夜蛾及其他鱗翅目害蟲防治的應(yīng)用脂肪酸結(jié)合蛋白的主要作用是對(duì)脂肪酸及其衍生物的攝取、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化、脂化或合成等一系列脂肪代謝中發(fā)揮作用。利用Hass-FABP基因?qū)Φ鞍椎恼{(diào)控，控制蟲體內(nèi)脂肪酸的比例，從而控制昆蟲的生長(zhǎng)和發(fā)育，達(dá)到控制蟲害的目的。
(3)基因芯片的制作可將Hass-FABP基因的克隆用于煙夜蛾基因芯片制作，應(yīng)用與煙夜蛾及其他鱗翅目昆蟲等研究中。根據(jù)Hass-FABP基因cDNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，在含本基因的克隆中擴(kuò)增Hass-FABP基因的全長(zhǎng)cDNA，或擴(kuò)增編碼細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的基因特異性強(qiáng)的區(qū)段，進(jìn)行基因芯片的制作。
(4)煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因在合成新的脂肪酸結(jié)合蛋白基因中的應(yīng)用目前，昆蟲類的脂肪酸結(jié)合蛋白基因研究比較少，需要利用其他昆蟲的基因序列設(shè)計(jì)并合成引物。
(5)獲得抗煙夜蛾及鱗翅目害蟲轉(zhuǎn)基因植物利用基因工程技術(shù)，可以外導(dǎo)外源基因在植物表達(dá)的載體，將由干擾正常表達(dá)的基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得抗蟲的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。
四.


圖1不同來源的FABP基因氨基酸序列比對(duì)。
使用Clustal W和Genedoc軟件對(duì)煙夜蛾FABP氨基酸與其它哺乳動(dòng)物及昆蟲FABP的氨基酸進(jìn)行多重聯(lián)配，結(jié)果表明，煙夜蛾的FABP延伸蛋白與鱗翅目近緣種美洲棉鈴蟲FABP的同源性高達(dá)96％，與煙草天蛾和家蠶的同源性分別達(dá)到了42％和40％。與雙翅目的果蠅、哺乳動(dòng)物馬和牛的FABP同源性為32％，與人的FABP同源性為27％。
圖中英文含義H.assulta煙夜蛾H.zea美洲棉鈴蟲M.Sexta煙草天蛾B.mori家蠶E.caballus馬B.Taurus牛H.sapiens人D.melanogaster果蠅。圖中黑色代表100％同源性；灰色代表80％同源性。
圖2其他物種的FABP基因的進(jìn)化關(guān)系。
進(jìn)化樹分析更清晰的表明了Hass-FABP基因在進(jìn)化過程中與其他昆蟲與動(dòng)物的親緣關(guān)系，進(jìn)化樹所需要的序列全部來自于NCBI中GenBank的基因數(shù)據(jù)庫(kù)。
五.
具體實(shí)施例方式實(shí)施例煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因的克隆過程1.實(shí)施例所用材料(1)供試?yán)ハx煙夜蛾由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲實(shí)驗(yàn)室用人工飼料單管飼養(yǎng)獲得。
(2)菌種及質(zhì)粒pGEM-T Easy vector購(gòu)自TaKaRa公司，大腸桿菌JM109均為本實(shí)驗(yàn)室保存。
(3)主要試劑及工具酶總RNA抽提試劑RNAiso Reagent、用于RT-PCR的One Step RNA PCR Kit、質(zhì)粒小樣快速抽提試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoR I，均購(gòu)自TaKaRa公司，X-gal、IPTG試劑由Sangon公司生產(chǎn)，其它均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?br> 2.實(shí)施例所采用的方法(1)總RNA提取選用5齡煙夜蛾幼蟲，取50mg脂肪體和血淋巴，在去除RNA酶的離心管中進(jìn)行研磨，使用TaKaRa公司的RNAiso Reagent試劑，按照說明書進(jìn)行總RNA的提取。
(2)引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中已登錄的美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea)脂肪酸結(jié)合蛋白基因核苷酸序列(GenBank登錄號(hào)為AF074436)設(shè)計(jì)并合成引物序列如下正向引物5’-GGATCCATGGCATTCTTTGGCAAG-3’反向引物5’-CTCGAGTTAGGCCTTGTAGTATCTG-3’以上引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
(3)RT-PCR.以上述提取的總RNA為模板，按照One Step RNA PCR Kit說明書進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃變性2min；接著進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件為94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增完畢后，用1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定、純化，并回收目的片段。
(4)PCR產(chǎn)物的克隆和鑒定按使用說明將回收的PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-TEasy vector，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取一白色菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒(質(zhì)粒提取使用TaKaRa公司質(zhì)粒小樣快速抽提試劑盒)，用HindIII和EcoR I雙酶切方法，鑒定重組克隆pGEM/Hass-FABP。
(5)序列測(cè)定和分析DNA的序列測(cè)定在TaKaRa公司進(jìn)行。
序列測(cè)定和結(jié)果分析表明，煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因開放式閱讀框架全長(zhǎng)399bp，編碼為132個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)分子量為15.0KDa，等電點(diǎn)為5.83(http//www.expasy.ch/)。該基因已在GenBank中登記，登錄號(hào)為DQ299942。
序列表<110>河南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因及其應(yīng)用<160>2<210>1<211>399<212>DNA<213>煙夜蛾(Helicoverpa assulta)<400>1atggcattct ttggcaagga atacaagttt gagaagcagg agaactttga ggatttcgtc 60aatgctttgg gcctcactcc cgagcagact caaggctacc tcgcctacac accgaccctc 120aagttcacgc aagatggtga ctcgtacacc gtgatcacca tcacgcccaa gactaaaagt 180gaagtcacct tcaagtctgg agtcgagttc gatgataaca atgctaaccg acactgcaag 240accacgtaca ccgttgccgg cgacaccatc acccaggtgc agaagtacga tgacggcaac 300agcctgacca tcaccaggaa gttctctggc aacgagatgg ttgtgactct ggcaaccagc 360aaatgggacg gagttgctcg cagatactac aaggcctaa399<210>2<211>132<212>PRT<213>煙夜蛾(Helicoverpa assulta)<400>2Met Ala Phe Phe Gly Lys Glu Tyr Lys Phe Glu Lys Gln Glu Asn15 10 15Phe Glu Asp Phe Val Asn Ala Leu Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr20 25 30Gln Gly Tyr Leu Ala Tyr Thr Pro Thr Leu Lys Phe Thr Gln Asp35 40 45Gly Asp Ser Tyr Thr Val Ile Thr Ile Thr Pro Lys Thr Lys Ser
50 55 60Glu Val Thr Phe Lys Ser Gly Val Glu Phe Asp Asp Asn Asn Ala65 70 75Asn Arg His Cys Lys Thr Thr Tyr Thr Val Ala Gly Asp Thr Ile80 85 90Thr Gln Val Gln Lys Tyr Asp Asp Gly Asn Ser Leu Thr Ile Thr95 100 105Arg Lys Phe Ser Gly Asn Glu Met Val Val Thr Leu Ala Thr Ser110 115 120Lys Trp Asp Gly Val Ala Arg Arg Tyr Tyr Lys Ala125 130 13權(quán)利要求
1.一種煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因，其特征是煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因全長(zhǎng)cDNA序列，具有如下所示的399bp的核苷酸序列1 atggcattct ttggcaagga atacaagttt gagaagcagg agaactttga ggatttcgtc61 aatgctttgg gcctcactcc cgagcagact caaggctacc tcgcctacac accgaccctc121 aagttcacgc aagatggtga ctcgtacacc gtgatcacca tcacgcccaa gactaaaagt181 gaagtcacct tcaagtctgg agtcgagttc gatgataaca atgctaaccg acactgcaag241 accacgtaca ccgttgccgg cgacaccatc acccaggtgc agaagtacga tgacggcaac301 agcctgacca tcaccaggaa gttctctggc aacgagatgg ttgtgactct ggcaaccagc361 aaatgggacg gagttgctcg cagatactac aaggcctaa。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因，其特征是煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因編碼的蛋白，編碼長(zhǎng)為132個(gè)氨基酸殘基，該蛋白的氨基酸序列為1 M A F F G K E Y K F E K Q E N F E D F V21 N A L G L T P E Q T Q G Y L A Y T P T L41 K F T Q D G D S Y T V I T I T P K T K S61 E V T F K S G V E F D D N N A N R H C K81 T T Y T V A G D T I T Q V Q K Y D D G N101 S L T I T R K F S G N E M V V T L A T S121 K W D G V A R R Y Y K A *。
3.含有權(quán)利要求1所述的煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因的核苷酸序列的克隆方法，其特征在于為獲得煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成的引物序列如下正向引物5’-GGATCCATGGCATTCTTTGGCAAG-3’反向引物5’-CTCGAGTTAGGCCTTGTAGTATCTG-3’。
4.權(quán)利要求1所述的煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因在對(duì)煙夜蛾及其他鱗翅目害蟲防治中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因在煙夜蛾基因芯片中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因在合成新的脂肪酸結(jié)合蛋白基因中的應(yīng)用。
7.利用權(quán)利要求1所述的煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因在獲得抗煙夜蛾及其他鱗翅目害蟲轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及昆蟲基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因及其應(yīng)用。煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因全長(zhǎng)cDNA為399bp，蛋白質(zhì)編碼為長(zhǎng)132個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)分子量15.0kDa。煙夜蛾脂肪酸結(jié)合蛋白基因的發(fā)現(xiàn)，不僅對(duì)煙夜蛾及其他鱗翅目害蟲的防治具有重要意義，而且對(duì)其他昆蟲乃至動(dòng)物的脂肪酸結(jié)合蛋白的研究也具有重要意義。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1876816SQ200610017859
公開日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月30日
發(fā)明者尹新明, 張濤, 安世恒 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)